CN110452815A - 一种dna聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片及其方法，芯片包括混合单元，PCR反应单元，破碎洗脱单元，转化单元；所述混合单元与PCR反应单元通过管道连接，所述PCR反应单元与破碎洗脱单元通过管道连接，所述破碎洗脱单元与转化单元管道连接；混合单元用于将单个细菌与PCR Mix混合包裹于同一油相液滴中；PCR反应单元用于收集细菌‑PCR Mix微液滴并进行PCR反应；破碎洗脱单元用于破碎油包水微液滴、去除破碎后的杂质和吸附质粒；转化单元包含转化腔，迭代菌株收集管道，感受态菌株注入腔；转化单元用于生成迭代菌株。本发明还公开了采用上述的DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选的方法，可以高效的实现定向进化菌株的筛选和迭代。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学，基因工程学领域，具体是一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片及其方法。
背景技术
DNA聚合酶，又称DNA依赖的DNA聚合酶(DNA—dependent DNA polymerase，DNApol)，它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。分子克隆中常用的DNA聚合酶有Taq、Klen Taq、Stoffel Fragment、Tth、Pfu、Vent、Deep Vent和UlTma等，它们是现代分子生物学技术领域中不可或缺的重要工具，而获得稳定性好、扩增速度快、保真性高、低成本的DNA聚合酶一直是科研工作者的孜孜不倦的追求。
通过定向突变方法获得功能改进的新型蛋白，是目前一种应用广泛、效率高的蛋白进化方式，而定向突变获取目的蛋白方法的成功高度依赖于研究人员从海量突变菌株中识别目标蛋白的能力，从大量突变中精准筛选对于花费和人力都是一个巨大的挑战。
传统的DNA聚合酶定向筛选利用突变菌自身表达的突变型DNA聚合酶扩增自身的突变质粒，在特定的扩增条件下，高效率的突变型DNA聚合酶可以得到更多的突变质粒产物，通过循环迭代的过程，优势突变得到富集，从而得到一个表达高效DNA聚合酶的突变文库。整个筛选过程繁琐、周期长，包含一系列的重复步骤。
本发明设计一种连续定向进化菌株筛选芯片，把实验过程中的重复步骤分类为重复单元，将重复单元中包含的所有步骤集中在一张芯片上，简化了实验操作流程，提高了自动化水平，减少了人为操作失误。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，适应现实发展，提供一种快速、简便、自动化程度高实现DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选的芯片及其方法。
本发明所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，所述芯片本体包括混合单元，PCR反应单元，破碎洗脱单元，转化单元；所述混合单元与PCR反应单元通过管道连接，所述PCR反应单元与破碎洗脱单元通过管道连接，所述破碎洗脱单元与转化单元管道连接。
所述混合单元包含油相通道，菌液通道，PCR Mix通道，zig-zag通道；其中油相通道的末端与zig-zag通道的首端相连，菌液通道、PCR Mix通道分别与油相通道侧壁联通，PCR Mix通道相对于菌液通道更靠近油相通道末端，PCR Mix通道与zig-zag通道之间的油相管道外侧放置外置正极电极及外置负极电极，混合单元用于将单个细菌与PCR Mix包裹于同一油包水微液滴中。
所述PCR反应单元包含PCR反应池，温控单元，单向阀门I；其中PCR反应池的一端与zig-zag通道的末端相连，PCR反应池的另一端与单向阀门I入口端相连，温控单元(21)置于PCR反应池(9)外侧用于控制PCR反应池温度；PCR反应单元用于收集细菌-PCR Mix微液滴并进行PCR反应。
所述破碎洗脱单元包含液滴破碎管道，洗脱液I腔，洗脱液Ⅱ腔，DNA吸附管道，单向阀门II，单向阀门III，废液收集单管道；液滴破碎管道一端与单向阀门I出口端相连，液滴破碎管道另一端连接洗脱液I腔和DNA吸附管道；DNA吸附管道连接单向阀门II和单向阀门III的入口端；所述DNA吸附管道含有DNA吸附柱，用于吸收破碎液中的DNA；单向阀门II出口端与废液收集管道相连。破碎洗脱单元用于破碎油包水微液滴、去除破碎后的杂质和吸附质粒。
所述转化单元包含转化腔，迭代菌株收集管道，感受态菌株注入腔；转化腔分别与感受态菌株注入腔、单向阀门III出口端管道连接；迭代菌株收集管道位于转化腔下方，转化单元用于生成迭代菌株。
进一步，所述油相通道直径为100～500μm。
进一步，所述zig-zag通道是连续弯曲管道，流道的临界半径为50μm。
进一步，所述液滴破碎管道11外侧覆盖长度为1000～2000μm外置高压电极，电压为100～2000V，频率为500-10kHz。
进一步，所述外置正极电极与外置负极之间电压为500～2000V。
更进一步，所述菌液通道，PCR Mix通道，洗脱液I腔，洗脱液II腔，感受态菌株注入腔都含有注射孔，可以通过注射泵向注射孔内注射相应溶液。
本发明还公开了利用上述装置进行Taq DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选的方法，包括如下步骤：
步骤S1，向菌液通道注入OD600＝0.6～0.8的菌液10μL，进入油相通道后，包裹成单细胞液滴；
步骤S2，向PCR Mix通道注入PCR Mix(含primer、ddNTP、buffer、SYBR GREENⅠ)溶液，上述单细胞液滴流经PCR Mix通道口时通过高压电极的作用与PCR Mix液滴融合；
步骤S3，经过zig-zag通道将液滴中的PCR体系充分混匀，进入PCR反应池；
步骤S4，PCR反应池下方的温控单元提供PCR反应的温度循环，反应如下：预加热95℃时间10min；循环加热30次，每次循环为加热时间95℃时间10s、加热54℃时间10s、然后72℃时间12s结束；循环加热结束降温到4℃时间10min；PCR反应的温度循环反应结束，反应过程由荧光检测系统实时监控；
步骤S5，利用负压使反应液滴通过单向阀门I进入液滴破碎通道，以通道壁两侧高压电极电击使液滴破碎释放DNA；
步骤S6，混合液流经DNA吸附柱时DNA被吸附，其它液体通过单向阀门II由废液收集管排出；
步骤S7，注入洗脱液I冲洗残渣，废液通过单向阀门II由废液收集管排出；
步骤S8，注入洗脱液II洗脱DNA，溶解DNA的洗脱液通过单向阀门III进入转化腔；
步骤S8，通过感受态注入腔向转化腔中加入大肠杆菌感受态，进行转化；
步骤S9，转化后的迭代菌株经由迭代菌株收集管道在EP管中完成迭代菌株收集、活化、诱导，准备进入下一轮筛选。
与现有技术相比，本发明具有如下特点和进步：
本发明公布一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片及其方法，芯片包括混合单元，PCR反应单元，破碎洗脱单元，转化单元；所述混合单元与PCR反应单元通过管道连接，所述PCR反应单元与破碎洗脱单元通过管道连接，所述破碎洗脱单元与转化单元管道连接；混合单元用于将单个细菌与PCR Mix包裹于同一油包水微液滴中；PCR反应单元用于收集细菌-PCR Mix微液滴并进行PCR反应；破碎洗脱单元用于破碎油包水微液滴、去除破碎后的杂质和吸附质粒；转化单元包含转化腔，迭代菌株收集管道，感受态菌株注入腔；转化单元用于生成迭代菌株。本发明相对于传统的培育方法，周期性更短，提高了实验操作的自动化水平，省去了大量的人工劳动，降低了人为操作失误的风险，可以短时间内完成DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选及培育工作。
附图说明
图1为一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片的结构示意图；
图2为一种蛋白连续定向进化菌株筛选芯片的液滴破碎管道剖面图；
图3为一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片的PCR反应单元剖面图；
符号表示：
混合单元1，PCR反应单元2，破碎洗脱单元3，转化单元4；油相通道5，菌液通道6，PCR Mix通道7，zig-zag通道8；PCR反应池9，单向阀门I10；液滴破碎管道11，外置高压电极111，洗脱液I腔12，DNA吸附管道13，单向阀门II14，单向阀门III15，洗脱液II腔16；废液收集管道17，转化腔18，感受态菌株注入腔19；迭代菌株收集管道20，DNA吸附柱131，温控单元21，外置正极电极51，外置负极电极52。
具体实施方式
本发明中PCR Mix溶液是指用于PCR反应按照最佳配比混合含primer、ddNTP、buffer、SYBR GREENⅠ在一起的混合液，其中SYBR GREENⅠ是用于实施监控PCR反应过程的荧光染料。
下面结合附图1，附图2，附图3对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，所述芯片本体包括混合单元1，PCR反应单元2，破碎洗脱单元3，转化单元4；所述混合单元1与PCR反应单元2通过管道连接，所述PCR反应单元2与破碎洗脱单元3通过管道连接，所述破碎洗脱单元3与转化单元4管道连接。所述混合单元1包含油相通道5，菌液通道6，PCR Mix通道7，zig-zag通道8；其中油相通道5的末端与zig-zag通道8的首端相连，菌液通道6、PCR Mix通道7分别与油相通道5侧壁联通，PCR Mix通道7相对于菌液通道6更靠近油相通道5末端，PCR Mix通道7与zig-zag通道8之间的油相管道外侧放置外置正极电极51及外置负极电极52；菌液通道6上有菌液加样孔，PCR Mix通道7有PCR Mix加样孔；混合单元1用于将单个细菌与PCR Mix包裹于同一油包水微液滴中。
如图3所述PCR反应单元2包含PCR反应池9，温控单元21，单向阀门I10；其中PCR反应池9的一端与zig-zag通道8的末端相连，PCR反应池9的另一端与单向阀门I10入口端相连，温控单元21置于PCR反应池9外侧用于控制PCR反应池温度；PCR反应单元2用于收集细菌-PCR Mix微液滴并进行PCR反应。所述破碎洗脱单元3包含液滴破碎管道11，洗脱液I腔12，DNA吸附管道13，单向阀门II14，单向阀门III15，洗脱液II腔16,废液收集管道17；液滴破碎管道11一端与单向阀门I10出口端相连，液滴破碎管道11另一端通过管道连接洗脱液I腔12、洗脱液II腔16及DNA吸附管道13；DNA吸附管道13连接单向阀门II14和单向阀门III15的入口端；所述DNA吸附管道13含有DNA吸附柱131；单向阀门II14出口端与废液收集管道17相连；破碎洗脱单元3用于破碎油包水微液滴、去除破碎后的杂质和吸附质粒。所述转化单元4包含转化腔18，迭代菌株收集管道20，感受态菌株注入腔19；转化腔18分别与感受态菌株注入腔19、单向阀门III15出口端及迭代菌株收集管道20管道连接；转化单元4用于生成迭代菌株。所述油相通道5直径为100～500μm，使得菌株包裹成单细胞液滴。所述zig-zag通道8是连续弯曲管道，流道的临界半径为50μm，使得含单细胞和PCR Mix(含primer、ddNTP、buffer、SYBR GREENⅠ)的液滴在zig-zag通道8流道充分混匀。所述菌液通道6，PCR Mix通道7，洗脱液I腔12，洗脱液II腔16，感受态菌株注入腔19都含有注射孔，可以通过注射泵向管道内注射相应溶液。
如图2所示所述液滴破碎管道11外侧覆盖长度为1000～2000μm外置高压电极111，电压为100～2000V，频率为500-10kHz，可以使液滴破碎释放DNA。
本发明还公开了上述DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选的方法，包括如下步骤：
步骤S1，向菌液通道6注入OD600＝0.6～0.8的菌液10μL，进入油相通道5后，包裹成单细胞液滴；
步骤S2，向PCR Mix通道7注入PCR Mix(含primer、ddNTP、buffer、SYBR GREENⅠ)溶液，液滴流经PCR Mix通道7口时通过高压电极的作用与PCR Mix液滴融合；
步骤S3，经过zig-zag通道8将液滴中的PCR体系充分混匀，进入PCR反应池9；
步骤S4，PCR反应池9下方的温控单元21提供PCR反应的温度循环，反应如下：预加热95℃时间10min；循环加热30次，每次循环为加热时间95℃时间10s、加热54℃时间10s、然后72℃时间12s结束；循环加热结束降温到4℃时间10min；PCR反应的温度循环反应结束，反应过程由荧光检测系统实时监控；
步骤S5，利用负压使反应液滴通过单向阀门I10进入液滴破碎通道，以通道壁两侧高压电极电击使液滴破碎释放DNA；
步骤S6，混合液流经DNA吸附柱131时DNA被吸附，其它液体通过单向阀门II14由废液收集管排出；
步骤S7，洗脱液I腔12注入洗脱液I冲洗残渣，废液通过单向阀门II14由废液收集管排出；
步骤S8，洗脱液II腔16注入洗脱液II洗脱DNA，溶解DNA的洗脱液通过单向阀门III15进入转化腔18；
步骤S8，向转化腔18中加入大肠杆菌感受态，进行转化；
步骤S9，转化后的迭代菌株经由迭代菌株收集管道20在EP管中完成迭代菌株收集、活化、诱导，准备进入下一轮筛选。
实施例1
本实施例采用所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，突变Taq DNA长度为2500bp，搭载长度为5400bp的pET28a载体构成质粒，取OD600＝0.6～0.8，含有上述质粒的大肠杆菌菌液10μL，用注射泵通过菌液通道上的注射孔注入，PCR Mix通道上的注射孔注入PCR Mix(含primer、ddNTP、buffer、SYBR GREENⅠ)溶液，菌液流入油相通道(5)直径为150μm的油相管道，包裹成单细胞液滴；单细胞液滴流经PCR Mix通道口时，由于PCR Mix通道口附近的1000V高压电极作用，使得液滴和PCR Mix溶液融合，然后通过直径为100μm的zig-zag通道进一步混合；混合后的液滴完全进入PCR反应池，PCR反应池下方的温控单元控制温度预加热95℃时间10min；循环加热30次，每次循环为加热时间95℃时间10s、加热54℃时间10s、然后72℃时间12s结束；循环加热结束降温到4℃时间10min；通过荧光检测系统实时监控PCR腔中的反应过程；由于突变的Taq DNA模板与其表达的突变Taq酶共存于同一反应液滴中，并设置特定的引物，使得PCR扩增的产物即为突变Taq酶的DNA模板；设定的12s扩增时间内，工作效率不同的突变型Taq酶所扩增的DNA产物占比会出现差异，工作效率低的Taq酶甚至无法扩增完整的全长模板DNA，进而无法完成后续的转化；PCR反应完成后，打开单向阀门I，微反应液滴由PCR反应池流入到液滴破碎管道，液滴破碎管道外含有1500μm、1000V、频率为5kHz的高压电极，由于高压电极作用，微反应液滴破裂，所有PCR产物被释放出来；破碎后的溶液流入DNA吸附管道其中的DNA被DNA吸附柱吸附，吸附完成后由洗脱液I腔上的注射孔注射洗脱液I，清洗DNA吸附柱上残留非DNA杂质；清洗完成后由洗脱液II腔上的注射孔注射洗脱液II,使得DNA由DNA吸附柱上脱落，并通过单向阀门III进入转化腔；DNA进入转化腔后转化加入的感受态大肠杆菌生成迭代突变株；由于高工作效率的突变型Taq酶积累了占比较高的模板数量，所以新生成的含有突变Taq DNA的迭代突变株中，高酶活的突变株占比优势突出，经过几轮迭代后，优势继续扩大直至淘汰其它突变型。
上述实施例仅是本发明的较优实施方式，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.本发明所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述芯片本体包括混合单元(1)，PCR反应单元(2)，破碎洗脱单元(3)，转化单元(4)；所述混合单元(1)与PCR反应单元(2)通过管道连接，所述PCR反应单元(2)与破碎洗脱单元(3)通过管道连接，所述破碎洗脱单元(3)与转化单元(4)管道连接。
2.根据权利要求1所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述混合单元(1)包含油相通道(5)，菌液通道(6)，PCR Mix通道(7)，外置高压电极，zig-zag通道(8)；其中油相通道(5)的末端与zig-zag通道(8)的首端相连，菌液通道(6)、PCR Mix通道(7)分别与油相通道(5)侧壁联通，PCR Mix通道(7)相对于菌液通道(6)更靠近油相通道(5)末端，PCR Mix通道(7)与zig-zag通道(8)之间的油相管道外侧放置外置正极电极(51)及外置负极电极(52)；混合单元(1)用于生成包含单个细菌与PCR Mix的油包水微液滴。
3.根据权利要求2所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述PCR反应单元(2)包含PCR反应池(9)，温控单元(21)，单向阀门I(10)；其中PCR反应池(9)的一端与zig-zag通道(8)的末端相连，PCR反应池(9)的另一端与单向阀门I(10)入口端相连，温控单元(21)置于PCR反应池(9)外侧用于控制PCR反应池温度；PCR反应单元(2)用于包裹菌液与PCR Mix溶液的微液滴的PCR反应。
4.根据权利要求3所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述破碎洗脱单元(3)包含液滴破碎管道(11)，洗脱液I腔(12)，DNA吸附管道(13)，单向阀门II(14)，单向阀门III(15)，洗脱液II腔(16),废液收集管道(17)；液滴破碎管道(11)一端与单向阀门I(10)出口端相连，液滴破碎管道(11)另一端连接洗脱液管道和DNA吸附管道(13)；DNA吸附管道(13)连接单向阀门II(14)和单向阀门III(15)的入口端；所述DNA吸附管道(13)含有DNA吸附柱(131)；单向阀门II(14)出口端与废液收集管道(17)相连；破碎洗脱单元(3)用于破碎油包水微液滴、去除破碎后的杂质和吸附质粒。
5.根据权利要求4所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述转化单元(4)包含转化腔(18)，迭代菌株收集管道(20)，感受态菌株注入腔(19)；转化腔(18)分别与感受态菌株注入腔(19)、单向阀门III(15)出口端及迭代菌株收集管道(20)管道连接；转化单元(4)用于生成迭代菌株。
6.根据权利要求2所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述油相通道(5)直径为100-500μm。
7.根据权利要求2所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述zig-zag通道是连续弯曲管道，流道的临界半半径为50μm。
8.根据权利要求4所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述液滴破碎管道(11)外侧覆盖长度为1000～2000μm外置高压电极(111)，电压为100～2000V，频率为500-10kHz。
9.根据权利要求5所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片，其特征在于，所述菌液通道(6)，PCR Mix通道(7)，洗脱液I腔(12)，洗脱液II腔(16)，感受态菌株注入腔(19)都含有注射孔。
10.根据权利要求1所述的一种DNA聚合酶连续定向进化菌株筛选芯片用于菌株筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，向菌液通道(6)注入OD600＝0.6～0.8的菌液10μL，进入油相通道(5)后，包裹成单细胞液滴；
步骤S2，向PCR Mix通道(7)注入PCR Mix(含primer、ddNTP、buffer、SYBR GREEN Ⅰ)溶液，上述单细胞液滴流经PCR Mix通道(7)口时通过高压电极作用与PCR Mix液滴融合；
步骤S3，经过zig-zag通道(8)将液滴中的PCR体系充分混匀，进入PCR反应池(9)；
步骤S4，PCR反应池(9)下方的温控单元(21)提供PCR反应的温度循环，反应如下：预加热95℃时间10min；循环加热30次，每次循环为加热时间95℃时间10s、加热54℃时间10s、然后72℃时间12s结束；循环加热结束降温到4℃时间10min；PCR反应的温度循环反应结束，反应过程由荧光检测系统实时监控；
步骤S5，利用负压使反应液滴通过单向阀门I进入液滴破碎通道，以通道壁两侧高压电极电击使液滴破碎释放DNA；
步骤S6，混合液流经DNA吸附柱(131)时DNA被吸附，其它液体通过单向阀门II由废液收集管排出；
步骤S7，洗脱液I腔(12)注入洗脱液I冲洗残渣，废液通过单向阀门II由废液收集管排出；
步骤S8，洗脱液II腔(16)注入洗脱液II洗脱DNA，溶解DNA的洗脱液通过单向阀门III进入转化腔(18)；
步骤S8，通过感受态菌株注入腔(19)向转化腔(18)中加入大肠杆菌感受态，进行转化；
步骤S9，转化后的迭代菌株经由迭代菌株收集管道(20)由EP管收集、活化、诱导，准备进入下一轮筛选。
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