CN110478494A - 一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物、其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物BP9a‑SS‑DOX，其中，BP9a为转铁蛋白受体靶向多肽类似物，肽序列为NH2‑Cys1‑Ala2‑His3‑Leu4‑His5‑Asn6‑Arg7‑Ser8‑OH；‑SS‑表示含二硫键的连接臂。本发明还提供上述转铁蛋白受体靶向多肽类似物－抗肿瘤药物偶联物的制备方法及其在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。本发明验证了该偶联物具有良好的肿瘤细胞选择性，能够靶向杀伤转铁蛋白受体过表达的肿瘤细胞，有利于降低阿霉素对转铁蛋白受体低表达的正常细胞的毒副作用。本发明为新型靶向转铁蛋白受体的抗肿瘤药物研发提供了科学依据，具有良好的开发前景和应用价值。

Description

一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物、其制备 方法与用途
【技术领域】
本发明涉及属于医药化学领域，具体涉及一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物，还涉及其制备方法与用途。
【背景技术】
阿霉素是临床广泛应用的肿瘤化学治疗药物之一，但由于缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤正常组织细胞，引起严重的毒副作用，给患者造成极大的痛苦，加之易引发耐药性等缺点，阿霉素的临床应用受到很大限制。因此，提高阿霉素对肿瘤组织细胞的选择性，降低其对正常组织细胞的毒副作用，实现其对肿瘤的靶向治疗对造福广大癌症患者具有重要的社会意义。
转铁蛋白受体(Transferrin receptor,TfR)是一种II型跨膜糖蛋白，能够介导转铁蛋白的细胞内吞作用从而参与铁离子的转运，被认为是维持铁平衡和调节细胞生长的重要调节蛋白。研究表明，TfR在正常组织细胞的表达量很低，而由于快速增殖的肿瘤细胞对铁的需求量增加，其在肝癌、乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌等肿瘤细胞表面均呈现过表达状态，这种差异化表达水平使得TfR成为抗肿瘤药物靶向给药的理想作用靶点，在恶性肿瘤发生发展中的作用也受到越来越多的关注。因此，TfR作为肿瘤分子生物学标志物具有重要研究价值和良好的应用前景。
多肽-药物偶联物(peptide-drug conjugates,PDC)是将抗肿瘤药物与肿瘤细胞靶向多肽载体通过适当的连接臂偶联在一起得到的复合物，是目前肿瘤药物学研究方向的热点之一，有可能成为肿瘤治疗的新途径。还原响应型药物递送系统通常含有分子内二硫键，能够被还原型谷胱甘肽(GSH)还原为巯基而发生断裂。研究表明，GSH在肿瘤组织的浓度比正常组织高十几倍，并且其在肿瘤细胞内的浓度远远高于细胞外的浓度，这使得通过二硫键连接的靶肽和药物能够在肿瘤细胞高浓度GSH微环境中被还原断裂，从而定位释放出抗癌药物。因此，构建还原响应性的肿瘤靶向多肽-药物偶联物，可以使弹头药物靶向富集在肿瘤组织，提高靶肽所携带的药物在肿瘤组织的释放效率，在保持弹头药物对肿瘤细胞杀伤活性的同时，还可以降低其对正常组织的毒性，对于研发新型高效低毒的抗肿瘤药物具有重要的意义。
【发明内容】
由于抗肿瘤药物阿霉素对肿瘤细胞缺乏选择性，在临床应用过程中会引发严重的毒副作用。为了提高阿霉素对肿瘤细胞的靶向杀伤作用，同时实现肿瘤细胞内的定位释药，本发明提供一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物，所述偶联物具有如下所示的结构:
BP9a-SS-DOX
其中，BP9a为转铁蛋白受体靶向多肽类似物，其肽序列为NH2-Cys1-Ala2-His3-Leu4-His5-Asn6-Arg7-Ser8-OH；DOX为抗肿瘤药物阿霉素；-SS-表示含二硫键的连接臂。
在本发明中，所述连接臂具有下式所示的结构：
因此，所述偶联物具有下式所示的结构：
本发明还提供上述转铁蛋白受体靶向多肽－阿霉素偶联物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备BP9a
采用固相多肽合成法，在N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)存在的条件下由9-芴甲氧羰基保护氨基的丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)和取代度为0.6～1.3mmol/g的2-CTC树脂反应得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，其中2-CTC树脂与DIPEA和Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩尔比为1：2～6：2～6；所得Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂经过体积浓度为20％～40％的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液除去Fmoc保护基团后，以N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)为缩合试剂，按照肽序列从C端向N端逐步偶联氨基酸得到全保护肽树脂，其中Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂、所述缩合试剂DIC/HOBt和Fmoc-氨基酸的摩尔比为1：2～6/2～6：2～6，偶联时间为1～3h；按照质量体积比为1g:5～10mL的比例向所述全保护肽树脂中加入体积比为94/2.5/2.5/1的三氟乙酸(TFA)/1,2-乙二硫醇(EDT)/H2O/三异丙基硅烷(TIS)的裂解液切肽并脱除侧链保护基团，室温反应1～3h后将体系减压浓缩，然后用8～10倍于反应浓缩液体积的冰乙醚沉降、洗涤，所得固体用反相高效液相色谱纯化、冷冻干燥后得到BP9a纯品；
(2)制备阿霉素衍生物
将阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)和三乙胺(TEA)用无水N,N-二甲基亚砜(DMF)溶解，其中DOX·HCl、SPDP和TEA的摩尔比为1：1.0～1.5：1.5～2.5，60～80℃搅拌反应5～7h；薄层层析法(展开剂为体积比为10～15：1的二氯甲烷/甲醇体系)监控反应进程，反应完毕后用硅胶柱层析法分离纯化阿霉素衍生物(DOX-SS-Pyr)，所用流动相为体积比为15～25：1的二氯甲烷/甲醇体系；
(3)BP9a与阿霉素衍生物的偶联
将步骤(1)得到的BP9a与步骤(2)得到的DOX-SS-Pyr用无水D MF溶解，其中BP9a和DOX-SS-Pyr的摩尔比为1：1.0～3.0；N2保护下室温搅拌反应12～18h，反应完毕后用8～10倍于反应液体积的冰乙醚沉降、洗涤，所得固体用反相高效液相色谱纯化、冷冻干燥后得到所述B P9a-SS-DOX偶联物。
本发明还提供上述BP9a-SS-DOX偶联物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。其中，所述肿瘤是肝癌、乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、神经胶质瘤和慢性淋巴细胞性白血病等。
实验证明，本发明的BP9a-SS-DOX偶联物在与浓度为5mM的还原型谷胱甘肽(GSH)的PBS溶液37℃共孵育条件下可以高效释放出阿霉素衍生物；该偶联物对TfR过表达的肿瘤细胞(如人肝癌细胞)具有良好的增殖抑制活性，而且这种增殖抑制活性是由TfR靶向多肽BP9与TfR特异性结合介导的内吞作用实现的；同时该偶联物对TfR低表达的正常细胞(如人正常肝细胞)的毒性较小，因此具有良好的肿瘤细胞选择性。上述结果表明本发明所制备的靶向多肽-阿霉素偶联物有利于提高阿霉素对肿瘤细胞的选择性，并能降低阿霉素对正常细胞的毒副作用，为新型靶向TfR的抗肿瘤药物的研发提供了科学依据并奠定了良好基础，具有潜在的开发前景和应用价值。
【附图说明】
图1BP9a-SS-DOX偶联物的合成路线图；
图2BP9a-SS-DOX偶联物的体外释药特性；
图3流式细胞仪分析BP9a-SS-DOX偶联物和DOX分别被HepG2人肝癌细胞(a)和L-O2人正常肝细胞(b)的摄取及TfR竞争性阻断实验；其中，图3a中，从左到右的四个峰分别对应对照、BP9a-SS-DOX+BP9、BP9a-SS-DOX和DOX；图3b中，从左到右的三个峰分别对应对照、BP9a-SS-DOX和DOX；
图4激光共聚焦显微镜观察BP9a-SS-DOX偶联物和DOX分别被HepG2细胞(a)和L-O2细胞(b)的摄取、细胞内定位及TfR竞争性阻断实验；
图5BP9a-SS-DOX偶联物(a)和DOX(b)对HepG2细胞和L-O2细胞的体外细胞毒活性；其中，左侧柱对应HepG2，右侧柱对应L-O2。
【具体实施方式】
在本发明中使用的缩写具有下面的含义：
TfR 转铁蛋白受体
DOX·HCl 阿霉素盐酸盐
SPDP 3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯
2-CTC 2-氯三苯甲基氯
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Ser 丝氨酸
Arg 精氨酸
Asn 天冬酰胺
His 组氨酸
Leu 亮氨酸
Ser 丝氨酸
Ala 丙氨酸
Cys 半胱氨酸
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Trt 三苯甲基
tBu 叔丁基
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
TFA 三氟乙酸
TEA 三乙胺
EDT 1,2-乙二硫醇
TIS 三异丙基硅烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DCM 二氯甲烷
RP-HPLC 反相高效液相色谱
ESI-MS 电喷雾质谱
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在以下实施例中，2-CTC树脂购自天津南开和成科技有限公司；Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH为成都诚诺新科技有限公司产品；DIC、HOBt、DIPEA和TIS购自苏州昊帆生物科技有限公司；DOX·HCl为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；Cell CountingKit-8(CCK-8，MCE，USA)购自上海皓元生物科技有限公司；DAPI试剂盒(即用型)和抗荧光衰减剂购自北京索莱宝科技有限公司；SPDP和TFA购自百灵威科技有限公司；EDT为Amresco公司产品；DMF、DCM、哌啶、TEA和乙醚等均为市售分析纯试剂；甲醇、乙腈为市售色谱纯试剂。
实施例1 TfR靶向肽BP9a的合成
参照文献李松涛,赵红玲,尹志峰,等.肝癌细胞转铁蛋白受体靶向多肽类似物BP9a的合成[J].化学与生物工程.2018,35:27-29的记载，2-CTC树脂(1.3mmol/g,5mmol)与Fmoc-Ser(tBu)-OH(15mmol)在DIPEA(15mmol)作用下反应得到Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC树脂，其中2-CTC树脂与DIPEA和Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩尔比为1：3：3；所得Fmoc-Pro-CTC树脂用体积浓度为20％的哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基团，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc保护基团被成功脱除；应用Fmoc/tBu交叉保护策略，以DIC(22.5mmol)/HOBt(22.5mmol)为缩合试剂，按照标准Merrifield多肽固相合成法从C端向N端依次缩合剩余Fmoc-氨基酸(22.5mmol)，其中Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂、缩合试剂DIC/HOBt和Fmoc-氨基酸的摩尔比为1：4.5/4.5：4.5；反应时间2h，得到BP9a全保护肽树脂。按照质量体积比为1g:10mL的比例向所得产物中加入配比为TFA/EDT/H2O/TIS(94/2.5/2.5/1,V/V)的裂解液切肽并脱除侧链保护基团，室温反应2h后将反应液浓缩，然后用10倍于反应浓缩液体积的冰乙醚沉降、洗涤三次，所得固体经真空干燥至恒重后用反相高效液相色谱纯化、冷冻干燥后得到BP9a纯品，RP-HPLC分析纯度为98.4％；ESI-MS：m/z，[M+H]+：938.2(理论值)，937.6(实验值)。
实施例2阿霉素与SPDP的反应
参照文献Yoon S,Kim WJ,Yoo HS.Dual-responsive breakdown ofnanostructures with high doxorubicin payload for apoptoticanticancertherapy.Small.2013,9(2):284-293的记载，称取DOX·HCl(17.4mg,30μmol)与SPDP(11.2mg,36μmol)，用DMSO(5mL)溶解，再加入TEA(6.25μL,45μmol)，50℃搅拌反应，薄层色谱(展开剂：DCM:甲醇，13:1，v:v)监控反应进程，反应6h后将目标产物DOX-S-S-Pyr用硅胶柱色谱分离纯化(流动相：DCM：甲醇，20:1，v:v)，并经RP-HPLC和ESI-MS予以表征。RP-HPLC分析纯度为95.7％；ESI-MS：m/z，[M+H]+：741.5(理论值)，741.3(实验值)。
实施例3 BP9a-SS-DOX偶联物的合成
实施例1得到的BP9a(14.1mg，15μmol)与实施例2得到的DO X-SS-Pyr(13.3mg，18μmol)用无水DMF(5mL)溶解，其中BP9a与DOX-SS-Pyr的摩尔比为1：1.2；N2保护下室温搅拌反应，RP-HPLC监控反应进程，反应完毕后将反应液用冰乙醚(50mL)沉降，离心后沉淀用冰乙醚洗涤(20mL×3)，最后经半制备反相高效液相色谱纯化、冷冻干燥后得到目标偶联物BP9a-SS-DOX。RP-HPLC分析纯度为97.6％；ESI-MS：m/z，[M+H]+：1566.7(理论值)，1566.8(实验值)；[M+2H]2+：783.8(理论值)，784.1(实验值)。
实施例4 BP9a-SS-DOX偶联物在GSH溶液中的释药特性
DMSO溶解实施例3得到的BP9a-SS-DOX偶联物，分别加入浓度为5mM或5μM的GSH的PBS溶液，涡旋均匀，得到待测样品溶液(BP9a-SS-DOX偶联物的终浓度为100μM，DMSO体积比为1％)，37℃恒温孵育，不同时间点取样100μL进行RP-HPLC分析，以0h孵育体系中原型偶联物的峰面积积分值为100％，根据不同取样时间点孵育体系中原型偶联物的峰面积积分值计算其原型偶联物随时间变化的保留百分含量，释药结果见图2。由图2可知，随着孵育时间的延长，BP9a-S S-DOX偶联物在5mM的GSH溶液中原型量逐渐降低，24小时原型偶联物的剩余百分比仅为2.4％，即超过97％的阿霉素衍生物(DOX-SH)从该偶联物中释放出来；而在5μM的GSH溶液中，BP9a-SS-DOX偶联物相对比较稳定，孵育24小时后不足25％的DOX-SH从偶联物中释放。以上结果表明，BP9a-SS-DOX偶联物在高浓度GSH环境下可以快速高效地释放出DOX-SH。
实施例5药物细胞摄取与细胞内定位实验
选择TfR过表达的HepG2人肝癌细胞和TfR低表达的L-O2人正常肝细胞为模型，应用流式细胞术检测DOX与BP9a-SS-DOX偶联物被两种细胞的摄取情况，使用激光共聚焦显微镜分别观察DOX与BP9a-SS-DOX偶联物在两种细胞内的定位。HepG2细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、链霉素的DMEM培养液中，L-O2细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、链霉素的RPMI-1640培养液中，在恒温37℃，5％CO2培养箱中培养，隔3天传代。
流式细胞实验：取对数生长期的细胞接种于6孔板(约2.5×105个细胞/孔)中，在37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育24h。分别加入DOX和BP9a-SS-DOX偶联物的药物溶液(等同于DOX浓度为5μM)，37℃下作用3h，弃去各孔内的药物溶液，每孔用PBS洗三遍，加入胰酶消化细胞，2000rpm离心10min，沉淀细胞用PBS洗三遍并重新悬浮于PBS溶液中，用流式细胞仪(BD FACSCalibur,USA)分析。
激光共聚焦显微镜：取对数生长期的细胞接种于6孔板(约5×104个细胞/孔)中的盖玻片上，在37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育24h。分别加入DOX和BP9a-SS-DOX偶联物的药物溶液(等同于DOX浓度为5μM)，37℃下作用3h，弃去各孔内的药物溶液，每孔用PBS洗三遍，加入4％多聚甲醛固定30min，弃去固定液，每孔再用PBS洗三遍，用DAPI试剂盒染色10min，取出盖玻片置于滴有抗荧光衰减剂的载玻片上，置于激光共聚焦显微镜观察。
细胞摄取与细胞内定位实验结果见图3和图4。图3流式细胞术分析结果表明DOX在HepG2和L-O2细胞内的荧光强度相似；DAPI可以将细胞核染色并发出蓝色荧光，DOX具有红色自发荧光，激光共聚焦显微镜结果表明DOX均主要分布在两种细胞的细胞核中(图4a、4b第一行，蓝色荧光与红色荧光重合)，表明DOX可以进入两种细胞，对肝癌细胞缺乏选择性。流式细胞术结果显示BP9a-SS-DOX偶联物在HepG2细胞内被检测到的的荧光强度明显高于L-O2细胞；激光共聚焦显微镜结果表明该偶联物可以进入HepG2肝癌细胞并且主要分布于细胞质及核周部位(图4a第二行，红色荧光)，而其几乎不能进入L-O2正常肝细胞(图4b第二行，无可见红色荧光)。上述结果提示BP9a-SS-DOX偶联物进入HepG2细胞的途径与DOX不同，可能是通过HepG2细胞表面过表达的TfR介导的内吞作用进入细胞。
实施例6 TfR竞争性抑制实验
为了进一步验证BP9a-SS-DOX偶联物进入HepG2细胞是通过TfR介导的内吞作用这一假设，采用TfR竞争性抑制实验进行验证。取对数生长期的HepG2细胞，分别接种于6孔板(约2.5×105个细胞/孔)中或6孔板(约5×104个细胞/孔)中的盖玻片上，在37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育24h。分别加入含BP9(20μM)的培养基溶液预处理，孵育2h后吸除培养基，再分别加入BP9a-SS-DOX偶联物的药物溶液(等同于DOX浓度为5μM)作用3h，然后按照实施例5的流式细胞实验和激光共聚焦显微镜实验方法分别处理细胞，考察TfR竞争性抑制对HepG2细胞摄取BP9a-SS-DOX偶联物的影响。
TfR抑制实验结果显示：HepG2细胞经过BP9(一种对TfR具有高亲和性的多肽，肽序列为NH2-Ala1-His2-Leu3-His4-Asn5-Arg6-Ser7-OH)预作用后，其细胞表面过表达的TfR被预先占据，BP9a-SS-DOX偶联物被HepG2细胞摄取后细胞内的荧光强度明显低于未经BP9预处理组的HepG2细胞(图3a蓝色和绿色曲线、图4a第二行与第三行红色荧光强度)。上述实验结果表明BP9a-SS-DOX偶联物很有可能是通过BP9a与TfR的特异性结合，并通过TfR介导的内吞作用进入HepG2细胞，这为该偶联物对肿瘤细胞的选择性杀伤活性奠定了基础。
实施例7体外细胞毒活性实验
取对数生长期的HepG2或L-O2细胞接种于96孔板(约5000个细胞/孔)中，37℃，5％CO2条件下孵育24h。采用CCK-8法分别测定DOX与BP9a-SS-Dox偶联物对两种细胞的体外细胞毒活性。DMSO分别溶解DOX与BP9a-SS-DOX偶联物，用无血清培养基稀释得到梯度浓度药液，分别取不同浓度的药液100μL加入到各孔中，37℃孵育48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，于37℃孵育3h后，在450nm处用酶标仪测量每个孔的OD值，根据公式计算抑制率。
体外细胞毒活性实验结果见图5。由于DOX缺乏选择性，其对HepG2肝癌细胞(IC501.03±0.13μM)和L-O2正常肝细胞(IC500.44±0.11μM)均具有较强的毒性杀伤作用；而BP9a-SS-DOX偶联物对HepG2细胞表现出良好的增殖抑制活性(IC506.21±1.12μM)，且该增殖抑制活性具有浓度依赖性。但是BP9a-SS-DOX偶联物对L-O2细胞的毒性较之DOX显著降低，表明本发明得到的多肽-药物偶联物对肝癌细胞具有选择性杀伤作用。这一结果与L-O2细胞表面低表达TfR，偶联物不能通过TfR介导的内吞作用进入细胞有关。
本发明通过一系列实验验证BP9a-SS-DOX偶联物对TfR受体过表达肿瘤细胞的选择性杀伤作用。BP9a-SS-DOX偶联物通过BP9a与TfR的特异性结合，并通过TfR介导的内吞作用进入HepG2细胞内，偶联物含有的分子内二硫键在肿瘤细胞内还原条件下(高浓度GSH)发生断裂，释放出阿霉素衍生物(DOX-SH)，从而起到杀伤肿瘤细胞的作用。因此，本发明设计、合成的BP9a-SS-DOX偶联物具有TfR靶向性和还原响应性药物释放的双重特点，为新型TfR靶向的高效低毒抗肿瘤药物研发奠定了基础，具有良好的应用前景。

Claims (6)

1.一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物，其特征在于所述偶联物具有如下所示的结构:
BP9a-SS-DOX
其中，BP9a为转铁蛋白受体靶向多肽类似物，其肽序列为NH2-Cys1-Ala2-His3-Leu4-His5-Asn6-Arg7-Ser8-OH；DOX为抗肿瘤药物阿霉素；-SS-表示含二硫键的连接臂。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于所述连接臂具有下式所示的结构：
3.一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备BP9a
采用固相多肽合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由9-芴甲氧羰基保护氨基的丝氨酸和取代度为0.6～1.3mmol/g的2-CTC树脂反应得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，其中2-CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺与9-芴甲氧羰基保护氨基的丝氨酸的摩尔比为1：2～6：2～6；所得Fmoc-Pro-CTC树脂经过体积浓度为20％～40％的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液除去Fmoc保护基团后，以N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑为缩合试剂，按照肽序列从C端向N端逐步偶联氨基酸得到全保护肽树脂，其中Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂、所述缩合试剂和Fmoc-氨基酸的摩尔比为1：2～6/2～6：2～6，偶联时间为1～3h；按照质量体积比为1g:5～10mL的比例向所述全保护肽树脂中加入体积比为94/2.5/2.5/1的三氟乙酸/1,2-乙二硫醇/H2O/三异丙基硅烷的裂解液切肽并脱除侧链保护基团，室温反应1～3h后将体系减压浓缩，然后用8～10倍于反应浓缩液体积的冰乙醚沉降、洗涤，所得固体用反相高效液相色谱纯化、冷冻干燥后得到BP9a纯品；
(2)制备阿霉素衍生物
将阿霉素盐酸盐、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和三乙胺用无水N,N-二甲基亚砜溶解，其中阿霉素盐酸盐、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和三乙胺的摩尔比为1：1.0～1.5：1.5～2.5，60～80℃搅拌反应5～7h，以体积比为10～15：1的二氯甲烷/甲醇体系为展开剂通过薄层层析法监控反应进程，反应完毕后用硅胶柱层析法分离纯化阿霉素衍生物DOX-SS-Pyr，所用流动相为体积比为15～25：1的二氯甲烷/甲醇体系；
(3)BP9a与阿霉素衍生物的偶联
将步骤(1)得到的BP9a与步骤(2)得到的阿霉素衍生物用N,N-二甲基甲酰胺溶解，其中BP9a和阿霉素衍生物的摩尔比为1：1.0～3.0；N2保护下室温搅拌反应12～18h，反应完毕后用8～10倍于反应液体积的冰乙醚沉降、洗涤，所得固体用反相高效液相色谱纯化、冷冻干燥后得到所述BP9a-SS-DOX偶联物。
4.根据权利要求1或2所述的BP9a-SS-DOX偶联物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述肿瘤是肝癌、乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、神经胶质瘤或慢性淋巴细胞性白血病。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述肿瘤优选地是肝癌。
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