CN110483539A - 一种荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荧光探针及其制备方法与应用，属于探针材料技术领域。本发明提供的荧光探针具有式I所示结构，本发明的荧光探针基于荧光共振能量传递(FRET)机理，以铽(Tb3+)配合物为能量供体，四甲基罗丹明衍生物为能量受体；使该荧光探针能够基于比率检测、时间分辨荧光检测及荧光寿命检测对样品进行检测，能够大大提高复杂样品中次氯酸检测的准确度。实施例的数据表明：本发明提供的荧光探针对次氯酸检测具有很高的选择性。

Description

一种荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及探针材料技术领域，尤其涉及一种荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
次氯酸作为一种弱酸，由于分子中高价氯的存在，使其具有很强的氧化性和漂白性，因此其作为杀菌剂和漂白剂被广泛的用于生产生活中。另一方面，在生物体中，次氯酸作为一种重要的活性氧物种之一，其在细胞信号传导、机体免疫等方面具有十分重要的作用。然而，体内次氯酸含量的改变往往与许多疾病相关。因此，对于次氯酸的定性/定量检测具有重要的意义。
目前已经报道的用于次氯酸检测的方法有很多，如化学滴定分析法、极谱法、比色法及电位分析法等。与这些传统分析法相比，基于荧光探针的荧光传感分析技术具有检测灵敏度高、选择性好、操作简便、分析速度快及适于原位分析等特点，近年来受到了广泛的关注，一系列用于次氯酸检测的荧光探针被开发出来(Zhang,Y.R.；Liu,Y.；Zhao,B.X.Sens.Actuators,B 2017,240,18-36)。然而，目前报道的这些荧光探针大部分是以罗丹明、荧光素、Cy染料等有机染料为发光基团设计的，其用于复杂环境与生物样品中次氯酸检测时，会受到本底荧光信号的干扰，对检测结果造成较大影响(Chen,X.Q.；Wang,F.；Hyun,J.Y.；Wei,T.W.；Qiang,J.Ren,X.T.；Shin,I.；Yoon,J.Chem.Soc.Rev.,2016,45,2976-3016；Xiao,Y.N.；Zhang,R.；Ye,Z.Q.；Dai,Z.C.；An,H.Y.；Yuan,J.L.Anal.Chem.2012,84,10785-10792)；另一方面，这些以单一波长处荧光强度的变化作为检测信号的荧光探针，其检测结果受激发光强度、样品环境及探针浓度等变化因素影响较大，亦不利于次氯酸的准确定量检测(Kim,J.S.；Sessler,J.L.Chem.Soc.Rev.,2015,44,4185-4191)。因此，开发一种能够用于次氯酸准确检测的荧光探针具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种荧光探针及其制备方法，本发明提供的荧光探针对次氯酸检测准确度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种荧光探针，所述荧光探针具有式I所示结构：
本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和有机溶剂混合，进行活化反应，得到活化反应液；
将所述活化反应液、三乙胺和2,4-二硝基苯肼混合，进行酰胺化反应，得到BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、有机溶剂、浓盐酸和三乙胺混合，进行脱BOC反应，得到哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶、CH3CN和弱碱混合，进行取代反应，得到四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、醇溶剂、强碱和水混合，进行酯基水解反应，得到荧光化合物；
将所述荧光化合物、氯化铽和水混合，进行配合反应，得到所述荧光探针。
优选地，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:3～5:3～5。
优选地，所述酰胺化反应中，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、三乙胺和2,4-二硝基苯肼的用量比为0.27mmol:150～180μL:0.54～0.84mmol。
优选地，所述脱BOC反应中，所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、浓盐酸和三乙胺的用量比为0.19mmol:100～150μL:0.5～1mL。
优选地，所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶和弱碱的摩尔比为1:1～1.2:10～15。
优选地，所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明和强碱的摩尔比为1:10～15。
优选地，所述强碱为氢氧化锂。
优选地，所述探针化合物与氯化铽的摩尔比为1:1。
本发明还提供了上述技术方案所述的荧光探针在检测次氯酸中的应用。
本发明提供了一种荧光探针，所述荧光探针具有式I所示结构：
本发明基于荧光共振能量传递(FRET)机理，以铽(Tb3+)配合物为能量供体，四甲基罗丹明衍生物为能量受体，提供了一种集比率检测、时间分辨荧光检测及荧光寿命检测于一身的多功能荧光探针，能够大大提高复杂样品中次氯酸检测的准确度，具体如下：(1)能量供体铽配合物具有超长的荧光寿命，基于其建立的时间分辨荧光分析技术，能够有效地消除测试样品中短寿命荧光信号的干扰，在复杂环境、生物样品的次氯酸检测中更具优势。(2)荧光探针与次氯酸作用前后，能够有效地调控铽配合物与四甲基罗丹明之间的FRET效率，使得荧光探针在两个不同波长处的荧光强度发生不同趋势的改变。因此，可以以这两个不同波长处荧光强度的比值作为检测信号，实现对次氯酸的检测，该信号不受激发光强度、探针浓度、样品测试环境等因素改变的影响，所以使检测结果具有更高的准确度。(3)在FRET前后，能量供体铽配合物的荧光寿命会随着次氯酸含量的改变而逐渐降低，因此，可以以铽配合物荧光寿命的变化作为检测信号，实现对次氯酸的检测，该寿命信号是荧光探针自身的固有属性，其亦不受激发波长、激发光和发射光强度、探针浓度、光漂白等因素的影响。因此，其测定结果具有很高的准确度。实施例的数据表明：本发明提供的荧光探针对次氯酸检测具有很高的选择性。
本发明还提供了上述技术方案所述的荧光探针的制备方法，本发明的制备方法简单，且成功制备得到了上述荧光探针。
附图说明
图1为荧光探针与不同浓度次氯酸反应后的时间分辨荧光发射光谱图；
图2为荧光探针基于时间分辨荧光强度比值用于次氯酸检测的工作曲线；
图3为荧光探针与不同浓度次氯酸反应后的荧光寿命图；
图4为荧光探针基于荧光寿命用于次氯酸检测的工作曲线；
图5为荧光探针与不同活性氧/活性氮作用后的时间分辨荧光强度比值图；
图6为荧光探针与不同活性氧/活性氮作用后的荧光寿命图。
具体实施方式
本发明提供了一种荧光探针，所述荧光探针具有式I所示结构：
本发明的荧光探针基于荧光共振能量传递(FRET)机理，以铽(Tb3+)配合物为能量供体，四甲基罗丹明衍生物为能量受体；使该荧光探针能够大大提高复杂样品中次氯酸检测的准确度。
本发明还提供了上述技术方案所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和有机溶剂混合，进行活化反应，得到活化反应液；
将所述活化反应液、三乙胺和2,4-二硝基苯肼混合，进行酰胺化反应，得到BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、有机溶剂、浓盐酸和三乙胺混合，进行脱BOC反应，得到哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶、CH3CN和弱碱混合，进行取代反应，得到四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、醇溶剂、强碱和水混合，进行酯基水解反应，得到荧光化合物；
将所述荧光化合物、氯化铽和水混合，进行配合反应，得到所述荧光探针。
本发明将连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)和有机溶剂混合，进行活化反应，得到活化反应液。
在本发明中，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的摩尔比优选为1:3～5:3～5，进一步优选为1:3:3。在本发明中，所述有机溶剂优选为CH2Cl2或CH3CN，进一步优选为CH2Cl2；本发明对所述有机溶剂的用量不做具体限定，只要能够将连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺充分溶解即可。
在本发明中，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物优选采用本领域人员熟知的制备方法进行制备即可，在本发明的具体实施例中，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物是按照现有技术(Dai,Z.C.；Tian,L.；Song,B.；et al.Chem.Sci.2017,8,1969-1976)制备得到。在本发明中，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物的结构如式II所示：
在本发明中，所述活化反应的温度优选为室温，所述活化反应的时间优选为2h；所述活化反应优选在搅拌的条件下进行。在本发明中，所述活化反应结束后，本发明优选将所得活化反应溶液过滤，得到所述活化反应液。
得到活化反应液后，本发明将所述活化反应液、三乙胺和2,4-二硝基苯肼混合，进行酰胺化反应，得到BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明。
在本发明中，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、三乙胺和2,4-二硝基苯肼的用量比优选为0.27mmol:150～180μL:0.54～0.84mmol，进一步优选为0.27mmol:150μL:0.54mmol。
在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为室温，即不需要额外的加热或降温；所述酰胺化反应的时间优选为2h；所述酰胺化反应优选在搅拌的条件下进行。
酰胺化反应结束后，本发明优选还包括将所得酰胺化反应液进行后处理；所述后处理优选包括以下步骤：
将所得酰胺化反应液蒸干，得到粗产品；将所得粗产品用少量CH2Cl2溶解后，采用洗脱剂在硅胶柱上进行层析分离，得到所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明。在本发明中，所述洗脱剂优选为CH3CN和H2O的混合溶液；所述洗脱剂中CH3CN和H2O的体积比优选为100:1。本发明对所述蒸干的温度和时间不做具体限定，能够将酰胺化反应液中的有机溶剂蒸干即可；本发明对所述层析分离的参数不做具体限定。
在本发明中，所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明的结构如式III所示：
在本发明中，所述活化反应和酰胺化反应的机理为：连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物中的羧基首先在N-羟基琥珀酰亚胺(羧基活化基团)和二环己基碳二亚胺(脱水剂)的作用下被活化，然后在弱碱三乙胺的作用下与次氯酸检测基团2,4-二硝基苯肼中的肼键发生酰胺化反应。
得到BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明后，本发明将所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、有机溶剂、浓盐酸和三乙胺(TEA)混合，进行脱BOC反应，得到哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明。
在本发明中，所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、浓盐酸和三乙胺的用量比优选为0.19mmol:100～150μL:0.5～1mL，进一步优选为0.19mmol:100μL:0.5mL。在本发明中，所述有机溶剂优选为CH2Cl2或CH3CN，进一步优选为CH2Cl2；本发明对所述有机溶剂的用量不做具体限定，只要能够使BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、浓盐酸和三乙胺充分溶解混合即可。
在本发明中，所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、有机溶剂、浓盐酸和三乙胺混合的方式优选为：将BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明溶于部分有机溶剂中，然后加入浓HCl，室温下搅拌0.5h后蒸干，然后加入剩余有机溶剂和三乙胺。本发明对所述部分有机溶剂和剩余有机溶剂的体积比不做具体限定，只要能够使BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明和三乙胺充分溶解即可。本发明对所述蒸干的温度和时间不做具体限定。
在本发明中，所述脱BOC反应的反应温度优选为室温，即不需要额外的加热或降温；所述脱BOC反应的反应时间优选为10min；所述脱BOC反应优选在搅拌的条件下进行。
脱BOC反应结束后，本发明优选包括将所得脱BOC反应液进行后处理；所述后处理优选包括以下步骤：将所得脱BOC反应液蒸干，得到粗产品；将所述粗产品用少量CH2Cl2溶解后，以CH3CN和H2O混合溶液为洗脱剂，在硅胶柱上进行层析分离，得到所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明。在本发明中，所述洗脱剂中CH3CN和H2O的体积比优选为8:1～5:1。本发明对所述蒸干的温度和时间不做具体限定，能够将脱BOC反应液中的有机溶剂蒸干即可；本发明对所述层析分离的参数不做具体限定。
在本发明中，所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明的结构如式IV所示：
在本发明中，BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明在强酸浓HCl的作用下，哌嗪结构中被保护的N原子发生脱BOC反应。
得到哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明后，本发明将所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶、CH3CN和弱碱混合，进行取代反应，得到四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明。
在本发明中，所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶和弱碱的摩尔比优选为1:1～1.2:10～15，进一步优选为1:1:10。
在本发明中，所述溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶优选采用本领域人员熟知的制备方法进行制备即可，在本发明的具体实施例中，所述溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶优选按照现有技术(Xiao,Y.N.；Ye,Z.Q.；Wang,G.L.；et al.Inorg.Chem.2012,51,2940-2946)制备得到。在本发明中，所述溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶的结构如式V所示：
在本发明中，所述弱碱优选为碳酸钾；本发明对所述CH3CN的用量不做具体限定，只要能够使所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶和弱碱充分混合即可。
在本发明中，所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶、CH3CN和弱碱混合的方式优选为：将哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明和溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶溶于CH3CN后，然后加入弱碱。
在本发明中，所述取代反应的方式优选为回流，所述取代反应的时间优选为12～15h。
取代反应结束后，本发明优选还包括将所得取代反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：将所得取代反应液冷却至室温后，过滤，所得滤液蒸干，所得粗产品用少量CH2Cl2溶解后，采用洗脱剂在硅胶柱上进行层析分离，得到所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明。在本发明中，所述洗脱剂优选为CH3CN和H2O的混合溶液；所述洗脱剂中CH3CN和H2O的体积比优选为5:1～2:1。本发明对所述蒸干和层析分离的参数不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的参数即可。
在本发明中，所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明的结构如式VI所示：
在本发明中，在溶剂CH3CN和弱碱K2CO3的作用下，哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明哌嗪中氮原子上的活泼氢与溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶中的溴甲基发生取代反应，从而将两化合物偶联起来。
得到四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明后，本发明将所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、醇溶剂、强碱和水混合，进行酯基水解反应，得到荧光化合物。
在本发明中，所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明和强碱的摩尔比优选为1:10～15，进一步优选为1:10；所述强碱优选为氢氧化锂。在本发明中，所述醇溶剂优选为乙醇；所述醇溶剂与水的体积比优选为10:1.5；本发明对所述醇溶剂和水的具体用量不做具体限定，只要满足上述体积比，且能够使四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明和强碱充分溶解混合即可。
在本发明中，所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、醇溶剂、强碱和水混合的方式优选为：将所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明和醇溶剂混合后，得到第一溶液；将所述强碱与水混合后，得到第二溶液；然后将所述第二溶液滴加到所述第一溶液中。
在本发明中，所述酯基水解反应的温度优选为室温，即不需要加热或降温；所述酯基水解反应的时间优选为12～15h。
酯基水解反应，本发明优选还包括将所得酯基水解反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：将所得酯基水解反应液蒸干，所得粗产品溶于水中，然后调节pH值为3，离心收集固体、干燥得到荧光化合物。本发明对所述蒸干的温度及时间不做具体限定，只要能够将酯基水解反应液中的溶剂去除即可；本发明对所述水的用量不做具体限定，只要能够将粗产品中能溶于水的物质全部溶解即可。本发明对调节pH值用试剂不做具体限定，只要能够使pH值为2～3即可。
在本发明中，所述荧光化合物的结构如式VII所示：
在本发明中，四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明在醇溶剂和水的混合溶剂中，在强碱LiOH的作用下，发生酯基水解反应，从而将结构中存在的四个酯基水解为羧基。
在本发明中，以连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物为起始原料制备所述荧光化合物的具体流程如式a所示：
得到荧光化合物后，本发明将所述荧光化合物、氯化铽和水混合，进行配合反应，得到所述荧光探针。
在本发明中，所述荧光化合物与氯化铽的摩尔比优选为1:1。本发明对所述水的用量不做具体限定，只要能够将所述荧光化合物和氯化铽充分混合即可。在本发明中，所述荧光化合物、氯化铽和水混合的方式优选为：将所述荧光化合物溶于水后，加入氯化铽。
在本发明中，所述配合反应的温度优选为室温，即不需要额外的加热或降温；所述配合反应的时间优选为0.5h；所述配合反应优选在震荡的条件下进行。
在本发明中，所述荧光探针优选置于水溶液中保存，不需要单独收集。
本发明还提供了上述技术方案所述的荧光探针在检测次氯酸中的应用。
在本发明中，所述荧光探针能够有效地消除激发波长、激发光和发射光强度、探针浓度、光漂白、样品测试环境改变及背景荧光信号等因素对测定的干扰，从而提高其对次氯酸的检测准确度。
下面结合实施例对本发明提供的荧光探针及其制备方法与应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所用药品：连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物和溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶按照文献方法合成(Xiao,Y.N.；Ye,Z.Q.；Wang,G.L.；etal.Inorg.Chem.2012,51,2940-2946；Dai,Z.C.；Tian,L.；Song,B.；et al.Chem.Sci.2017,8,1969-1976)；乙腈和四氢呋喃分别为经氢化钙和金属钠干燥处理蒸馏制得的试剂，其余各种常用溶剂均为市售分析纯试剂。
测试时所用仪器：核磁共振仪为Bruker DRX400；质谱仪为HP1100LC/MSD；元素分析仪为Vanio-EL CHN；荧光光谱仪为Perkin Elmer LS50B；紫外-可见分光光度计为PerkinElmer Lambda 35。
实施例1
荧光探针的合成：
BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明的合成：
将连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物(160mg，0.27mmol)，NHS(115mg，0.81mmol)和DCC(167mg，0.81mmol)溶于20mL CH2Cl2中后，室温搅拌2h，然后过滤，得到活化反应液；
将所述活化反应液置于100mL烧瓶中，依次加入150μL三乙胺和2,4-二硝基苯肼(107mg，0.54mmol)，继续搅拌2h后，蒸干，所得粗产品用少量CH2Cl2溶解后，以CH3CN和H2O混合溶液(VCH3CN:VH2O＝100:1)为洗脱剂，在硅胶柱上进行层析分离，得浅黄色固体(BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明)99mg，产率为47％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.49(s,9H),2.98(s,12H),3.47-3.53(m,8H),6.39(d,J＝8.0Hz,2H),6.55-6.60(m,3H),6.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.36(d,J＝8Hz,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.90(d,J＝8.0Hz,1H),8.05(s,1H),8.95-9.00(m,2H)。
ESI-MS(m/z)：779.3[M+H]+。
哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明的合成：
将BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明(178mg，0.19mmol)溶于10mL CH2Cl2中，然后加入100μL浓HCl，室温下搅拌0.5h后蒸干，然后加入5mL CH2Cl2和0.5mL三乙胺，继续搅拌10min；溶液蒸干，粗产品用少量CH2Cl2溶解后，以CH3CN和H2O混合溶液(VCH3CN:VH2O＝8:1)为洗脱剂，在硅胶柱上进行层析分离，得黄色固体(哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明)80mg，产率为62％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝2.93(s,12H),3.13-3.21(m,4H),3.85-3.91(m,4H),6.37(d,J＝8.0Hz,3H),6.53(d,J＝4.0Hz,2H),6.70(d,J＝12.0Hz,1H),7.36(d,J＝8.0Hz,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(d,J＝4.0Hz,4.0Hz,1H),8.07(s,1H),8.94(d,J＝4.0Hz,1H),9.00(s,1H)。
ESI-MS(m/z)：679.3[M+H]+。
四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明的合成：
将哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明(102mg，0.15mmol)和溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶(109mg，0.15mmol)溶于50mL干燥CH3CN后，加入无水K2CO3(207mg,1.5mmol)，回流过夜；溶液冷却至室温后，过滤，滤液蒸干，粗产品用用少量CH2Cl2溶解后，以CH3CN和H2O混合溶液(VCH3CN:VH2O＝5:1)为洗脱剂，在硅胶柱上进行层析分离，得黄色油状产品(四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明)110mg，产率为55％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.26(t,J＝4.0Hz,12H),2.93(s,12H),3.70-3.95(m,16H),4.18-4.21(m,14H),6.36(d,J＝8.0Hz,3H),6.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,2H),7.76(d,J＝2.0Hz,1H),7.83-7.91(m,3H),8.06(s,1H),8.44(s,2H),8.49(d,J＝8.0Hz,3H),8.94(d,J＝4.0Hz,1H),8.98(s,1H)。
ESI-MS(m/z)：1348.5[M+Na]+。
荧光化合物的合成
将四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明(110mg，0.083mmol)溶于10mL乙醇中，然后缓慢加入1.5mL LiOH(20mg，0.83mmol)的水溶液，室温下搅拌过夜；蒸干溶液后，将其溶于5mL水中，然后调节pH值为3，离心收集固体，干燥后得淡粉色固体(荧光化合物)69mg，产率为68％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝2.84(s,12H),3.48-3.52(m,12H),3.73-3.77(m,4H),4.07(s,6H),6.42-6.44(m,5H),6.95(d,J＝8.0Hz,1H),7.27(d,J＝4.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.0Hz,2H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(s,1H),7.95(t,J＝8.0Hz,3H),8.38(s,2H),8.46(d,J＝8.0Hz,2H),8.66(s,1H),9.10(s,1H)。
元素分析：理论值(％)for C61H59N13O15·4H2O：C 56.96，H 5.25，N 14.16；测定值(％)：C 56.70，H 5.24，N 14.01。
ESI-MS(m/z)：1213.4[M-H]-。
荧光探针溶液的合成
将荧光化合物(1.93mg，1.5μmol)溶于3mL水中，然后加入TbCl3·6H2O(0.56mg，1.5μmol)，室温下震荡0.5h后，得到荧光探针溶液。
荧光探针的性能表征：
在50mmol/L pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，向荧光探针溶液(15μmol/L)中加入不同浓度的次氯酸后，其与探针反应后，测试荧光探针与不同浓度次氯酸反应后的时间分辨荧光发射光谱，结果如图1所示。从图1可以看出：荧光探针在580nm处的时间分辨荧光强度逐渐增加，540nm处的时间分辨荧光强度逐渐降低。
以次氯酸浓度(0、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45μmol/L)为横坐标，荧光探针在565nm与540nm处的时间分辨荧光强度的比值为纵坐标(为了避免荧光探针在581nm处的荧光强度对罗丹明荧光强度的影响，选择荧光探针发光最弱的565nm处的荧光强度作为罗丹明的荧光强度值)，得到了荧光探针基于时间分辨荧光强度比值用于次氯酸检测的工作曲线，如图2所示。从图2可以看出：在次氯酸浓度为0～45μmol/L的范围内，荧光探针强度的比值与次氯酸浓度呈现良好的线性，线性相关系数为0.9996。因此，表明该荧光探针能够以比率时间分辨荧光信号实现对次氯酸的定量检测。
在50mmol/L pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，向荧光探针溶液(15μmol/L)中加入不同浓度的次氯酸后，所得荧光探针的寿命如图3所示。从图3可以看出：由于FRET过程的发生，使得荧光探针(15μmol/L)中能量供体铽配合物的荧光寿命逐渐降低。
以次氯酸浓度(0、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45μmol/L)为横坐标，荧光探针在540nm处的荧光寿命值为纵坐标，得到了荧光探针基于荧光寿命用于次氯酸检测的工作曲线，结果如图4所示。从图4可以看出：在次氯酸浓度为0～30μmol/L的范围内，荧光探针的荧光寿命值与次氯酸浓度呈现良好的线性，线性相关系数为0.99。结果表明：该荧光探针以荧光寿命作为检测信号实现对次氯酸的定量检测。
在50mmol/L pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，当荧光探针溶液(15μmol/L)分别与常见的活性氧、活性氮物种(浓度均为200μmol/L)一氧化氮、过氧化氢、单线态氧、过氧化亚硝基、羟基自由基和超氧阴离子作用后，所得荧光探针的时间分辨荧光强度比值和荧光寿命结果分别如图5和图6所示。从图5和图6可以看出：荧光探针与常见的活性氧、活性氮物种一氧化氮、过氧化氢、单线态氧、过氧化亚硝基、羟基自由基和超氧阴离子作用后，所得荧光探针的比率时间分辨荧光信号和荧光寿命信号均没有发生明显的变化；但是荧光探针与次氯酸作用后，其比率时间分辨荧光信号显著增强，荧光寿命信号显著降低。这一结果表明：荧光探针对次氯酸检测具有很高的选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有式I所示结构：
2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和有机溶剂混合，进行活化反应，得到活化反应液；
将所述活化反应液、三乙胺和2,4-二硝基苯肼混合，进行酰胺化反应，得到BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、有机溶剂、浓盐酸和三乙胺混合，进行脱BOC反应，得到哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶、CH3CN和弱碱混合，进行取代反应，得到四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明；
将所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、醇溶剂、强碱和水混合，进行酯基水解反应，得到荧光化合物；
将所述荧光化合物、氯化铽和水混合，进行配合反应，得到所述荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:3～5:3～5。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述酰胺化反应中，所述连有单BOC哌嗪的四甲基罗丹明衍生物、三乙胺和2,4-二硝基苯肼的用量比为0.27mmol:150～180μL:0.54～0.84mmol。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脱BOC反应中，所述BOC-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、浓盐酸和三乙胺的用量比为0.19mmol:100～150μL:0.5～1mL。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明、溴甲基-四乙酸乙酯基-联三吡啶和弱碱的摩尔比为1:1～1.2:10～15。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述四乙酸乙酯基-联三吡啶-哌嗪-2,4-二硝基苯肼-四甲基罗丹明和强碱的摩尔比为1:10～15。
8.根据权利要求2或7所述的制备方法，其特征在于，所述强碱为氢氧化锂。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述荧光化合物与氯化铽的摩尔比为1:1。
10.权利要求1所述的荧光探针在检测次氯酸中的应用。
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