CN110484616A - 一种影响人扩张型心肌病诊治的ttn 44610-2a>c变异及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子遗传领域，特别涉及一种影响人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预的碱基位点变异及其应用。所述影响人类扩张型心肌病辅助诊断及预后的碱基位点变异的突变位点对应于人类TTN基因编码区第44610‑2位核苷酸位点A>C，命名为c.44610‑2A>C。本发明还提供了一种用于鉴定上述碱基位点变异的引物，公开了鉴定前述碱基位点变异在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的用途，以及鉴定该碱基位点变异用于人类扩张型心肌病产前诊断的方法。本发明的优点在于为防治扩张型心肌病提供了新的治疗靶点，为扩张型心肌病的早期诊断及预后判断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广前景。

Description

一种影响人扩张型心肌病诊治的TTN 44610-2A>C变异及其 应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别涉及一种影响人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预的剪接位点变异及其应用。

背景技术

心肌病是一组以心肌直接受累为主要特征的疾病，这类疾病不是由心包疾病、高血压、先天性心脏病以及瓣膜病引起，但是这组疾病本身有许多固有的特征，包括临床表现和血流动力学异常。随着诊疗技术水平的不断提高，人们对疾病的认识也更加深刻，诊断手段也越来越丰富，目前已经充分认识到心肌病是致病和致死的重要心脏疾病之一。自从1990年发现心肌病的第一个致病基因以来，对疑似遗传性心肌病的基因检测经历了从基础研究到临床应用的发展过程，对其发病机制的认识发展到基因水平，大大促进了心肌病在微管领域的认识，目前心肌病的基因检测在临床上已经应用于辅助诊断。

基因编码的结缔组织蛋白是一种在心肌和骨骼肌中表达的巨大肌肉蛋白，该蛋白跨越肌节的一般从Z线到M线，该蛋白在肌肉组装、Z线的力传递和I带区域静息张力的维持中起着关键作用。该基因的致病性变异可导致扩张型心肌病、家族性心肌肥厚和胫骨肌营养不良，遗传模式为常染色体显性遗传（AD）；还可导致肢带肌营养不良、早期呼吸肌受累的近端肌病和Salih肌病，遗传模式为常染色体隐性遗传（AR）。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异。

本发明的另一目的在于提供上述导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种用于鉴定上述导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异的引物。

本发明的第四个目的在于提供一种评估人类扩张型心肌病发病风险的方法。

本发明的第五个目的在于提供一种人类扩张型心肌病产前诊断的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异，其突变位点对应于人类TTN基因编码区第44610-2位编码碱基由A突变为C，即TTN mutation：c.44610-2A>C ( NM_001256850)；所属的人类剪接位点变异的突变位点为SEQ IDNO.1所示，其中序列中的M是突变碱基，导致扩张型心肌病的发生；

所述的导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用；

所述的人类扩张型心肌病辅助诊断为利用上述剪接位点变异鉴定人类扩张型心肌病；

所述的人类扩张型心肌病辅助诊断还包括利用上述剪接位点变异评估、干预人类扩张型心肌病发病风险；

所述的临床干预为利用上述剪接位点变异实行临床干预；

所述的人类为亚洲人群；

一种用于鉴定上述影响人类扩张型心肌病发病风险的剪接位点变异的引物，包含上游引物PCR-F和下游引物PCR-R；

上游引物PCR-F为：5′- GGCAGCCCAATCACAGGATA-3′(SEQ ID NO.2)；

下游引物PCR-R为：5′- ACAGTTGGTTTTCCAGGGGG-3′(SEQ ID NO.3)。

所述的用于鉴定上述导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异的引物在扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用；

所述的人类为亚洲人群；

一种评估人类扩张型心肌病发病风险的方法，包含如下步骤：

检测人TTN基因上述剪接位点变异的单核苷酸是A还是C；

所述的人类为亚洲人群；

一种人类扩张型心肌病的产前诊断的方法，包含如下步骤：

确定受检者夫妻双方的上述剪接位点变异，并根据剪接位点变异做出相应的措施：

如受检者夫妻中一方上述剪接位点变异为杂合突变，提示受检者子女出现扩张型心肌病风险高，应积极采取预防措施；如受检者夫妻双方上述剪接位点变异为无突变，提示受检者子女出现扩张型心肌病风险降低，可仅进行常规检查；

所述的人类为亚洲人群；

本发明的测定方法测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(如血液)、组织细胞(如皮肤组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。本发明公开了TTN基因编码区第44610-2位碱基由A到C的变异，且TTN基因的序列已知，用现有检测核苷酸变异的方法均可以检测上述位点的多态性。

本发明通过检测TTN基因编码区第44610-2位A→C变异来辅助扩张型心肌病的筛查，具有可靠的特异性。本发明在正常人中未能检测到所述突变，而在所检测的扩张型心肌病家系的确诊患病成员中，都检测出所述突变，检测结果具有可重复性。应用前景良好。

本发明通过检测夫妻双方上述剪接位点变异，能够预测子代获得扩张型心肌病的风险，有助于产前诊断，及早作出确诊，防止扩张型心肌病蔓延。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

附图说明

图1是本发明所述突变位点测序图，箭头所示为突变位点。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 突变位点的疾病相关性

1.DNA提取及全外显子测序

取全血样本200微升，采用萃取方法提取全基因组DNA，使用Nanodrop2000对DNA行质量检测和浓度测定。A260/280比值在1.8～2.0，A260/230壁纸在1.7～1.9判定为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释至100纳克/微升。对合格的DNA样品进行高通量测序获取相关基因突变信息。

2. ACMG遗传变异分类分析：

受检人样品中检测到TTN基因的杂合变异c.44610-2A>C（编码区第44610-2位核苷酸A变为C），该变异是经典的剪切位点-2位突变，预测该变异会破坏RNA的剪接，导致无意义蛋白产物或介导mRNA的降解，该变异基因其他的剪切位点变异导致的心肌病已有报道，为已知致病机理的变异（PVS1）；该变异在已知参考数据库中未见报道，不属于多态性变化（PM2）。

3.结果判定：

根据ACMG指南判定该变异为可能致病性变异。

实施例2 突变位点的检测方法

1.含有与人扩张型心肌病发病显著相关基因剪接位点变异位点的目的片段的扩增。

目的片段为TTN基因第215外显子上一段807bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：

上游引物PCR-F为：5′- GGCAGCCCAATCACAGGATA-3′(SEQ ID NO.2)

下游引物PCR-R为：5′- ACAGTTGGTTTTCCAGGGGG-3′(SEQ ID NO.3)

浓度：100μmol/L

2)体系配制：

3)反应程序：

3.DNA序列测序鉴定：序列测序在3730xlDNAAnalyzer（ABI公司）上进行。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应单核苷酸位点的基因型。测序结果如下所示：

GGCAGCCCAATCACAGGATActgggttgaaagactggatcctgatacagataaatgggttagatgcaataagatgccagtaaaggacacaacatacaggtatgctcagaatccccatcaagatgttaagacagcagtatattcaaatgtttactctttagtattccttgggattacagatgattatatattactaaaaaaattttaaactacttttactcatattttctattacctcataatttgaaaaattatataaattccattcaagggcacatttcttagtttactctaaaatattaaccttcaggaagtttcaaagtgtttgatcccccagtatattatgataatgaccactgtcatagatattataattagattggtatgtttggcccagtctaaagtgtgtggcagttaaaaagcaatttttaatttatattgaagtgcttttcagttaaatttccaaatcaccttttcacaatttaaataaattagtctcttctgtgtaaaataaacataggcttcttctgcttcttaccatgatgatacacatgcactttgttcctaattcM(a\c)gagtgaaaggtctcactaataagaaaaaatacagattccgtgtgttggctgaaaatcttgctggacctggaaaaccaagcaaatcaactgaaccaatcttaataaaggatcccataggtattatttatataatttttgtggttatttcgaagttcatatgaactcctttttgacaaacctaaacaatgatttcattggcttgcagatcctccatggCCCCCTGGAAAACCAACTGT（SEQ ID NO.1）

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示（括号中为突变碱基、为等位基因突变），在该序列的首尾加粗显示为引物序列。

综上，本发明将TTN基因c.44610-2A>C位点的变异，应用于扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中，具有良好的应用前景。

序列表

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种影响人扩张型心肌病诊治的TTN 44610-2A>C变异及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 人(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ggcagcccaa tcacaggata ctgggttgaa agactggatc ctgatacaga taaatgggtt 60

agatgcaata agatgccagt aaaggacaca acatacaggt atgctcagaa tccccatcaa 120

gatgttaaga cagcagtata ttcaaatgtt tactctttag tattccttgg gattacagat 180

gattatatat tactaaaaaa attttaaact acttttactc atattttcta ttacctcata 240

atttgaaaaa ttatataaat tccattcaag ggcacatttc ttagtttact ctaaaatatt 300

aaccttcagg aagtttcaaa gtgtttgatc ccccagtata ttatgataat gaccactgtc 360

atagatatta taattagatt ggtatgtttg gcccagtcta aagtgtgtgg cagttaaaaa 420

gcaattttta atttatattg aagtgctttt cagttaaatt tccaaatcac cttttcacaa 480

tttaaataaa ttagtctctt ctgtgtaaaa taaacatagg cttcttctgc ttcttaccat 540

gatgatacac atgcactttg ttcctaattc agagtgaaag gtctcactaa taagaaaaaa 600

tacagattcc gtgtgttggc tgaaaatctt gctggacctg gaaaaccaag caaatcaact 660

gaaccaatct taataaagga tcccataggt attatttata taatttttgt ggttatttcg 720

aagttcatat gaactccttt ttgacaaacc taaacaatga tttcattggc ttgcagatcc 780

tccatggccc cctggaaaac caactgt 807

Claims (10)

1.一种导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异，其特征在于其突变位点对应于人类TTN基因区第44610-2位编码碱基由A突变为C，即TTN mutation：c.44610-2A>C ( NM_001256850)。

2.权利要求1所述的导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用。

3.根据权利要求2所述的导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用，其特征在于：所述的人类扩张型心肌病研究为利用权利要求1所述的剪接位点变异鉴定人类扩张型心肌病。

4.根据权利要求3所示的导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用，其特征在于：所述的人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预还包括利用上述剪接位点变异评估、干预人类扩张型心肌病。

5.根据权利要求2所述的导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用，其特征在于：所述的人类为亚洲人群。

6.一种用于鉴定权利要求1所述的导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异的引物，其特征在于包含上游引物PCR-F和下游引物PCR-R；

上游引物PCR-F为：5′- GGCAGCCCAATCACAGGATA-3′(SEQ ID NO.2)；

下游引物PCR-R为：5′- ACAGTTGGTTTTCCAGGGGG-3′(SEQ ID NO.3)。

7.权利要求6所述的用于鉴定导致人类扩张型心肌病的剪接位点变异的引物在扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用。

8.一种检测人类扩张型心肌病的方法，其特征在于包含如下步骤：检测权利要求1所述的人类TTN基因剪接位点变异的单核苷酸是A还是C。

9.一种人类扩张型心肌病的产前诊断的方法，其特征在于包含如下步骤：确定受检者夫妻双方的权利要求1所述的剪接位点变异，并根据剪接位点变异做出相应的措施：如受检者夫妻中一方上述剪接位点变异为杂合突变，提示受检者子女出现扩张型心肌病风险高，应积极采取预防措施；如受检者夫妻双方上剪接位点变异为无突变，即夫妻双方上述剪接位点变异均为正常，提示受检者子女出现扩张型心肌病风险降低，可仅进行常规检查。

10.根据权利要求9中所述的人类扩张型心肌病的产前诊断的方法，其特征在于：所述的人类为亚洲人群。