CN110483616A - 从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法 - Google Patents
从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110483616A CN110483616A CN201910703471.1A CN201910703471A CN110483616A CN 110483616 A CN110483616 A CN 110483616A CN 201910703471 A CN201910703471 A CN 201910703471A CN 110483616 A CN110483616 A CN 110483616A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant tissue
- pathogen
- apoplast
- plant
- centrifugation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本公开涉及一种从感染病原菌的植物组织中分离质外体汁液的方法，所述质外体汁液中含有所述病原菌分泌的效应蛋白，该方法包括：a、将感染病原菌的植物组织置于缓冲液中进行真空下浸润处理，得到浸润处理后的植物组织；b、将所述浸润处理后的植物组织进行第一次离心，得第一离心液；取所述第一离心液进行第二次离心，收集第二离心液；其中，所述感染病原菌的植物组织中，病原菌为禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌、尖孢镰孢菌、大丽轮枝菌、禾谷炭疽菌、稻瘟菌、灰葡萄孢菌中的至少一种。该方法可以最大程度地分离出病原菌分泌并进入质外体汁液中的效应蛋白，便于更好地分析感病植物组织中病原菌分泌的质外体效应蛋白的组分和特性。
Description
技术领域
本公开涉及病原菌效应蛋白的提取分离技术领域，特别涉及一种从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法。
背景技术
植物质外体(apoplast)是指植物细胞原生质体外围由细胞壁、胞间隙和导管组成的系统。质外体汁液中会发生许多重要的生物进程，如细胞壁的形成、养分的吸收和运输、植物和病原菌的互作等。对于感染了病原菌的植物，质外体是病原菌和寄主互作的核心地带，病原菌会分泌质外体效应蛋白来抑制寄主的先天免疫，而寄主也会分泌相应的抗菌物质来抑制病原菌的侵染。
现有的植物组织质外体汁液提取方法，主要是先将植物组织进行抽真空处理，然后进行离心以收集质外体汁液。例如，Matthieu H.A.J.Joosten为研究多主枝孢Cladosporium fulvum与番茄的互作，将感病的番茄叶片放入盛有去离子水的烧杯中抽真空，然后低温离心收集质外体汁液[Isolation of Apoplastic Fluid from Leaf Tissueby the Vacuum Infi ltration-Centrifugation Technique.]；唐威华等先把新鲜的玉米切片放入超纯水中利用真空泵抽真空半小时，然后在带过滤器的离心管中低温离心收集质外体汁液检测其中的磷含量[Zhang,Y.,et al.,Cellular Tracking and Gene Profilingof Fusarium graminearum during Maize Stalk Rot Disease Development ElucidatesIts Strategies in Confronting Phosphorus Limitation in the Host Apoplast.PLOSPathogens,2016.12(3):p.e1005485.]；Takao Araya等先将拟南芥叶片放入50mL离心管，然后加入预冷的无菌水，加离心管放在装有冰的烧杯中抽真空，待叶片浸满水分后，吸干表面的水分后，用保鲜膜包裹后留个小口放在50mL离心管离心收集拟南芥叶片伤流液来研究植物在生长和发育过程中的代谢物和矿物质[Extraction of Apoplastic Wash Fluidsand Leaf Petiole Exudates from Leaves of Arabidopsis thaliana.]。
然而，现有技术中没有关于从感染了病原菌的植物组织中分离提取含有病原菌分泌的效应蛋白的质外体汁液的相关报道。在活体条件下分析病原菌分泌到植物质外体中的效应蛋白，对于理解病原菌与寄主的互作有重要意义，有助于发现病原菌分泌的新的效应蛋白以及寄主的抗病策略。
发明内容
本公开的目的是提供一种从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法。
为了实现上述目的，本公开一种从感染病原菌的植物组织中分离质外体汁液的方法，所述质外体汁液中含有所述病原菌分泌的效应蛋白，该方法包括：
a、将感染病原菌的植物组织置于缓冲液中进行真空下浸润处理，以使所述缓冲液浸入所述感染病原菌的植物组织的质外体中，得到浸润处理后的植物组织；
b、将所述浸润处理后的植物组织进行第一次离心，得第一离心液，其中，所述第一次离心的条件为：离心力为1000～1500g，温度为0～10℃，离心时间为5～15min；
取所述第一离心液进行第二次离心，收集第二离心液，其中，所述第二次离心的条件为：离心力为12000～15000g，温度为0～10℃，离心时间为3～10min；
其中，所述感染病原菌的植物组织中，病原菌为禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌、尖孢镰孢菌、大丽轮枝菌、禾谷炭疽菌、稻瘟菌、灰葡萄孢菌中的至少一种。
可选地，步骤a中，所述浸润处理包括：
(1)将所述感染病原菌的植物组织置于注射器中并向所述注射器中加入所述缓冲液，排出所述注射器内的空气；
(2)拉动所述注射器的活塞至最大刻度，然后释放所述活塞，以使所述缓冲液浸入所述植物组织的质外体中；
(3)重复进行步骤(2)的操作1～3次。
可选地，步骤(2)中，所述活塞的释放速度为40～60mL/min。
可选地，步骤b中，所述第一次离心的条件为：离心力为1000～1200g，温度为4～6℃，时间为10～15min；
所述第二次离心的条件为：离心力为14000～15000g，温度为4～6℃，时间为3～5min；
所述缓冲液包括Tris溶液和/或NaCl溶液，所述Tris溶液的浓度为0～50mM，所述NaCl溶液的浓度为0～200mM，pH值为6.5～7.5。
可选地，该方法还包括：
分别称量所述感染病原菌的植物组织和所述缓冲液浸润处理后的植物组织并计算二者差值记为M1，称量所述第二离心液的重量并记为M2，M2：M1＝0.8～1.2。
可选地，该方法还包括：将所述感染病原菌的植物组织置于缓冲液中浸泡30～60s，然后再进行步骤a的操作。
可选地，步骤a中，所述感染病原菌的植物组织被剪切为5～15mm厚的薄片状。
可选地，步骤b中，采用双层离心管进行所述第一次离心，所述缓冲液浸润处理后的植物组织置于内层离心管中，所述内层离心管具有出液孔。
可选地，该方法还包括对所述第二离心液进行过滤的步骤。
可选地，所述植物组织为草本植物的植物组织，优选为玉米植株组织、水稻植株组织、小麦植株组织、番茄植株组织和黄瓜植株组织中的至少一种。
本公开通过将感染病原菌的植物组织置于缓冲液中进行真空下浸润处理，待缓冲液充分浸入植物组织的质外体中后，将浸润处理后的植物组织于适宜的离心力、温度下离心，从而得到含有病原菌分泌的效应蛋白的质外体汁液。充分浸入质外体中的缓冲液可以稀释质外体汁液，使质外体汁液在离心时更容易被分离出来，适宜的离心力和离心时间，可以最大程度地分离出质外体汁液中的效应蛋白，并保证植物组织细胞不被损伤，避免污染质外体汁液，便于更好地分析感染了病原菌的植物组织的质外体汁液的组分和特性，鉴定病原菌分泌并进入质外体中的效应蛋白。本公开的方法能够对感染了病原菌的植物组织的质外体汁液进行分离，从而能够进一步分析所述病原菌分泌并进入质外体中的效应蛋白的种类及含量，对于理解病原菌与寄主的互作有重要意义，有助于发现新的病原菌分泌的效应蛋白和寄主的抗病策略。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面，提供一种从感染病原菌的植物组织中分离质外体汁液的方法，所述质外体汁液中含有所述病原菌分泌的效应蛋白，该方法包括：
a、将感染病原菌的植物组织置于缓冲液中进行真空下浸润处理，以使所述缓冲液浸入所述感染病原菌的植物组织的质外体中，得到浸润处理后的植物组织；
b、将所述浸润处理后的植物组织进行第一次离心，得第一离心液，其中，所述第一次离心的条件为：离心力为1000～1500g，温度为0～10℃，离心时间为5～15min；
取所述第一离心液进行第二次离心，收集第二离心液，其中，所述第二次离心的条件为：离心力为12000～15000g，温度为0～10℃，离心时间为3～10min；
其中，所述感染病原菌的植物组织中，病原菌为禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌、尖孢镰孢菌、大丽轮枝菌、禾谷炭疽菌、稻瘟菌、灰葡萄孢菌中的至少一种。
上述技术方案通过将感染病原菌的植物组织置于缓冲液中进行真空下浸润处理，待缓冲液充分浸入植物组织的质外体中后，将浸润处理后的植物组织于适宜的离心力、温度下离心，从而得到含有病原菌分泌的效应蛋白的质外体汁液。充分浸入质外体中的缓冲液可以稀释质外体汁液，使质外体汁液在离心时更容易被分离出来，适宜的离心力和离心时间，可以最大程度地分离出质外体汁液中的效应蛋白，并保证植物组织细胞不被损伤，避免污染质外体汁液，便于更好地分析感染了病原菌的植物组织的质外体汁液的组分和特性，鉴定病原菌分泌并进入质外体中的效应蛋白，从而能够进一步分析效应蛋白的种类及含量，对于理解病原菌与寄主的互作有重要意义，有助于发现新的病原菌分泌的效应蛋白和寄主的抗病策略。
根据本公开，所述浸润处理可以包括：
(1)将所述感染病原菌的植物组织置于注射器中并向所述注射器中加入所述缓冲液，排出所述注射器内的空气；
(2)拉动所述注射器的活塞至最大刻度，然后释放所述活塞，以使所述缓冲液浸入所述植物组织的质外体中；
(3)重复进行步骤(2)的操作1～3次。
利用注射器对植物组织进行浸润处理时，拉动注射器活塞制造真空环境，产生负压，以使缓冲液充分浸入并充满植物组织的质外体，稀释质外体汁液，便于后续离心时能够最大程度地分离出质外体汁液；通过植物组织的颜色变化可以判断缓冲液是否已经充分浸入植物组织的质外体中：当缓冲液充分浸入植物组织的质外体后，植物组织会因浸入缓冲液而颜色加深。利用注射器进行浸润操作，相较于现有技术的真空处理，耗时更短，效率更高。步骤(1)中，向所述注射器中加入所述缓冲液时，为了避免所述缓冲液由注射器口流出，可事先将注射器口封闭，例如采用Parafilm膜封堵注射器口，并在注入所述缓冲液的过程中，通过外力压紧该Parafilm膜。步骤(2)中，释放所述活塞的过程中，可能会导致注射器中重新进入空气，这时，应打开注射器口，将空气排出后，再重复进行步骤(2)的操作。
根据本公开，利用注射器进行浸润处理时，活塞的释放速度可以在较大范围内变化，例如，所述活塞的释放速度可以为40～60mL/min。优选地，所述活塞的释放速度可以为45～55mL/min。在上述优选条件下，能够使缓冲液在较短时间内浸满植物组织的质外体，进一步减少浸润处理所需时间，提高浸润处理效率。
根据本公开，为了获得更好的分离效果，步骤b中，所述第一次离心的条件可以为：离心力为1000～1200g，温度为4～6℃，时间为10～15min；
所述第二次离心的条件可以为：离心力为14000～15000g，温度为4～6℃，时间为3～5min。
对浸润后的植物组织进行离心时，离心机的转速、离心温度和离心时间是影响分离效果的重要因素。若离心机转速过快或者离心时间过长，会导致植物组织细胞破损，细胞液流出污染质外体汁液；若离心机转速过慢或者离心时间过短，会导致离心不充分，大量质外体汁液残留在质外体内；离心温度过高或过低都将破坏质外体汁液中的蛋白质结构，无法得到预期的分离结果，影响后期的鉴定分析工作。在上述优选条件下，可以通过离心充分分离出质外体汁液，同时又可保证植物组织细胞不被破损，避免质外体汁液被植物组织细胞液污染。第一次离心后所得的第一离心液中，仍含有部分不溶性杂质，进行第二次离心并过滤，可以除去不溶性杂质。
根据本公开，所述缓冲溶液的种类可以在较宽范围内选择，例如，所述缓冲液可以包括Tris溶液和/或NaCl溶液，所述Tris溶液的浓度可以为0～50mM，所述NaCl溶液的浓度可以为0～200mM，pH值为6.5～7.5。
根据本公开，可选地，上述方法还可以包括：
分别称量所述感染病原菌的植物组织和所述浸润处理后的植物组织并计算二者差值记为M1，称量所述第二离心液的重量并记为M2，M2：M1＝0.8～1.2。上述M1和M2为将植物组织表面的缓冲液吸干后的净重量。
对感染病原菌的植物组织和浸润处理后的植物组织称重前，均应当吸干植物组织外表面的缓冲液。M1表示浸润处理过程中进入植物组织质外体中的缓冲液的重量，第二离心液的重量M2应与进入植物组织质外体中的缓冲液的重量M1接近，若第二离心液的重量M2远小于进入植物组织质外体中的缓冲液的重量M1，则表示质外体汁液分离不够充分，若第二离心液的重量M2远大于进入植物组织质外体中的缓冲液的重量M1，则表示植物组织细胞破损，细胞液已大量进入质外体汁液中，质外体汁液被污染。
根据本公开，上述方法还可以包括：
将所述感染病原菌的植物组织置于缓冲液中浸泡30～60s，然后再进行步骤a的操作。
将感染病原菌的植物组织置于缓冲液中浸泡一段时间，以洗去样品表面的不溶性杂质，同时部分缓冲液在渗透压的作用下进入植物组织质外体中，使后续的浸润处理更容易进行。整个浸泡过程应避免引入外源蛋白，浸泡时间不宜过长，否则会加速植物组织老化，增加质外体汁液分离的难度。
根据本公开，步骤a中，所述感染病原菌的植物组织可以被剪切为5～15mm厚的薄片状。将植物组织剪切成厚度适宜的薄片状，有利于缓冲液快速进入植物组织的质外体内。
根据本公开，步骤b中，可以采用双层离心管进行所述第一次离心，所述浸润处理后的植物组织置于内层离心管中，所述内层离心管具有出液孔。
将浸润处理后的植物组织置于具有出液孔的内层离心管中进行第一次离心，可以在第一次离心过程中使植物组织停留在内层离心管中，而质外体汁液流到外层离心管中，避免在离心过程中植物组织残渣混入质外体汁液中，实现质外体汁液与植物组织的初步分离。内层离心管的内径和长度应当足以放置植物组织，并小于外层离心管的内径和长度。在实际操作中，内层离心管可用能达到相同目的的其它器材代替，比如注射器。
收集的所述第二离心液即可作为从感染病原菌的植物组织中分离的质外体汁液。为了进一步除去质外体汁液中的不溶性杂质，上述方法还可以包括对所述第二离心液进行过滤的步骤。
过滤所用器材可以为本领域的常用器材，比如：滤膜、滤芯等，示例性地，可以采用0.22μm的滤膜对第二离心液进行过滤。
根据本公开，所述植物组织可以为草本植物的植物组织，优选为玉米植株组织、水稻植株组织、小麦植株组织、番茄植株组织和黄瓜植株组织中的至少一种。
当所述植物组织为玉米植物组织是玉米植株组织时，玉米品种可以为农作物种植中的常见玉米品种；所述玉米植株组织为玉米植株感染病原菌高发区的玉米组织，例如可以为感染轮枝镰孢菌的10叶期玉米的第2茎节和第3茎节。
以下通过实施例进一步详细说明本公开，并不用于限制本公开。
本公开实施例中所使用的材料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
玉米(Zea mays L.)：自交系种子B73产自我国海南南繁基地。玉米植株种植在中国农业科学院植物保护研究所日光温室，日间生长温度为25℃，夜间生长温度为20℃，每日光照16小时，相对湿度为50±10％左右。实验所用营养土为PINDSTRUP基质与蛭石按照重量比3:1混合而成，播种于45×25cm的花盆中，每盆3株，种子萌发后，用上海永通化工有限公司生产的花无缺大量元素水溶肥料稀释1000倍后进行浇灌，每10天一次。
实验所用注射器均购自上海康德莱企业发展集团股份有限公司，1.5mL离心管MCT-150-C购自Axygen爱思进生物技术(杭州)有限公司，50mL离心管购自美国康宁corning公司，0.22μm细菌过滤器Millipore Express@PES Membrane购自Millipore公司。
染菌模型：待玉米植株长到10叶期后，PDA活化轮枝镰孢菌菌株，待菌丝长满平板后，用打孔器打取菌饼并接种于50mL绿豆汤培养基中，25℃ 150rpm摇菌3天，用缓冲液将孢子浓度调到1x106个/mL备用。接种孢子悬浮液前，先用无菌牙签分别在玉米植株第2和第3茎节，第3和第4茎节中间戳孔，然后用1mL注射器将孢子悬浮液通过牙签制造的伤口注射入玉米植株茎秆中。每株接种量200μL，接种完毕后，将伤口用浸满缓冲液的双层纱布包住保湿。玉米植株接种7天后用于实验。
实施例1
从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，包括如下步骤：
(1)取玉米植株感染有轮枝镰孢菌的茎节，置于装有25mM Tris、100mM NaCl(PH＝7.4)缓冲液的烧杯中浸泡60s；
(2)取出浸泡后的玉米植株茎节，用吸水纸吸干表面缓冲液，并用灭菌后的手术刀片切成10mm厚左右的薄片；
(3)对切片后的玉米植株茎节块进行第一次称重，并记录第一质量；
(4)将切片后的玉米植株茎节块置于50mL注射器中，加入缓冲液至完全浸没玉米植株茎节块，排出注射器针筒内多余空气，封堵注射器针口，拉动注射器活塞至注射器50mL刻度，然后以50mL/min的释放速度匀速释放活塞以使缓冲液浸入到玉米植株茎节块的质外体中，待活塞停止回移后，排出注射器针筒内多余空气并重复上述操作，可见玉米植株茎节块的颜色较未浸润之前明显加深，表明浸润完成；
(5)取出浸润完成后的玉米植株茎节块，用吸水纸吸干表面缓冲液，并进行第二次称重，记录第二质量；计算第二质量与第一质量之差，记为M1；
(6)称重后，将玉米植株茎节块用大小适宜的parafilm膜卷起后(避免离心过程中大量玉米植株茎节小块混入质外体汁液中)，置于20mL带有出液孔的内层离心管中，然后将该内层离心管置于50mL外层离心管中，进行第一次离心，收集第一离心液，第一次离心的条件为：离心力为1200g，温度为4℃，离心时间为10min；
(7)取第一离心液，进行第二次离心，收集第二离心液，第二次离心的条件为：离心力为15000g，温度为4℃，离心时间为5min；
对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝1.10。
实施例2
从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，包括如下步骤：
(1)取玉米植株感染有轮枝镰孢菌的茎节，置于装有100mM NaCL(PH＝7.4)缓冲液的烧杯中浸泡30s；
(2)取出浸泡后的玉米植株茎节，用吸水纸吸干表面水分，并用灭菌后的手术刀片切成5mm厚左右的薄片；
(3)对切片后的玉米植株茎节块进行第一次称重，并记录第一质量；
(4)将切片后的玉米植株茎节块置于50mL注射器中，加入缓冲液至完全浸没玉米植株茎节块，排出注射器针筒内多余空气，封堵注射器针口，拉动注射器活塞至注射器50mL刻度，然后以40mL/min的释放速度匀速释放活塞以使缓冲液浸入到玉米植株茎节块的质外体中，活塞完全释放后，可见玉米植株茎节块的颜色较未浸润之前明显加深，表明浸润完成；
(5)取出浸润完成后的玉米植株茎节块，用吸水纸吸干表面缓冲液，并进行第二次称重，记录第二质量；计算第二质量与第一质量之差，记为M1；
(6)称重后，将玉米植株茎节块用大小适宜的保鲜膜卷起后(避免离心过程中大量玉米植株茎节小块混入质外体汁液中)，置于20mL带有出液孔的内层离心管中，然后将该内层离心管置于50mL外层离心管中，进行第一次离心，收集第一离心液，第一次离心的条件为：于离心力为1000g，温度为0℃，离心时间为15min；
(7)取第一离心液，进行第二次离心，收集第二离心液，第二次离心的条件为：离心力为12000g，温度为0℃，离心时间为10min；
对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝0.94。
实施例3
从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，包括如下步骤：
(1)取玉米植株感染有轮枝镰孢菌的茎节，置于装有25mM Tris缓冲液的烧杯中浸泡50s；
(2)取出浸泡后的玉米植株茎节，用吸水纸吸干表面缓冲液，并用灭菌后的手术刀片切成15mm厚左右的薄片；
(3)对切片后的玉米植株茎节块进行第一次称重，并记录第一质量；
(4)将切片后的玉米植株茎节块置于50mL注射器中，加入缓冲液至完全浸没玉米植株茎节块，排出注射器针筒内多余空气，封堵注射器针口，拉动注射器活塞至注射器50mL刻度，然后以60mL/min的释放速度匀速释放活塞以使缓冲液浸入到玉米植株茎节块的质外体中，待活塞停止回移后，排出注射器针筒内多余空气并重复上述操作2次，可见玉米植株茎节块的颜色较未浸润之前明显加深，表明浸润完成；
(5)取出浸润完成后的玉米植株茎节块，用吸水纸吸干表面缓冲液，并进行第二次称重，记录第二质量；计算第二质量与第一质量之差，记为M1；
(6)称重后，将玉米植株茎节块用大小适宜的保鲜膜卷起后(避免离心过程中大量玉米植株茎节小块混入质外体汁液中)，置于20mL带有出液孔的内层离心管中，然后将该内层离心管置于50mL外层离心管中，进行第一次离心，收集第一离心液，第一次离心的条件为：离心力为1500g，温度为10℃，离心时间为5min；
(7)取第一离心液，进行第二次离心，收集第二离心液，第二次离心的条件为：离心力为15000g，温度为10℃，离心时间为3min；
对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝1.15。
实施例4
从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，包括如下步骤：
(1)取玉米植株感染有轮枝镰孢菌的茎节，置于装有100mM NaCL(PH＝7.4)缓冲液的烧杯中浸泡40s；
(2)取出浸泡后的玉米植株茎节，用吸水纸吸干表面缓冲液，并用灭菌后的手术刀片切成4mm厚左右的薄片；
(3)对切片后的玉米植株茎节块进行第一次称重，并记录第一质量；
(4)将切片后的玉米植株茎节块置于50mL注射器中，加入缓冲液至完全浸没玉米植株茎节块，排出注射器针筒内多余空气，封堵注射器针口，拉动注射器活塞至注射器50mL刻度，然后以45mL/min的释放速度匀速释放活塞以使缓冲液浸入到玉米植株茎节块的质外体中，待活塞停止回移后，排出注射器针筒内多余空气并重复上述操作，可见玉米植株茎节块的颜色较未浸润之前明显加深，表明浸润完成；
(5)取出浸润完成后的玉米植株茎节块，用吸水纸吸干表面缓冲液，并进行第二次称重，记录第二质量；计算第二质量与第一质量之差，记为M1；
(6)称重后，将玉米植株茎节块用大小适宜的parafilm膜卷起后(避免离心过程中大量玉米植株茎节小块混入质外体汁液中)，置于20mL带有出液孔的内层离心管中，然后将该内层离心管置于50mL外层离心管中，进行第一次离心，收集第一离心液，第一次离心的条件为：离心力为1200g，温度为6℃，离心时间为6min；
(7)取第一离心液，进行第二次离心，收集第二离心液，第二次离心的条件为：离心力为14000g，温度为6℃，离心时间为6min；
对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝1.08。
实施例5
从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，包括如下步骤：
(1)取玉米植株感染有轮枝镰孢菌的茎节，置于装有25mM Tris缓冲液的烧杯中浸泡60s；
(2)取出浸泡后的玉米植株茎节，用吸水纸吸干表面缓冲液，并用灭菌后的手术刀片切成10mm厚左右的薄片；
(3)对切片后的玉米植株茎节块进行第一次称重，并记录第一质量；
(4)将切片后的玉米植株茎节块置于50mL注射器中，加入缓冲液至完全浸没玉米植株茎节块，排出注射器针筒内多余空气，封堵注射器针口，拉动注射器活塞至注射器50mL刻度，然后以55mL/min的释放速度匀速释放活塞以使缓冲液浸入到玉米植株茎节块的质外体中，待活塞停止回移后，排出注射器针筒内多余空气并重复上述操作，可见玉米植株茎节块的颜色较未浸润之前明显加深，表明浸润完成；
(5)取出浸润完成后的玉米植株茎节块，用吸水纸吸干表面缓冲液，并进行第二次称重，记录第二质量；计算第二质量与第一质量之差，记为M1；
(6)称重后，将玉米植株茎节块用大小适宜的parafilm膜卷起后(避免离心过程中大量玉米植株茎节小块混入质外体汁液中)，置于20mL带有出液孔的内层离心管中，然后将该内层离心管置于50mL外层离心管中，进行第一次离心，收集第一离心液，第一次离心的条件为：离心力为1300g，温度为8℃，离心13min；
(7)取第一离心液，进行第二次离心，收集第二离心液，第二次离心的条件为：离心力为13000g，温度为4℃，离心时间8min；
对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝0.98。
实施例6
利用抽真空处理技术从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，在实施例1的基础上，步骤(4)为：将切片后的玉米植株茎节块置于装有缓冲液的烧杯中，抽真空30min，其余操作步骤及参数条件与实施例1相同。
收集到的第二离心液的重量M2应与进入植物组织质外体中的缓冲液的重量M1之比M2：M1＝0.89。
禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌、尖孢镰孢菌、大丽轮枝菌、禾谷炭疽菌、稻瘟菌、灰葡萄孢菌
实施例7
从感染了禾谷镰孢菌的玉米植株中分离含有禾谷镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，包括如下步骤：
(1)取玉米植株感染有禾谷镰孢菌的茎节，置于装有缓冲的烧杯中浸泡30s；
(2)取出浸泡后的玉米植株茎节，用吸水纸吸干表面缓冲液，并用灭菌后的手术刀片切成5mm厚左右的薄片；
(3)对切片后的玉米植株茎节块进行第一次称重，并记录第一质量；
(4)将切片后的玉米植株茎节块置于50mL注射器中，加入25mM Tris，缓冲液至完全浸没玉米植株茎节块，排出注射器针筒内多余空气，封堵注射器针口，拉动注射器活塞至注射器50mL刻度，然后以65mL/min的释放速度匀速释放活塞以使缓冲液浸入到玉米植株茎节块的质外体中，可见玉米植株茎节块的颜色较未浸润之前明显加深，表明浸润完成；
(5)取出浸润完成后的玉米植株茎节块，用吸水纸吸干表面缓冲液，并进行第二次称重，记录第二质量；计算第二质量与第一质量之差，记为M1；
(6)称重后，将玉米植株茎节块用大小适宜的parafilm膜卷起后(避免离心过程中大量玉米植株茎节小块混入质外体汁液中)，置于20mL带有出液孔的内层离心管中，然后将该内层离心管置于50mL外层离心管中，进行第一次离心，收集第一离心液，第一次离心的条件为：离心力为1000g，温度为0℃，离心时间为5min；
(7)取第一离心液，进行第二次离心，收集第二离心液，第二次离心的条件为：离心力为12000g，温度为0℃，离心时间为3min；
对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝0.86。
实施例8
从感染了禾谷炭疽菌的玉米植株中分离含有禾谷炭疽菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，包括如下步骤：
(1)取玉米植株感染有禾谷炭疽菌的茎节，置于装有25mM Tris缓冲液的烧杯中浸泡60s；
(2)取出浸泡后的玉米植株茎节，用吸水纸吸干表面缓冲液，并用灭菌后的手术刀片切成5mm厚左右的薄片；
(3)对切片后的玉米植株茎节块进行第一次称重，并记录第一质量；
(4)将切片后的玉米植株茎节块置于50mL注射器中，加入缓冲液至完全浸没玉米植株茎节块，排出注射器针筒内多余空气，封堵注射器针口，拉动注射器活塞至注射器50mL刻度，然后以35mL/min的释放速度匀速释放活塞以使缓冲液浸入到玉米植株茎节块的质外体中，待活塞停止回移后，排出注射器针筒内多余空气并重复上述操作，可见玉米植株茎节块的颜色较未浸润之前明显加深，表明浸润完成；
(5)取出浸润完成后的玉米植株茎节块，用吸水纸吸干表面缓冲液，并进行第二次称重，记录第二质量；计算第二质量与第一质量之差，记为M1；
(6)称重后，将玉米植株茎节块用大小适宜的parafilm膜卷起后(避免离心过程中大量玉米植株茎节小块混入质外体汁液中)，置于20mL带有出液孔的内层离心管中，然后将该内层离心管置于50mL外层离心管中，进行第一次离心，收集第一离心液，第一次离心的条件为：离心力为1500g，温度为4℃，离心时间为15min；
(7)取第一离心液，进行第二次离心，收集第二离心液，第二次离心的条件为：离心力为15000g，温度为4℃，离心时间为10min；
对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝1.32。
对比例1
利用实施例1的方法从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，所不同的是：第一次离心的条件为：离心力为800g，温度为4℃，离心时间为10min；第二次离心的条件为：离心力为10000g，温度为4℃，离心时间为5min；对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝0.64。
对比例2
利用实施例1的方法从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，所不同的是：第一次离心的条件为：离心力为1700g，温度为4℃，离心时间为10min；第二次离心的条件为：离心力为17000g，温度为4℃，离心时间为5min；对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝1.31。
对比例3
利用实施例1的方法从感染了轮枝镰孢菌的玉米植株中分离含有轮枝镰孢菌分泌的质外体效应蛋白的质外体汁液，所不同的是：步骤(4)为：将切片后的玉米植株茎节块置于装有缓冲液的烧杯中30min，浸润处理步骤不经真空处理，其余操作步骤及参数条件与实施例1相同。收集到的第二离心液的重量M2应与进入植物组织质外体中的缓冲液的重量M1之比M2：M1＝1.02。
对照例
利用实施例1的方法从健康玉米植株中分离质外体汁液，对收集到的第二离心液进行称重并将称量结果记为M2，M2：M1＝1.13。
测试例
对实施例1～6、对比例1～3和对照例分离得到的质外体汁液进行质谱分析，检测各质外体汁液稀释液中的属于轮枝镰孢菌编码的蛋白质种类，质谱扫描范围[300.00-1800.00]MS，检测结果见表1。
表1各质外体汁液稀释液中的蛋白质种类检测结果
| 测试组 | 轮枝镰孢菌编码蛋白质种类/种 |
| 实施例1 | 73 |
| 实施例2 | 64 |
| 实施例3 | 64 |
| 实施例4 | 67 |
| 实施例5 | 66 |
| 实施例6 | 54 |
| 对比例1 | 42 |
| 对比例2 | 33 |
| 对比例3 | 21 |
| 对照例 | 0 |
由表1可以看出：利用本公开提供的从感染病原菌的植物组织中分离质外体汁液的方法，能充分分离出病原菌分泌并进入植物组织质外体中的效应蛋白，而且利用注射器进行浸润处理，耗时更短，效率更高。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.一种从感染病原菌的植物组织中分离质外体汁液的方法，其特征在于，所述质外体汁液中含有所述病原菌分泌的效应蛋白，该方法包括：
a、将感染病原菌的植物组织置于缓冲液中进行真空下浸润处理，以使所述缓冲液浸入所述感染病原菌的植物组织的质外体中，得到浸润处理后的植物组织；
b、将所述浸润处理后的植物组织进行第一次离心，得第一离心液，其中，所述第一次离心的条件为：离心力为1000～1500g，温度为0～10℃，离心时间为5～15min；
取所述第一离心液进行第二次离心，收集第二离心液，其中，所述第二次离心的条件为：离心力为12000～15000g，温度为0～10℃，离心时间为3～10min；
其中，所述感染病原菌的植物组织中，病原菌为禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌、尖孢镰孢菌、大丽轮枝菌、禾谷炭疽菌、稻瘟菌、灰葡萄孢菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述浸润处理包括：
(1)将所述感染病原菌的植物组织置于注射器中并向所述注射器中加入所述缓冲液，排出所述注射器内的空气；
(2)拉动所述注射器的活塞至最大刻度，然后释放所述活塞，以使所述缓冲液浸入所述植物组织的质外体中；
(3)重复进行步骤(2)的操作1～3次。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(2)中，所述活塞的释放速度为40～60mL/min。
4.根据利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤b中，所述第一次离心的条件为：离心力为1000～1200g，温度为4～6℃，时间为10～15min；
所述第二次离心的条件为：离心力为14000～15000g，温度为4～6℃，时间为3～5min；
所述缓冲液包括Tris溶液和/或NaCl溶液，所述Tris溶液的浓度为0～50mM，所述NaCl溶液的浓度为0～200mM，pH值为6.5～7.5。
5.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括：
分别称量所述感染病原菌的植物组织和所述缓冲液浸润处理后的植物组织并计算二者差值记为M1，称量所述第二离心液的重量并记为M2，M2：M1＝0.8～1.2。
6.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括：将所述感染病原菌的植物组织置于缓冲液中浸泡30～60s，然后再进行步骤a的操作。
7.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述感染病原菌的植物组织被剪切为5～15mm厚的薄片状。
8.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤b中，采用双层离心管进行所述第一次离心，所述浸润处理后的植物组织置于内层离心管中，所述内层离心管具有出液孔。
9.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括对所述第二离心液进行过滤的步骤。
10.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述植物组织为草本植物的植物组织，优选为玉米植株组织、水稻植株组织、小麦植株组织、番茄植株组织和黄瓜植株组织中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910703471.1A CN110483616B (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910703471.1A CN110483616B (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110483616A true CN110483616A (zh) | 2019-11-22 |
| CN110483616B CN110483616B (zh) | 2021-06-04 |
Family
ID=68549074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910703471.1A Active CN110483616B (zh) | 2019-07-31 | 2019-07-31 | 从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110483616B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111713204A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-09-29 | 山东农业大学 | 效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的应用 |
| EP4194561A4 (en) * | 2020-08-05 | 2024-08-28 | Denka Company Ltd | METHODS FOR RECOVERY AND PRODUCTION OF A TARGET PROTEIN |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103115810A (zh) * | 2013-02-25 | 2013-05-22 | 中国科学院植物研究所 | 一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法 |
| CN103333234A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-02 | 甘肃农业大学 | 冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法 |
| CN105136552A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-09 | 北京农学院 | 一种从植物果实组织中提取质外体汁液的装置及方法 |
| CN105181965A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-23 | 云南农业大学 | 一种检测稻瘟菌效应蛋白从水稻根部转移至叶缘的方法 |
| CN107090021A (zh) * | 2009-09-22 | 2017-08-25 | 麦迪卡格公司 | 制备植物来源的蛋白质的方法 |
| CN110041397A (zh) * | 2011-03-23 | 2019-07-23 | 麦迪卡格公司 | 回收植物来源的蛋白质的方法 |
-
2019
- 2019-07-31 CN CN201910703471.1A patent/CN110483616B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107090021A (zh) * | 2009-09-22 | 2017-08-25 | 麦迪卡格公司 | 制备植物来源的蛋白质的方法 |
| CN110041397A (zh) * | 2011-03-23 | 2019-07-23 | 麦迪卡格公司 | 回收植物来源的蛋白质的方法 |
| CN103115810A (zh) * | 2013-02-25 | 2013-05-22 | 中国科学院植物研究所 | 一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法 |
| CN103333234A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-02 | 甘肃农业大学 | 冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法 |
| CN105181965A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-23 | 云南农业大学 | 一种检测稻瘟菌效应蛋白从水稻根部转移至叶缘的方法 |
| CN105136552A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-09 | 北京农学院 | 一种从植物果实组织中提取质外体汁液的装置及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吴旻等: "稻瘟病菌效应蛋白的分泌特征及其在水稻细胞中的转运", 《中国细胞生物学学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111713204A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-09-29 | 山东农业大学 | 效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的应用 |
| CN111713204B (zh) * | 2020-05-20 | 2021-08-24 | 山东农业大学 | 效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的应用 |
| EP4194561A4 (en) * | 2020-08-05 | 2024-08-28 | Denka Company Ltd | METHODS FOR RECOVERY AND PRODUCTION OF A TARGET PROTEIN |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110483616B (zh) | 2021-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Koske | Gigaspora gigantea: observations on spore germination of a VA-mycorrhizal fungus | |
| Blakeman et al. | The persistence of Colletotrichum coccodes and Mycosphaerella ligulicola in soil, with special reference to sclerotia and conidia | |
| CN101899408B (zh) | 一种短小芽孢杆菌及其在毒杀松材线虫中的应用 | |
| CN110468057B (zh) | 一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用 | |
| CN110483616A (zh) | 从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法 | |
| CN107083344A (zh) | 一种防治猕猴桃溃疡病的假单胞菌菌株及其应用 | |
| CN116179367B (zh) | 一种草莓病害生防菌jsnl-b118及其应用 | |
| CN107517726A (zh) | 一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法 | |
| CN102630534B (zh) | 利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法 | |
| CN102061330B (zh) | 一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法 | |
| CN110551641A (zh) | 一种薇甘菊生防菌的制备及应用方法 | |
| CN116590199B (zh) | 一种皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在玉米穗腐病防治中的应用 | |
| CN104974975A (zh) | 一种制备葡萄溃疡病菌分生孢子的方法 | |
| CN116925925B (zh) | 白腐菌与褐腐菌复合菌剂及其在防治松材线虫病中的应用 | |
| CN102443544B (zh) | 一种芝麻枯萎病菌的分离和纯化方法 | |
| CN112961784B (zh) | 一株内生链格孢菌Aa-Lcht及其在防治苹果树腐烂病中的用途 | |
| CN109619168B (zh) | 肉桂精油在蓝莓抑菌保鲜上的应用及应用方法 | |
| Qin et al. | A nonwounding greenhouse screening protocol for prediction of field resistance of hybrid poplar to Septoria canker | |
| CN111187724B (zh) | 一种蓝莓根部深色有隔内生真菌及其应用 | |
| CN110079478B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌的抑菌物及其制备方法和在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用 | |
| CN111670914B (zh) | 短小芽孢杆菌hr10在防治林木病害中的新用途 | |
| Gaur et al. | Research methods in arbuscular mycorrhizal fungi | |
| CN101298597B (zh) | 一种海洋枯草芽孢杆菌及其筛选方法 | |
| CN116240113B (zh) | 一种抑制草莓炭疽病的生防菌jsnl-b47及其应用 | |
| CN115152762B (zh) | 一种化合物细格菌素在防治苹果树腐烂病中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220121 Address after: Room 320, floor 3, building 49, yard 2, Yuanmingyuan West Road, Haidian District, Beijing 100193 Patentee after: Beijing Zhongnong taste detection technology Co.,Ltd. Address before: 100193 No. 2 Old Summer Palace West Road, Beijing, Haidian District Patentee before: INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20191122 Assignee: Yantai Weixi Food Technology Co.,Ltd. Assignor: Beijing Zhongnong taste detection technology Co.,Ltd. Contract record no.: X2023110000049 Denomination of invention: Method for isolating extracellular effector proteins secreted by pathogens from plant tissues infected with pathogens Granted publication date: 20210604 License type: Common License Record date: 20230327 Application publication date: 20191122 Assignee: Yantai Leguai Food Co.,Ltd. Assignor: Beijing Zhongnong taste detection technology Co.,Ltd. Contract record no.: X2023110000050 Denomination of invention: Method for isolating extracellular effector proteins secreted by pathogens from plant tissues infected with pathogens Granted publication date: 20210604 License type: Common License Record date: 20230327 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20191122 Assignee: Yantai Zhengwei Food Co.,Ltd. Assignor: Beijing Zhongnong taste detection technology Co.,Ltd. Contract record no.: X2023110000051 Denomination of invention: Method for isolating extracellular effector proteins secreted by pathogens from plant tissues infected with pathogens Granted publication date: 20210604 License type: Common License Record date: 20230329 Application publication date: 20191122 Assignee: Yantai Jiuda Agricultural Technology Co.,Ltd. Assignor: Beijing Zhongnong taste detection technology Co.,Ltd. Contract record no.: X2023110000052 Denomination of invention: Method for isolating extracellular effector proteins secreted by pathogens from plant tissues infected with pathogens Granted publication date: 20210604 License type: Common License Record date: 20230329 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |