CN103115810A - 一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法。本发明所提供的从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法，包括如下步骤：（1）将成段的待分离植物茎部组织置于二通管中，使所述待分离植物茎部组织不会从所述二通管的底孔漏掉；所述待分离植物茎部组织为去除了中柱后的茎部组织；（2）将步骤（1）中装有所述待分离植物茎部组织的所述二通管置于离心管中，使所述二通管的顶孔对应离心管的管口；（3）离心，获得从所述待分离植物茎部组织中分离得到的质外体汁液。本发明所提供的方法可以更广泛地应用于所有叶片退化的植物质外体汁液的提取，这对于发现这类植物特殊的物质交换途径具有重要意义。

Description

一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法

技术领域

本发明涉及一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法，特别涉及一种从盐角草等叶片退化植物的茎部组织中分离质外体汁液的方法。

背景技术

植物质外体（apoplast）是由细胞膜外构成细胞壁的纤维和微晶体空间以及充满水和空气的细胞间隙所组成，分化完成的木质部也属于质外体[Sattelmacher B.Theapoplast and its significance for plant mineral nutrition.New Phytologist,2001,149:167-192.]。它是一个动态空间，其中的质外体液涉及到许多重要的生理生化过程，如溶质和水分运输、细胞内环境的动态平衡、生长与发育、信号转导以及抵抗逆境等等[Sakurai N.Dynamic function and regulation of apoplast in the plant body.Journal of PlantResearch,1998,111:133-148.]。

目前普遍采用的提取质外体汁液方法是直接离心法。1980年Terry和Bonner用此法成功地提取了豌豆质外体汁液。用酸溶液淋洗豌豆幼苗的茎段切口后，将植物材料（茎段或叶片）置于特定容器（如针管）内，在离心力的作用下，使质外体的汁液分离出来。通过测定苹果酸脱氢酶或磷酸己糖异构酶的活性，来选取最佳离心时间和最佳离心力，以减少切口胞浆造成的污染。他们发现，离心力在500～3000×g范围内，细胞膜几乎未受到损坏，膜内渗出物质污染小于1.5%，计算时可以忽略不计[Terry ME,Bonner BA.An examination of centrifugation as a method of extracting an extracellularsolution from peas,and its use for the study of indoleacetic acid-induced growth.NewPhytologist,1980,66:321-325.]。但是，通过对向日葵质外体液梯度离心分离的摸索，发现在2000-2500g之间分离的液体，为相对高纯度的外置体液，其他离心力分离出来的液体纯度出现明显的下降[Dannel F,Pfeffer H,Marschner H.Isolation of apoplasmicfluid from sunflower leaves and its use for studies on influence of nitrogen supply onapoplasmic pH.Journal of Plant Physiology,1995,146:273-278.]。

通过这些研究看出，分离不同植物质外体液的离心速率不尽相同。而迄今为止，还没有对地上部分叶片退化的植物质外体液的分离报道。对于叶片退化的植物，分析质外体液的组分和特性，往往可以发现植物特殊的物质交换途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法。

本发明所提供的从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法，具体可包括如下步骤：

（1）将成段的待分离植物茎部组织置于二通管中，使所述待分离植物茎部组织不会从所述二通管的底孔漏掉；

所述二通管的顶孔较大，底孔较小；较大的顶孔保证所述待分离植物茎部组织顺利放入所述二通管中，较小的底孔保证所述待分离植物茎部组织不会从所述二通管的底孔漏掉（即使离心的过程中也不会漏掉），有效的集中微量的离心液，同时保证所述待分离植物茎部组织与离心液的有效分离。

所述待分离植物茎部组织为去除了中柱后的茎部组织，这样可以减少离心过程中中柱汁液对于质外体汁液的污染；

（2）将步骤（1）中装有所述待分离植物茎部组织的所述二通管置于离心管中，使所述二通管的顶孔对应离心管的管口；

（3）离心，获得为从所述待分离植物茎部组织中分离得到的质外体汁液。

在上述方法的步骤（3）中，所述“离心，获得为从所述待分离植物茎部组织中分离得到的质外体汁液”的方法具体包括如下步骤：

（a1）以离心力A离心，除去所得的离心液1；

（a2）以离心力B离心，收集所得的离心液2；所述离心液2即为从所述待分离植物茎部组织中分离得到的质外体汁液；

所述离心力A和所述离心力B满足如下条件：

（b1）所述离心力B为分离所述质外体汁液的最适离心力，所述离心力A低于所述离心力B；

（b2）在所述离心力A的作用下离心，基本上不会从所述待分离植物茎部组织中得到所述质外体汁液，但会得到大量的干扰液体1；所述干扰液体1为将所述待分离植物茎部组织在所述离心力B的作用下离心，得到的除所述质外体汁液以外的液体；

（b3）在所述离心力B作用下离心，会从所述待分离植物茎部组织中得到大量的所述质外体汁液，但基本上不会得到干扰液体2；所述干扰液体2为将所述待分离植物茎部组织先在所述离心力B的作用下离心并去除离心液后，再在大于所述离心力B的作用下离心，得到的非所述质外体汁液的液体。

所述离心力B（最适离心力）对于不同的待分离植物品种而言是不同的。其确定方法为如下（a）和（b）：

（a）酰罗丹明G（正对照）法：由于酰罗丹明G会被植物吸收，并分布在质外体汁液中，所以可按照如下方法确定从植物茎部组织中分离质外体汁液的最适离心力：从茎基部将待分离植物（如盐角草）地上部分剪下，浸泡在为酰罗丹明G水溶液（浓度可为50g/L，浸泡时间可为1h）；然后按照上述本发明所提供的方法提取质外体汁液，值得注意的是，对于步骤（3），需采用梯度离心（可设每500g为一个梯度，500g离心后弃离心液，从1000g开始），收集不同离心力下获得的离心液，分别进行酰罗丹明G含量测定（如用紫外分光光度计在530nm处测定其光密度值）。随着离心力的增大，当在某一离心力下，离心液中酰罗丹明G的含量达到峰值，则该离心力为最适离心力，即所述离心力B。相应的，在以上梯度离心力中，按照离心力由小到大的顺序，与所述离心力B相邻且位于所述离心力B前的离心力（单一离心力），或包括该离心力在内的系列梯度离心力为所述离心力A。

（b）细胞质标志酶（负对照）法：按照上述本发明所提供的方法从待分离植物（如盐角草）茎部组织中提取质外体汁液，值得注意的是，对于步骤（3），需采用梯度离心（可设每500g为一个梯度，500g离心后弃离心液，从1000g开始），收集不同离心力下获得的离心液，分别进行细胞质标志酶（如苹果酸脱氢酶，磷酸己糖异构酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶）活性测定。随着离心力的增大，当在某一个离心力下，细胞质标志酶活性不显著降低，则该离心力为最适离心力，即所述离心力B。相应的，在以上梯度离心力中，按照离心力由小到大的顺序，与所述离心力B相邻且位于所述离心力B前的离心力（单一离心力），或包括该离心力在内的系列梯度离心力为所述离心力A。

通常情况下，所述离心力A（或所述离心力A中的最大离心力）比所述离心力B小500g左右。

在上述方法中，所述待分离植物茎部组织可进一步为位于外皮层和内皮层之间的茎部组织。

本发明所提供的上述方法特别适合于叶片退化的植物。

在本发明的一个实施例中，所述叶片退化的植物具体为盐角草；更进一步，为60日龄的盐角草。

更加具体的，所述待分离的植物茎部组织来自于所述盐角草茎从茎尖往下2-7cm的区域。因为这部分茎，中柱与内皮层细胞的界限清晰（如图1所示），易于将其他茎部组织与中柱组织分离开来。

在本发明的一个实施例中，通过上述（a）和（b）的方法最终确定分离所述盐角草茎部组织中的质外体汁液的最适离心力（即所述离心力B）为3500g。

相应的，所述离心力A为如下（I）或（II）：

（I）单一离心力：3000g；

（II）梯度离心力：小于3000g的任一或若干离心力、3000g；

所述梯度离心，在离心的过程中，按照离心力由小到大的顺序依次进行。

在本发明的一个实施例中，所述离心力A具体为梯度离心力，其大小及在离心过程中的先后顺序如下：500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g。

在上述方法中，步骤（3）中，每次所述离心的时间均可为3-10min（如5min）。

在本发明的一个实施例中，从所述盐角草的茎部组织中分离质外体汁液时，采用的所述二通管为上下底面均为空的，底孔直径为1mm，顶孔直径为1cm的塑料管。具体为天根生化科技（北京）有限公司“Universal DNA纯化回收试剂盒”中的回收管（人为去掉回收膜后即可以使用），其产品目录号为(DP214)。与所述二通管配合使用的离心管为1.5mL的塑料离心管。

为了减少质外体液成分的改变，对于上述方法，所有操作均最好在4℃条件下进行。

更加具体的，从盐角草茎部组织中分离质外体汁液的方法，可包括如下步骤：

（a1）剪取盐角草地上部分从茎尖往下2-7cm的区域（如图1中A所示，大致1g鲜重），切取位于外皮层和内皮层之间的茎部组织（如图1中B所示），将其切成长度为2.5cm的条状（注意禁止切取中柱部分）；

（a2）将步骤（a1）中切取的条状组织放置于一个塑料二通管（顶孔直径1cm，底孔直径1mm，具体为天根生化科技（北京）有限公司“Universal DNA纯化回收试剂盒”中的回收管（去掉回收膜即可以使用），其产品目录号为(DP214)）中；

（a3）将所述塑料二通管放置于1.5ml的塑料离心管中，分梯度进行离心，每次5min，离心力从500g逐渐增加至3500g，每次递增500g。去除3500g之前的离心液，收集3500g离心所得离心液，即得从所述盐角草茎部组织中分离得到的质外体汁液。

上述方法中，自步骤（a1）中，所述“剪取盐角草地上部分从茎尖往下2-7cm的区域”之后的所有操作均在4℃条件下进行。

本发明以盐角草为研究对象，提供了一种从植物茎部组织中提取质外体汁液的方法，特别对于叶片退化的植物具有重要的意义。具体的，本发明的优势在于：首先，本发明选择盐角草地上部分从茎尖往下2-7cm的部分，中柱与内皮层细胞的界限清楚，容易在切取材料时避开中柱部分，减少中柱液体污染。其次，因为盐角草没有叶片，所以很难分离大量的质外体液；同时，切取盐角草组织也比较费时和费力，因此，使用一种少量液体收集器是非常重要的。为了使分离的微量液体能与组织分开，并明显存积在1.5ml离心管底部，本发明的发明人利用了一种塑料二通管（如图2所示）。使用该装置，不仅可以防止组织与离心出来的液体进行接触；也可以将分离出来的微量液体，经过底孔进行集中，最终滴落在1.5ml离心管底部，有效地回收了离心产物。第三，本发明的发明人尝试了不同离心力，找到了分离盐角草地上部分质外体汁液的最适离心力，3500g离心力下收获的液体，为高纯度的质外体液。综上所述，本方法建立了一种适合于从植物茎组织中提取质外体汁液的方法。该方法除了适用于盐角草质外体液的提取外，同时，可以更广泛地应用于所有叶片退化的植物质外体汁液的提取，这对于发现这类植物特殊的物质交换途径具有重要意义。

附图说明

图1为盐角草地上部分与茎的横切面。其中，A为盐角草地上部分退化的叶片和肉质化的茎。B为盐角草地上部分横切面示意图，A′-B′表示实验中切取的区域。

图2为塑料二通管尺寸示意图。

图3为不同离心力下获得的离心液中样品纯度的分析鉴定结果。A-C分别表示通过苹果酸脱氢酶，磷酸己糖异构酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性来测算组分纯度。纵坐标表示不同的离心力，横坐标表示纯度。图中标准误差线上相同的字母表示数据在P≤0.05水平上没有显著性差异。

图4为酰罗丹明G在不同离心力所得离心液中的浓度测定结果。图中标准误差线上相同的字母表示数据在P≤0.05水平上没有显著性差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所涉及的定量数据均采用SPSS 13.0分析软件分析。显著性检测用LSD在5%的显著水平进行衡量。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

盐角草（Salicornia europaea L.）：种子产自我国江苏省大丰市滩涂，可由江苏晶隆海洋产业发展有限公司提供。盐角草种植在中科院植物研究所日光温室，生长环境保持在日间温度25℃，夜间20℃，每日光照16小时，同时保持着50±10%的相对湿度。种子播种于蛭石上，以浅沙覆盖，种子萌发后，改用1/2Hoagland营养液进行浇灌，每周一次。选择60日龄的盐角草进行实验。

塑料二通管：顶孔直径1cm，底孔直径1mm，具体为天根生化科技（北京）有限公司“Universal DNA纯化回收试剂盒”中的回收管（人为去掉回收膜后即可以使用），其产品目录号为(DP214)。

1.5mL塑料离心管：生工生物工程（上海）股份有限公司产品，（http://www.sangon.com/）。

酰罗丹明G（Sulphorhodamine G）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6P-DH）、6-磷酸果糖、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP⁺）、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油酸酯、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、草酰乙酸等：购买于SIGMA-ALDRICH公司（http://www.sigmaaldrich.com/china-mainland.html）。

实施例1、从盐角草茎部组织中分离质外体汁液

一、分离质外体汁液

1、剪取60日龄盐角草地上部分从茎尖往下2-7cm的区域（如图1中A所示），大致1g鲜重。之后的操作都在4℃条件下进行，为了减少质外体液成分的改变。

2、小心切取位于外皮层和内皮层之间的茎部组织（如图1中B所示），将其切成长度为2.5cm的条状，禁止切取中柱部分（原因：中柱液会造成质外体汁液的污染）。

3、将切取的条状组织摆好，并用保鲜膜在条状组织的中间位置处轻轻缠好（条状组织的两端不缠保鲜膜），从顶孔端放置于一个塑料二通管（顶孔直径1cm，底孔直径1mm，如图2所示）中。

4、将塑料二通管放置于1.5ml的塑料离心管中。分梯度进行离心，每次5min，离心力从500g逐渐增加至5000g，每次递增500g。分别收集同一样品每次离心后的液体，4℃保存。500g收集的液体弃用（主要原因：切取组织的时候伤口条带过长，机械损损失会造成组织液（其中包含质外体液）流出），因此该离心力下收获的质外体汁液不能反映真实的结果），后续各离心力下所得的离心液均按照如下步骤二进行分析鉴定。

二、步骤一各离心力下所得离心液的鉴定

1、离心液纯度分析——细胞质标志酶活性测定（负对照）

苹果酸脱氢酶，磷酸己糖异构酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶为细胞质标志酶，在质外体中含量极低（苹果酸脱氢酶，磷酸己糖异构酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶是细胞内的酶，所以在细胞外含量非常低，参考文献“Dannel F,Pfeffer H,Marschner H.Isolation ofapoplasmic fluid from sunflower leaves and its use for studies on influence of nitrogensupply on apoplasmic pH.Journal of Plant Physiology,1995,146:273-278.”）所以本发明将对步骤一各离心力下所得离心液分别进行以上三种细胞质标志酶的活性测定，将其作为负对照。

按照如下（1）-（3）的方法对步骤一各离心力下所得离心液分别进行以上三种细胞质标志酶的活性测定。同时，为了评价各离心液污染的程度，将60日龄盐角草地上茎部组织（从茎尖往下2-7cm的区域）直接研磨，得到匀浆，并对其三种酶的酶活进行测定，作为对照值，与不同离心力下所得离心液的酶活进行比较。若离心后的组分中酶活与匀浆中的酶活比率越低，表示离心液样品纯度越高，说明质外体汁液所占离心液的比例越高。离心液样品纯度公式如下：

离心液样品纯度=（1-离心液中酶活/匀浆中酶活）×100%

实验设三次重复，结果取平均值。

（1）磷酸己糖异构酶（hexose phosphate isomerase,EC5.3.1.9）活性测定

磷酸己糖异构酶（HPI）可以6-磷酸果糖为底物，将其转化为6-磷酸葡萄糖糖；而6-磷酸葡萄糖可以在6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6P-DH）的作用下，以NADP⁺为辅酶得到6-磷酸葡萄糖内酯和NADPH。以反应过程中产生的NADPH来计算相应的酶活性。

将50μL步骤一中获得的离心液加入到1mL反应液（50mM Tris、5mM MgCl₂、1mM NaCl、0.39mM NADP⁺、0.46U/ml G6P-DH、1.4mM6-磷酸果糖，pH8.0，各浓度均为相应组分在反应液中的终浓度）中，25℃反应5min，每一分钟用紫外分光光度计分别测定340nm（NADPH和NADH因为含有二氢吡啶环，在340nm有吸收峰）处的吸收值，根据反应前后OD340的变化率来代表离心液中磷酸己糖异构酶（HPI）的活性。即用△OD340/min来表示。

（2）3-磷酸甘油醛脱氢酶（NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAP-DH,EC1.2.1.13）的活性测定

3-磷酸甘油酸酯在磷酸甘油酸激酶（PGK）的作用下，生成甘油醛-3-磷酸；甘油醛-3-磷酸会在3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAP-DH）的催化之下生成1,3-双磷酸甘油酸，此反应会消耗掉一个NAD⁺，使其成为NADH（可直接利用的能量携带分子），并释出一个氢离子。

将50μL步骤一中获得的离心液加入到1mL反应液（50mM HEPES，2mM EDTA，30mM MgSO₄，10mM二硫苏糖醇，1.6mM的ATP，0.2mM NADPH，30U/mL磷酸甘油酸激酶和10mM3-磷酸甘油酸酯，pH8.0，各浓度均为相应组分在反应液中的终浓度）中，25℃反应5min，每一分钟用紫外分光光度计分别测定340nm（NADPH和NADH因为含有二氢吡啶环，在340nm有吸收峰）处的吸收值，根据反应前后OD340的变化率来代表离心液中3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAP-DH）的活性。即用△OD340/min来表示。

（3）苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase,EC1.1.1.37）活性测定

苹果酸脱氢酶（MDH）在NAD⁺和NADH的参与下，可以催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换。

将50μL步骤一中获得的离心液加入到1mL反应液（46.5mM Tris，0.1mM NADH和0.4mM的草酰乙酸，pH9.5，各浓度均为相应组分在反应液中的终浓度）中，25℃反应5min，每一分钟用紫外分光光度计分别测定340nm（NADPH和NADH因为含有二氢吡啶环，在340nm有吸收峰）处的吸收值，根据反应前后OD340的变化率来代表离心液中苹果酸脱氢酶（MDH）的活性。即用△OD340/min来表示。

步骤一各离心力下所得离心液中样品纯度的测定结果如图3所示，以苹果酸脱氢酶，磷酸己糖异构酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶所计算的纯度，随着离心力的增大，组分的纯度不断提高。离心力在3500g左右，开始保持一个稳定的水平。例如，通过苹果酸脱氢酶测算的纯度，从3500g之后就保持在98.5%以上，不出现显著的变化；磷酸己糖异构酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶也表现出相似的结果。综合以上结果，认为在3500g离心力下收集的离心液为质外体液。

2、酰罗丹明G（Sulphorhodamine G）的测定

由于酰罗丹明G被认为会被植物吸收，并分布在质外体汁液中[Dannel F,Pfeffer H,Marschner H.Isolation of apoplasmic fluid from sunflower leaves and its use for studies oninfluence of nitrogen supply on apoplasmic pH.Journal of Plant Physiology,1995,146:273-278.]。所以本发明将酰罗丹明G含量的测定作为正对照。具体方法如下：

从茎基部将60日龄盐角草地上部分剪下，浸泡在浓度为50g/L的酰罗丹明G水溶液中1h。然后按照步骤一所述的方法提取质外体汁液。酰罗丹明G的含量用紫外分光光度计进行测定，将提取液稀释100倍，在530nm处测定其光密度值。光密度值越大，表明离心液中酰罗丹明G的含量越高，说明质外体汁液所占离心液的比例越高。

结果如图4所示，随着离心力从1000g增加到3500g，酰罗丹明G占离心液的浓度也不断增大。直到3500g达到峰值，随后又开始显著降低。结合步骤1中样品纯度的测定结果（3500g左右为适宜的离心力），最终确定3500g为分离盐角草质外体液最适离心力。

根据步骤二的鉴定分析结果，在从盐角草茎部组织中分离质外体汁液的实际操作中，可按照步骤一所述操作方法进行，针对步骤4，采用系列梯度离心方式，从500g逐渐增加至3500g（每次递增500g）即可，去除3500g之前的离心液，收集3500g的离心液，即得盐角草质外体汁液。为了操作方便，节约时间和操作成本，也可采用两段式梯度离心，即先采用3000g离心，去除离心液，再采用3500g离心，收集离心液，即得盐角草质外体汁液。

Claims (10)

1.一种从植物茎部组织中分离质外体汁液的方法，包括如下步骤：

（1）将成段的待分离植物茎部组织置于二通管中，使所述待分离植物茎部组织不会从所述二通管的底孔漏掉；

所述待分离植物茎部组织为去除了中柱后的茎部组织；

（2）将步骤（1）中装有所述待分离植物茎部组织的所述二通管置于离心管中，使所述二通管的顶孔对应离心管的管口；

（3）离心，获得从所述待分离植物茎部组织中分离得到的质外体汁液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述离心，获得从所述待分离植物茎部组织中分离得到的质外体汁液的方法，包括如下步骤：

（a1）以离心力A离心，除去所得的离心液1；

（a2）以离心力B离心，收集所得的离心液2；所述离心液2即为从所述待分离植物茎部组织中分离得到的质外体汁液；

所述离心力A和所述离心力B满足如下条件：

（b1）所述离心力A低于所述离心力B；

（b2）在所述离心力A的作用下离心，不会从所述待分离植物茎部组织中得到所述质外体汁液，但会得到干扰液体1；所述干扰液体1为将所述待分离植物茎部组织在所述离心力B的作用下离心，得到的除所述质外体汁液以外的液体；

（b3）在所述离心力B作用下离心，会从所述待分离植物茎部组织中得到所述质外体汁液，但不会得到干扰液体2；所述干扰液体2为将所述待分离植物茎部组织先在所述离心力B的作用下离心并去除离心液后，再在大于所述离心力B的作用下离心，得到的非所述质外体汁液的液体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待分离植物茎部组织为位于外皮层和内皮层之间的茎部组织。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为叶片退化的植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述叶片退化的植物为盐角草。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述盐角草为60日龄的盐角草。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述待分离的植物茎部组织来自于从所述盐角草茎尖往下2-7cm的区域。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述离心力A为如下（a）或（b）：

（a）单一离心力：3000g；

（b）梯度离心力：小于3000g的任一或若干离心力、3000g；

所述离心B为3500g。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，每次所述离心的时间均为3-10min。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，每次所述离心的时间均为5min。

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