CN110483706B - 一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明目的在于提供一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针的制备方法，及用于环境中Hg2+离子和半胱氨酸(Cys)双功能检测的应用。步骤为：先制备得到HBMA单体，然后与聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂、N‑异丙基丙烯酰胺反应，合成了分布宽度指数窄、分子量可控、合适的低临界相转变温度的温敏嵌段聚合物，最后与荧光基团标记的核酸适配体(P1)结合形成荧光探针。本发明涉及的基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物荧光探针在特异性检测Hg2+离子后可与半胱氨酸(Cys)特异性结合达到双功能检测的目的。具有良好的选择性及灵敏性、便于操作、检测条件温和、聚合物易于回收利用等特点。

Description

一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针 的制备方法及应用
技术领域
本发明属于荧光探针及其制备方法技术领域，涉及以寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物作为荧光探针在对环境中Hg2+离子和半胱氨酸(Cys)双功能检测的应用。
背景技术
汞是高毒的全球性环境污染物，尤其是其具有高迁移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物链放大性的特点，即便是极微量的存在于环境中，对人类及动植物的健康也是极大的威胁。研究证实，即使体内汞含量较低，也会对产前脑、肺、心脏、肾脏、中枢神经和免疫系统造成严重损害。因此，痕量汞的检测变得至关重要。
L-半胱氨酸(Cys)是一种含巯基(-SH)的氨基酸，属于人体必需氨基酸之一，如果人体内缺乏Cys，将会导致发育缓慢、头发褪色、水肿、嗜睡、肝损伤等疾病，所以对Cys进行准确高效的定量检测，在生化研究和疾病诊断中均有着重要的意义。传统的仪器检测技术需要昂贵的检测设备、专业的操作人员、复杂的样品处理，以及测试时间长等不足；而荧光分析法具有操作简单、检测成本低、测试时间短、无需样品处理等优点。因此，各种荧光探针被开发用于检测环境中Hg2+离子和半胱氨酸的检测。
然而，目前相关荧光检测技术所利用现有的基于有机小分子荧光化学传感器通常水溶性不佳、检测灵敏度偏低、可回收性差和响应单一等缺点限制了其在生物系统中的潜在应用。针对这一类问题，将双亲性温敏聚合物作为荧光探针的载体，并将荧光基团标记的核酸适配体引入到双亲性温敏聚合物的温敏嵌段中，以提高探针的水溶性、灵敏度。同时，利用核酸适配体特异地、可逆性识别目标物的性能实现探针的回收利用。
发明内容
本发明采用了水溶性较好的聚乙二醇单甲醚和温敏单体N-异丙基丙烯酰胺，利用RAFT聚合合成了分布宽度指数窄、分子量可控、合适的低临界相转变温度的双亲性的温敏嵌段聚合物，实现该荧光化学传感器良好的水溶性和可回收性。同时，通过在聚合物上接枝荧光基团(FAM)标记的核酸适配体，实现对Hg2+离子荧光淬灭响应的检测。随后利用半胱氨酸对于Hg2+离子更强结合能力，实现荧光化学传感器对Hg2+和半胱氨酸的顺序性检测。进一步利用该温敏响应性荧光化学传感器的自组装体对荧光报告基元的信号放大，提高检测的灵敏度和检测限，并实现该荧光化学传感器的循环利用。
本发明目的在于提供一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物作为荧光探针的应用，针对于环境中Hg2+离子和半胱氨酸双功能荧光探针的应用。
一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针，其化学结构式为：
Figure BDA0002126255090000021
一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备HBMA单体：
将4-羟基苯甲醛和三乙胺溶于无水CH2Cl2中，在0℃冰水浴中，逐滴滴加甲基丙烯酰氯，混合物在搅拌中过夜，然后用碳酸氢钠溶液对反应液进行多次洗涤，随后，有机层用无水硫酸钠干燥，在减压条件下，蒸发有机溶剂得到粗产品，在乙醇溶液中，重结晶制得白色固体，即HBMA单体；
(2)制备苄基三硫代碳酸酯(BTPA)：
将3-巯基丙酸滴加到氢氧化钾的水溶液中，在搅拌下滴加二硫化碳室温反应5小时后，将溴化苄加入到反应溶液中，然后将混合物加热到80℃过夜，冷却至室温后，将上述溶液倒入氯仿中，用盐酸调节pH值至2.0，随后，用过量的去离子水洗混合物，得到有机层，用无水硫酸钠干燥有机层后，减压蒸发溶剂，得到粗产物，最后，从二氯甲烷中重结晶分离出黄色粉末。
(3)PEG大分子链转移剂的制备
A、将PEG113-OH溶解在无水甲苯中，在减压条件下共沸蒸馏以除去大部分溶剂，得溶液A；然后将无水二氯甲烷倒入干燥的BTPA中溶解，得溶液B；将溶液B和溶液A混合后，得溶液C，放置于零度的冰水浴中；
B、将4-二甲氨基吡啶DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺DCC溶解于二氯甲烷中，得溶液D,将溶液D滴加到上述溶液C中；在室温下反应48小时后，过滤溶液，将所得滤液浓缩，并用过量的冷乙醚沉淀，将获得的沉淀物溶解在无水CH2Cl2中，蒸发浓缩后，沉淀到冷乙醚中，重复上述步骤，收集淡黄色的固体，即聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂，即PEG大分子链转移剂。
(4)温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的制备，简称TBC；
将步骤(3)制备的PEG大分子链转移剂，N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于1,4-二氧六环，再加入步骤(1)制备的HBMA单体，混合液经过三次“冷冻-抽气-融化”循环后在真空下密封，在温度为75℃的油浴中反应24h后，该聚合反应在液氮中淬灭，打开封管，用1,4-二氧六环稀释溶解，混合物在过量的乙醚中沉淀，取出沉淀物，重复上述稀释溶解-沉淀循环，得到浅黄色的粉末状固体，温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m，简称TBC。
(5)配制温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m溶液
将步骤(4)制备的温敏嵌段聚合物溶解于Tris-HCl的缓冲溶液中，得到温敏嵌段聚合物溶液；
(6)温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的制备，简称TBC-P1；
将荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液与步骤(5)制得的温敏嵌段聚合物溶液混合，并于室温下恒温振荡，反应结束后，置于恒温水浴锅中升温直到沉淀，然后离心去除未固定的寡核苷酸序列，将得到的沉淀分散于Tris-HCl缓冲溶液中，混合均匀后室温下保存，制备得到基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1储备液。
步骤(1)中，所述4-羟基苯甲醛、三乙胺、无水CH2Cl2、甲基丙烯酰氯的用量比为16mmol：16mmol：30mL：19.2mmol。
步骤(2)中，3-巯基丙酸、氢氧化钾的水溶液、二硫化碳、溴化苄的用量比例为23mmol：32mL：59mmol：35mmol，其中，氢氧化钾的水溶液的浓度为1.95mol/L。
步骤(3)的步骤A中，PEG113-OH、无水甲苯、无水二氯甲烷、BTPA的用量比为1.0mmol，30mL，50mL，3.0mmol。
步骤(3)的步骤B中，4-二甲氨基吡啶DMAP,N,N-二环己基碳二亚胺DCC的用量比为0.4mmol和5.0mmol。
步骤(4)中，PEG大分子链转移剂、N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、1,4-二氧六环、HBMA单体的用量比例为0.08mmol：8mmol：36μmol：4mL：0.05mmol。
步骤(5)中，所述Tris-HCl的缓冲溶液的浓度为10mM，pH7.4；所述温敏嵌段聚合物溶液的浓度为1.0g/L。
步骤(6)中，荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液的浓度为5μM，温敏嵌段聚合物溶液的浓度为1.0g/L；荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液与温敏嵌段聚合物溶液的体积比为1：5。
步骤(6)中，所述于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1储备液的浓度为1mM。
步骤(6)中，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM。
将本发明制备的基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针，与Hg2+结合致使荧光发生淬灭，用于检测Hg2+；随后，基于半胱氨酸(Cys)和Hg2+更强的结合能力，达到荧光恢复检测半胱氨酸的用途。
本发明的有益效果为：
本发明针对Hg2+离子和半胱氨酸灵敏识别、选择性好、检测限低，用于环境中的Hg2 +离子和半胱氨酸的双功能检测。
附图说明
图1：(a)为实施例1所制备的HBMA单体的合成过程示意图，(b)实施例1所制备的温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的合成过程示意图，(c)为实施例1所制备的PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的合成过程示意图。
图2：实施例1所制备的聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的合成示意图。
图3：(a)实施例1所制备的HBMA的红外光谱图，(b)实施例1所制备的温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的红外光谱图，(c)实施例1温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的红外光谱图。
图4：(a)实施例1所制备的HBMA的1H NMR图，(b)实施例1所制备的温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的1H NMR图，其中溶剂为CDCl3。
图5：(a)实施例1所制备的PEG大分子链转移剂的渗透凝胶色谱，(b)实施例1所制备的温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的渗透凝胶色谱，(c)实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的渗透凝胶色谱。流动相为THF。
图6为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的透射电子显微镜图。
图7为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1在25℃(a)和40℃(b)的动态激光光散射图。
图8为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的浓度与浊点关系测试图。
图9为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的核酸适配体性能测试图。
图10为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1对Hg2+离子的选择性测试图。
图11为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1+Hg2+体系对半胱氨酸(Cys)的选择性测试图。
图12为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P125℃(a)和40℃(b)时的Hg2+离子滴定图。
图13为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1+Hg2+体系25℃(a)和40℃(b)时的半胱氨酸(Cys)滴定图。
图14为实施例1所制备的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的可靠性与假阳性实验。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)HBMA单体的制备
4-羟基苯甲醛(1.96g，16mmol)和三乙胺(1.62g，16mmol)溶于无水CH2Cl2(30mL)中。在0℃冰水浴中，逐滴滴加甲基丙烯酰氯(2g，19.2mmol)，混合物在搅拌中过夜。然后用碳酸氢钠溶液对反应液进行多次洗涤。随后，有机层用无水硫酸钠干燥。在减压条件下，蒸发有机溶剂得到粗产品。在乙醇溶液中，重结晶制得白色固体(HBMA单体)。
(2)苄基三硫代碳酸酯(BTPA)的制备
3-巯基丙酸(2.5mL,23mmol)滴加到氢氧化钾的水溶液(1.95mol/L,32mL)中，在搅拌下滴加二硫化碳(4.5g,59mmol)。室温反应5小时后，将溴化苄(6g,35mmol)加入到反应溶液中，然后将混合物加热过夜。冷却至室温后，将上述溶液倒入氯仿中，用盐酸调节pH值。随后，用过量的去离子水洗濯混合物，得到有机层。用无水硫酸钠干燥有机层后，减压蒸发溶剂，得到粗产物。最后，从二氯甲烷中重结晶分离出黄色粉末。
(3)PEG大分子链转移剂的制备
PEG113-OH(5g,1.0mmol)溶解在30mL的无水甲苯中，在减压条件下共沸蒸馏以除去大部分溶剂，得溶液A。然后将无水二氯甲烷(50mL)倒入干燥的BTPA(0.8g,3.0mmol)中溶解，得溶液B；将溶液B和溶液A混合后，得溶液C，放置于零度的冰水浴中。
将4-二甲氨基吡啶(DMAP,50mg,0.4mmol)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC,1g,5.0mmol)溶解于二氯甲烷中，得溶液D,将溶液D滴加到上述溶液C中；在室温下反应48小时后，过滤溶液，将所得滤液浓缩，并用过量的冷乙醚沉淀，将获得的沉淀物溶解在无水CH2Cl2中，蒸发浓缩后，沉淀到冷乙醚中，重复上述步骤三次，收集淡黄色的固体，即聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂，即PEG大分子链转移剂。
(4)温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的制备
将步骤(3)制备的PEG大分子链转移剂(0.42g,0.08mmol)，N-异丙基丙烯酰胺(0.91g,8mmol)和偶氮二异丁腈(6mg,36μmol)溶于1,4-二氧六环(4mL)，再加入HBMA单体(10mg,0.05mmol)，混合液经过三次“冷冻-抽气-融化”循环后在真空下密封，在温度为75℃的油浴中反应24h后，该聚合反应在液氮中淬灭，打开封管，用1,4-二氧六环稀释溶解，混合物在过量的乙醚中沉淀，取出沉淀物，重复上述稀释溶解-沉淀循环三次，得到浅黄色的粉末状固体，温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m，简称TBC。
(5)聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m溶液
称取5mg的聚合物溶解于5mL的10mM Tris-HCl的缓冲溶液(pH7.4)中得到1.0g/L的溶液。
(6)温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的制备
将100μL的荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液(5μM)与500μL的聚合物溶液(1.0g/L)混合，并于室温下恒温振荡。反应结束后，置于恒温水浴锅中升温直到沉淀，然后离心去除未固定的寡核苷酸序列。将得到的沉淀分散于10mM Tris-HCl缓冲溶液中，混合均匀后室温下保存，制备得到基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1储备液，浓度为1mM。
实施例1所述的HBMA单体、温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m和温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的基本数据：
如图3所示：为实施例1所述的HBMA单体、温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m和温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的红外数据：HBMA：FTIR(KBr,cm-1):3382,2834,2738,1741,1699,1596,1308,1210,1121,950,867,816,643,509cm-1；PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m：FTIR(KBr,cm-1):3306,2971,2880,1651,1541,1459,1110,954,843,660cm-1；PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1：FTIR(KBr,cm-1):3300,2972,2927,1650,1547,1459,1095,1050,949,881,641。
如图4所示：为实施例1所述的HBMA单体、温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的1H NMR数据：
HBMA：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)：10.01(t,1H,Ar-CHO),8.01(t,2H,ArH),7.42(dd,2H,ArH),6.33(s,1H,CH＝C),5.96(s,1H,CH＝C),1.69(d,J＝9.4Hz,3H,-CH3)。PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)：4.01(90H,-C＝O-NH-),3.66(452H,-CH2-CH2-O-)。
如图5所示：为实施例1所述的PEG大分子链转移剂、温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m和温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的GPC数据：
PEG大分子链转移剂：Mn＝6.1KDa,Mw/Mn＝1.06；PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m：Mn＝15.5KDa,Mw/Mn＝1.21；PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1：Mn＝16.0KDa,Mw/Mn＝1.23。
实施例2：
温敏嵌段聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1温敏性能的研究
(1)研究温度对聚合物组装体形貌的影响，结果如图6所示。在图6(a)中，PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的水溶液在25℃时以单链溶解的状态存在；而在图6(b)中，当温度达到40℃时，聚合物会自组装形成以P(NIPAM-co-HBMA)-P1为核、PEG为壳的球形胶束。
(2)通过动态激光光散射(DLS)来探究聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的温度诱导行为。动态激光光散射如图7所示，动态激光光散射如图所示，PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的水溶液在25℃时，其粒径为10.1nm，粒径的多分散系数0.289。而在40℃时自组装得到聚集体，其粒径增大为140.8nm，粒径的多分散系数0.052。
实施例3：
温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1浊点的分析研究
将探针溶液配制成浓度为0.002g/mL、0.005g/mL、0.008g/mL、0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.06g/mL、0.07g/mL、0.08g/mL、0.09g/mL、0.10g/mL的溶液。如图8所示，测定了不同浓度的温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的浊点。从图中可以得出，浊点会随着温敏聚合物荧光探针溶液浓度的增加而降低。当温敏聚合物荧光探针的浓度增加到0.10g/mL时，浊点不再降低。因此，温敏聚合物荧光探针溶液的最低临界点温度(LCST)为27.6℃，即当温度高于27.6℃时，PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1会逐渐从水溶液中沉淀出来而能实现温度响应型荧光传感器的回收。
实施例4：
温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1(TBC-P1)的核酸适配体性能测试
温敏聚合物荧光探针TBC-P1中核酸适配体性能测试如图9所示。取两份等量的核酸适配体溶液(P1)于到比色皿中，向其中的一份核酸适配体溶液(P1)中加入Hg2+离子溶液，另一份溶液不做处理作为空白实验，并测量其荧光强度。结果表明：加入Hg2+离子的P1溶液荧光强度明显发生降低。随后，取两份等量探针溶液(TBC-P1)于比色皿中，向其中的一份探针溶液(TBC-P1)中加入适量的Hg2+离子溶液，另一份溶液不做处理作为空白实验，并测量其荧光强度。结果表明：加入Hg2+离子的探针溶液荧光强度明显发生降低。进一步测试核酸适配体的性能，向探针溶液体系(TBC-P1+Hg2+)中加入适量的半胱氨酸(Cys)，并测量其荧光强度。结果表明：Cys的加入使得探针溶液体系的荧光强度发生明显的恢复。
实施例5：
温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1对Hg2+离子检测的选择性
(1)金属离子溶液的制备：所述金属离子溶液都是由其金属盐配制得到，避光保存。
(2)为进一步探究探针溶液对Hg2+离子检测的选择性，测定了各种金属阳离子加入的探针溶液的荧光强度。先取等量的荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1溶液于比色皿中，然后加入等量的不同金属阳离子(Zn2+，Al3+，Cu2+，Mg2+，Li+，Ni2+，Co2+，Pb2+，Cr3+，Fe3+，Ca2+，Sr2+，Cd2+，Fe2+)溶液，其中一份探针溶液不做处理作为空白实验，测量溶液的荧光强度。如图10所示，只有加入Hg2+的探针溶液的荧光强度明显发生淬灭，而作为空白实验的探针溶液和加入其它金属离子的探针溶液的荧光强度没有发生变化，这表明探针溶液对Hg2+离子具有较强的选择性。
实施例6：
温敏聚合物荧光探针体系PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1+Hg2+对半胱氨酸(Cys)的选择性
为探究探针体系(TBC-P1+Hg2+)对半胱氨酸(Cys)的选择性，在探针体系(TBC-P1+Hg2+)中加入浓度相同的不同种类氨基酸(缬氨酸(Val)，(组氨酸)His，(异亮氨酸)Ile，(甘氨酸)Gly，(精氨酸)Arg，(天冬氨酸)Asp，(脯氨酸)Pro，(苏氨酸)Thr，(苯丙氨酸)Phe，(蛋氨酸)Met，(丝氨酸)Ser，(丙氨酸)Ala，(亮氨酸)Leu，(色氨酸)Trp，(谷氨酸)Glu，(酪氨酸)Tyr，(天冬酰胺)Asn，(谷氨酰胺)Gln，(半胱氨酸)Cys)，并分别测量其荧光强度，其中一份探针体系(TBC-P1+Hg2+)溶液不做处理作为空白实验。如图11所示，只有加入半胱氨酸(Cys)的探针体系发生了明显的荧光恢复，结果表明探针体系(TBC-P1+Hg2+)对半胱氨酸(Cys)具有较强的选择性。
实施例7：
温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1对Hg2+离子的检测限
为探究TBC-P1探针溶液对Hg2+离子的检测限，分别测定了不同温度、不同Hg2+离子浓度条件下的荧光强度。如图12(a)所示，在25℃的条件下，取等量不同浓度的Hg2+离子溶液分别加入到TBC-P1探针溶液中，测量溶液的荧光强度。如图12(b)所示，在40℃的条件下，取等量不同浓度的Hg2+离子溶液分别加入到TBC-P1探针溶液中，测量溶液的荧光强度。
TBC-P1探针溶液本身是具有荧光，Hg2+离子加入后，荧光强度发生减弱。随着Hg2+离子浓度的增加，荧光强度逐渐减弱直至发生荧光淬灭。
实施例8：
温敏聚合物荧光探针体系PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1-Hg2+对半胱氨酸(Cys)的检测限
进一步探究了半胱氨酸(Cys)与Hg2+结合导致TBC-P1探针溶液的荧光恢复，分别测定了不同温度、不同Cys浓度条件下的荧光强度。如图13(a)所示，在25℃的条件下，取等量不同浓度的Cys溶液加入到TBC-P1-Hg2+溶液中，测量溶液的荧光强度。如图13(b)所示，在40℃的条件下，取等量不同浓度的Cys溶液加入到TBC-P1-Hg2+溶液中，测量溶液的荧光强度。
TBC-P1-Hg2+溶液本身是没有荧光的，Cys加入后，溶液的荧光强度发生增强。随着加入的Cys浓度的增加，TBC-P1-Hg2+溶液的荧光强度逐渐发生增强直至荧光恢复。
实施例9：
温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的可靠性和假阳性
为研究温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的可靠性和假阳性，如图14所示，荧光探针TBC-P1作为一种“开关”传感器，在Hg2+离子存在下，荧光强度发生淬灭，由于外部原因或其他环境因素引起的“假阳性”也可能导致荧光减少。为了区分其他因素导致的“假阳性”信号，进行了对照试验。分别取两份适量的FAM和荧光探针TBC-P1溶液于比色皿中，其中一份FAM和荧光探针TBC-P1溶液分别加入等量的Hg2+离子溶液，另一份FAM和荧光探针TBC-P1溶液不做处理作为空白实验，测量溶液的荧光强度。结果发现，只有加入Hg2+离子的TBC-P1荧光探针溶液发生了荧光淬灭，这表明是Hg2+离子的加入使得探针溶液的荧光发生淬灭。
荧光探针TBC-P1-Hg2+溶液作为一种“开关”传感器，在半胱氨酸(Cys)存在下，荧光强度发生恢复，由于外部原因或其他环境因素引起的“假阳性”也可能导致荧光恢复。为了区分其他因素导致的“假阳性”信号，进行了对照试验。取三份等量的TBC-P1-Hg2+溶液于比色皿中，向其中两份溶液中加入等量浓度为5μM、1μM的未用荧光标记的核酸适配体P2，另一份溶液不做处理作为空白实验，测量溶液的荧光强度。测量结果如图14所示，发现加入两种不同浓度的核酸适配体P2的TBC-P1-Hg2+溶液均发生荧光恢复，且P2浓度为5μm的溶液荧光强度比浓度为1μm的溶液荧光强度增强，结果表明P2与TBC-P1探针溶液竞争Hg2+离子，使得荧光强度发生恢复。

Claims (10)

1.一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针，其特征在于，化学结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述荧光探针由如下制备方法制得：
（1）制备HBMA单体，备用；
（2）制备苄基三硫代碳酸酯 BTPA，备用；
（3）PEG大分子链转移剂的制备：
A、将PEG113-OH 溶解在无水甲苯中，在减压条件下共沸蒸馏以除去大部分溶剂，得溶液A；然后将无水二氯甲烷倒入干燥的 BTPA中溶解，得溶液B；将溶液B和溶液A混合后，得溶液C，放置于冰水浴中；
B、将4-二甲氨基吡啶DMAP和 N,N-二环己基碳二亚胺DCC溶解于二氯甲烷中，得溶液D，将溶液D滴加到上述溶液C中；在室温下反应结束后，过滤溶液，将所得滤液浓缩，并用过量的冷乙醚沉淀，将获得的沉淀物溶解在无水CH2Cl2 中，蒸发浓缩后，沉淀到冷乙醚中，重复上述步骤，收集淡黄色的固体，即聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂，即PEG大分子链转移剂；
PEG大分子链转移剂：Mn=6.1KDa, Mw/Mn=1.06；PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m：Mn=15.5KDa, Mw/Mn=1.21；PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1：Mn=16.0 KDa, Mw/Mn =1.23；
（4）温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的制备，简称TBC；
将步骤（3）制备的PEG大分子链转移剂，N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于1,4-二氧六环，再加入步骤（1）制备的HBMA单体，混合液经过三次“冷冻-抽气-融化”循环后在真空下密封，油浴中反应后，该聚合反应在液氮中淬灭，打开封管，用1,4-二氧六环稀释溶解，混合物在过量的乙醚中沉淀，取出沉淀物，重复上述稀释溶解-沉淀循环，得到浅黄色的粉末状固体，温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m，简称TBC；
（5）配制温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m溶液
将步骤（4）制备的温敏嵌段聚合物溶解于Tris-HCl 的缓冲溶液中，得到温敏嵌段聚合物溶液；
（6）温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的制备，简称TBC-P1；
将荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液与步骤（5）制得的温敏嵌段聚合物溶液混合，并于室温下恒温振荡，反应结束后，置于恒温水浴锅中升温直到沉淀，然后离心去除未固定的寡核苷酸序列，将得到的沉淀分散于Tris-HCl缓冲溶液中，混合均匀后室温下保存，制备得到基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co- HBMA)m-P1储备液。
2.如权利要求1所述的一种基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备HBMA单体，备用；
（2）制备苄基三硫代碳酸酯 BTPA，备用；
（3）PEG大分子链转移剂的制备：
A、将PEG113-OH 溶解在无水甲苯中，在减压条件下共沸蒸馏以除去大部分溶剂，得溶液A；然后将无水二氯甲烷倒入干燥的 BTPA中溶解，得溶液B；将溶液B和溶液A混合后，得溶液C，放置于冰水浴中；
B、将4-二甲氨基吡啶DMAP和 N,N-二环己基碳二亚胺DCC溶解于二氯甲烷中，得溶液D，将溶液D滴加到上述溶液C中；在室温下反应结束后，过滤溶液，将所得滤液浓缩，并用过量的冷乙醚沉淀，将获得的沉淀物溶解在无水CH2Cl2 中，蒸发浓缩后，沉淀到冷乙醚中，重复上述步骤，收集淡黄色的固体，即聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂，即PEG大分子链转移剂；
（4）温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m的制备，简称TBC；
将步骤（3）制备的PEG大分子链转移剂，N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于1,4-二氧六环，再加入步骤（1）制备的HBMA单体，混合液经过三次“冷冻-抽气-融化”循环后在真空下密封，油浴中反应后，该聚合反应在液氮中淬灭，打开封管，用1,4-二氧六环稀释溶解，混合物在过量的乙醚中沉淀，取出沉淀物，重复上述稀释溶解-沉淀循环，得到浅黄色的粉末状固体，温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m，简称TBC；
（5）配制温敏嵌段聚合物PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m溶液
将步骤（4）制备的温敏嵌段聚合物溶解于Tris-HCl 的缓冲溶液中，得到温敏嵌段聚合物溶液；
（6）温敏聚合物荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1的制备，简称TBC-P1；
将荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液与步骤（5）制得的温敏嵌段聚合物溶液混合，并于室温下恒温振荡，反应结束后，置于恒温水浴锅中升温直到沉淀，然后离心去除未固定的寡核苷酸序列，将得到的沉淀分散于Tris-HCl缓冲溶液中，混合均匀后室温下保存，制备得到基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co- HBMA)m-P1储备液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述HBMA单体的制备方法为：将4-羟基苯甲醛和三乙胺溶于无水CH2Cl2中，在0℃冰水浴中，逐滴滴加甲基丙烯酰氯，混合物在搅拌中过夜，然后用碳酸氢钠溶液对反应液进行多次洗涤，随后，有机层用无水硫酸钠干燥，在减压条件下，蒸发有机溶剂得到粗产品，在乙醇溶液中，重结晶制得白色固体，即HBMA单体；
其中，所述4-羟基苯甲醛、三乙胺、无水CH2Cl2、甲基丙烯酰氯的用量比为16 mmol：16mmol：30mL：19.2mmol。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述苄基三硫代碳酸酯(BTPA) 的制备方法为 ：将3-巯基丙酸滴加到氢氧化钾的水溶液中，在搅拌下滴加二硫化碳室温反应 5 小时后，将溴化苄加入到反应溶液中，然后将混合物加热到80℃过夜，冷却至室温后，将上述溶液倒入氯仿中，用盐酸调节 pH 值至2.0，随后，用过量的去离子水洗混合物，得到有机层，用无水硫酸钠干燥有机层后，减压蒸发溶剂，得到粗产物，最后，从二氯甲烷中重结晶分离出黄色粉末；
其中，3-巯基丙酸、氢氧化钾的水溶液、二硫化碳、溴化苄的用量比例为23 mmol：32mL：59 mmol：35 mmol，其中，氢氧化钾的水溶液的浓度为1.95 mol/L。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）的步骤A中，PEG113-OH、无水甲苯、无水二氯甲烷、BTPA 的用量比为1.0 mmol，30 mL，50 mL，3.0 mmol；
步骤（3）的步骤B中，4-二甲氨基吡啶 DMAP, N,N-二环己基碳二亚胺DCC的用量比为0.4 mmol和5.0 mmol，室温下反应时间为48h。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，PEG大分子链转移剂、N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、1,4-二氧六环、HBMA单体的用量比例为0.08mmol：8mmol：36μmol：4mL：0.05mmol；油浴中反应的温度为75℃，反应时间为24h。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述Tris-HCl 的缓冲溶液的浓度为10 mM， pH 7.4；所述温敏嵌段聚合物溶液的浓度为1.0 g/L。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液的浓度为5μM，温敏嵌段聚合物溶液的浓度为1.0 g/L；荧光基团标记的寡核苷酸P1贮存液与温敏嵌段聚合物溶液的体积比为1：5；
所述于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针PEG113-b-P(NIPAM-co-HBMA)m-P1储备液的浓度为1mM，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM。
9.将权利要求1所述的基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针用于检测Hg2+离子和半胱氨酸的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，基于寡核苷酸双亲性温敏性嵌段聚合物双功能荧光探针，与Hg2+结合致使荧光发生淬灭，用于检测Hg2+；随后，基于半胱氨酸(Cys)和Hg2+更强的结合能力，达到荧光恢复检测半胱氨酸的用途。
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