CN110448519A

CN110448519A - 人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110448519A
Application number: CN201910796407.2A
Authority: CN
Inventors: 胡春梅; 王海江; 王静; 肖萍
Original assignee: Xi'an Aierfei Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Xi'an Aierfei Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110448519B

Abstract

本发明公开了人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，按质量百分比由以下组分组成：人成纤维细胞调节培养浓缩液20.0％～50.0％、卵磷脂2.0％～8.0％、三油酸甘油酯0.5～2.0％、抗氧化剂0.1％～4.0％、稳定剂0.4％～8.0％、甘草酸二钾0.2％～8.0％、丙二醇6.0％～27.0％，柠檬酸缓冲液15.0～49.0％，以上各组分质量百分比之和为100％。本发明还公开了上述脂质体的制备方法，其得到的脂质体粒径均一，PDI分布小，可常温保存18个月，在保留了人成纤维细胞调节培养液活性的同时解决了人成纤维细胞调节培养液保存期短，存储条件苛刻的问题。同时本发明公开了人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体在美容护肤技术领域中的应用。

Description

人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学美容护肤技术领域，具体涉及一种人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，具体还涉及上述人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法，本发明还涉及该柔性脂质体在美容护肤技术领域的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，人们对于美容保养越来越重视，市场上的美容保养品种类繁多，但大都只能停留在皮肤表面起到物理屏障的作用，不能透过皮肤屏障，从肌底解决皮肤问题，并且现有的美容产品不具有生物学活性，不能有效促进细胞的新陈代谢，改善皮肤问题。

人成纤维细胞调节培养液含有丰富的活性细胞生长因子及胶原蛋白，并且其生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。但是人成纤维细胞调节培养液属于生物活性制品，其富含的活性细胞生长因子及胶原蛋白极易失活，存储条件特别苛刻，需要冷冻或冷藏保存，并且将其直接添加到霜膏、乳液、面膜等产品中，常温条件下极易失活，达不到美容护肤的效果，极大的限制了其在美容护肤技术领域的应用。

柔性脂质体(如Transfersome和Ethosome)作为有效的透皮载体具有独一无二多样性的功能，能转运不同的药物，而不需要考虑其大小、结构、分子量或极性。柔性脂质体具有独特的变形性和穿透机理，使其可以以完整的形式，在皮肤水化力的作用下，变形穿透皮肤屏障，由角质层细胞间通道进入皮下组织，达到发挥疗效的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，能够保留人成纤维细胞调节培养液细胞生长因子及胶原蛋白的活性，从而提高了人成纤维细胞调节培养液的活性保存期、透皮吸收性及生物利用度。

本发明的第二个目的在于提供上述人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体在美容护肤技术领域中的应用，解决现有美容用人成纤维细胞调节培养液直接应用效果不明显或配伍性性差的问题。

本发明所采用的技术方案是，人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，按质量百分比由以下组分组成：人成纤维细胞调节培养浓缩液20％～50％、卵磷脂2.0％～8.0％、三油酸甘油酯0.5～2.0％、抗氧化剂0.1％～4.0％、稳定剂0.4％～8.0％、甘草酸二钾0.2％～8.0％、丙二醇6.0％～27.0％，柠檬酸缓冲液15～49％，以上组分质量百分比之和为100％。

本发明的特征还在于，

人成纤维细胞调节培养浓缩液为无血清人成纤维细胞调节培养液经过超滤浓缩后得到，其总蛋白含量为10～20mg/mL；

抗氧化剂为番茄红素、辅酶Q10、愈创树脂、类胡萝卜素、二丁基化羟基甲苯、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E醋酸酯、姜黄素、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚中的一种或多种；

稳定剂为蛋氨酸、精氨酸、辛酸、聚山梨酯、PEG400、胆酸钠，去氧胆酸钠中的一种或多种；

人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体粒径为190～210nm；

本发明所采用的第二个技术方案是，人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，按质量百分比分别称取以下原料：人成纤维细胞调节培养浓缩液20.0％～50.0％、卵磷脂2.0％～8.0％、三油酸甘油酯0.5～2.0％、抗氧化剂0.1％～4.0％、稳定剂0.4％～8.0％、甘草酸二钾0.2％～8.0％、丙二醇6.0％～27.0％，柠檬酸缓冲液15.0～49.0％，以上组分质量百分比之和为100％；

步骤2，将步骤1称取的卵磷脂、三油酸甘油酯和抗氧化剂溶解于无水乙醇中，在水浴条件下搅拌，使其完全溶解，得醇相溶液；

步骤3，将步骤1称取的甘草酸二钾和稳定剂加入到柠檬酸缓冲液中得混合溶液；

步骤4，将步骤3得到的混合溶液滴加到步骤2的醇相溶液中，边滴加边搅拌，滴加完成后，超声形成W/O型初乳，并将初乳转移到旋转蒸发瓶中，充入N₂，旋转蒸发除去乙醇；

步骤5，将步骤4所得W/O型初乳，采用高压微射流进行循环处理，即可得粒径均一的W/O型初乳；

步骤6，将步骤1称取的人成纤维细胞调节培养浓缩液与丙二醇混合均匀后，滴加到步骤5所得W/O型初乳中，水浴条件下，进行磁力搅拌，搅拌完成后，在冰水浴中超声，即可得到W/O/W型人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体。

本发明采用的第二种技术方案的特点还在于，

步骤2中卵磷脂、三油酸甘油酯和抗氧化剂总质量与无水乙醇加入的质量之比为1:2～1:5.5，三油酸甘油酯与卵磷脂的质量比为1:1～1:16；抗氧化剂与卵磷脂的质量比1:2～1:20，水浴温度为30～50℃，搅拌时间为10～20min，搅拌速率为500～800r/min；步骤3中稳定剂与卵磷脂的质量比1:1～1:5；甘草酸二钾与卵磷脂的质量比1:1～1:10；柠檬酸缓冲液的与醇相溶液的质量之比为1:10～16:5。

步骤4中滴加速度为10mL/min，搅拌速度为500～800r/min，滴加完成后，搅拌10～15min，超声温度30～40℃，超声时间15～25min，超声功率300w，超声完成后，旋转蒸发除去乙醇，水浴温度为20～35℃。

步骤5中微射流的压力为200MPa以下，循环处理次数为3～5次，得到的W/O型初乳粒径为180～200nm。

本发明的第三个技术方案是，人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，在美容护肤技术领域中的应用。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明采用脂质体技术将人成纤维细胞调节培养液进行包裹，并制备成纳米级柔性脂质体，粒径均一，PDI分布小，可常温保存18个月，在保留了人成纤维细胞调节培养液活性的同时解决了人成纤维细胞调节培养液保存期短，存储条件苛刻的问题。

2.本发明制备的人成纤维细胞调节培养液纳米柔性脂质体中含有丙二醇和甘草酸二钾。丙二醇是一种保湿剂，甘草酸二钾是一种具有抗炎、抗过敏、同时具有保湿功效的化妆品原料，将这两种物质添加到纳米柔性脂质体中，不仅使脂质体本身具有了保湿、抗炎、抗过敏功效，而且增加了磷脂双分子层的流动性和柔性，使其在传递过程中发生变形，更易通过比其粒径小的间隙，达到肌底层，解决了培养液中活性成分透皮吸收难的问题，并且提高了人成纤维细胞调节培养液的生物利用度。

3.本发明制备的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，可以直接进行应用，也可以以任意比例添加到膏霜、乳剂、面膜等产品中，拓宽了其在生物医学美容护肤技术领域的应用。

附图说明

图1为本发明人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备工艺流程图；

图2为本发明实施例1～3所得人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的粒径随储存时间的变化图；

图3为本发明实施例1～3所得人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的Zeta电位绝对值随储存时间的变化图；

图4为本发明实施例2所得人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体与未经包裹的人成纤维细胞调节培养浓缩液总蛋白体外累积经皮渗透量随时间变化图；

图5为本发明所得人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体与未经包裹的人成纤维细胞调节培养浓缩液在不同储存时间的OD值。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，按照质量百分比由以下组分组成：人成纤维细胞调节培养浓缩液20.0％～50.0％、卵磷脂2.0％～8.0％、三油酸甘油酯0.5～2.0％、抗氧化剂0.1％～4.0％、稳定剂0.4％～8.0％、甘草酸二钾0.2％～8.0％、丙二醇6.0％～27.0％，柠檬酸缓冲液15.0～49.0％，以上组分质量百分比之和为100％。

上述人成纤维细胞调节培养浓缩液为无血清人成纤维细胞调节培养液经过超滤浓缩后得到，其总蛋白含量为10～20mg/mL。

上述无血清人成纤维细胞调节培养液的获取过程如下：

(1)人成纤维细胞的提取：

取经过适合性检查手术后青少年(5-10岁)包皮组织，清理剪碎，PBS洗涤，胶原酶消化后离心，弃上清，沉淀加培养基吹打成细胞悬液，接种于培养瓶中，加入含10％FBS的完全培养液，放置于培养箱中培养。待细胞达80％融合时进行传代，将P1代到P5代细胞作为种子细胞进行冻存；

(2)人成纤维细胞的扩增培养：

取种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80％～90％时，将胰蛋白酶消化细胞，采用人成纤维细胞无血清培养基进行传代培养，传代培养条件为：37℃，5％CO₂；

(3)收集无血清人成纤维细胞调节培养液：

收集传代(P6到P15代)培养过程中的人成纤维细胞调节培养上清液，即得无血清人成纤维细胞调节培养液。

上述抗氧化剂为番茄红素、辅酶Q10、愈创树脂、类胡萝卜素、二丁基化羟基甲苯、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E醋酸酯、姜黄素、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚中的一种或多种；稳定剂为蛋氨酸、精氨酸、辛酸、聚山梨酯、PEG400、胆酸钠，去氧胆酸钠中的一种或多种。

上述人成纤维细胞调节培养液柔性脂质的粒径为190～210nm。

丙二醇是一种保湿剂，添加到纳米柔性脂质体中，不仅使脂质体本身具有保湿性能，改变了角质层脂质的相变温度，增强其流动性和柔韧性。还可增强脂质体膜的流动性和柔性，使其在传递过程中发生变形，更易通过比其粒径小的间隙，达到肌底层，解决了培养液中活性成分透皮吸收的问题；

甘草酸二钾是一种局部有抗炎、抗过敏、保湿功效的化妆品原料，添加到纳米柔性脂质体中，不仅使该脂质体具有了抗炎、抗过敏、保湿功效，而且使卵磷脂的相变温度下降，干扰磷脂层的构象，增加了磷脂双分子层的流动性，产生变形性，促进人成纤维细胞调节培养液中活性成分的透皮吸收，提高了人成纤维细胞调节培养液的生物利用度；

如图1所示，为本发明人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备工艺流程图，具体操作步骤如下：

步骤1，制备人成纤维细胞调节培养浓缩液：在无菌环境下，将无血清人成纤维细胞调节培养液采用0.8μm和0.45μm的囊式滤器进行过滤，除去培养上清液中的细胞碎片，然后将滤液采用超滤装置进行超滤浓缩后得到，其总蛋白含量为10～20mg/mL；

步骤2，按组分分别称取2.0～8.0％的卵磷脂、0.5～2.0％的三油酸甘油酯和0.1～4.0％的抗氧化剂并溶解于无水乙醇中，在30～50℃的水浴条件下，以500～800r/min的速度搅拌10～20min，使其完全溶解，得醇相溶液；

上述卵磷脂、三油酸甘油酯和抗氧化剂总质量与无水乙醇的加入的质量之比为1:2～1:5.5；三油酸甘油酯与卵磷脂的质量比为1:1～1:16；抗氧化剂与卵磷脂的质量比1:2～1:20。

步骤3，按组分分别称取0.2～8.0％的甘草酸二钾和0.4～8.0％的稳定剂并加入到15.0～49.0％pH为6.5的柠檬酸缓冲液中，得混合溶液；

上述稳定剂与卵磷脂的质量比1:1～1:5；甘草酸二钾与卵磷脂的质量比1:1～1:10；柠檬酸缓冲液的与醇相溶液的质量之比为1:10～16:5。

步骤4，将步骤3得到的混合溶液滴加到步骤2的醇相溶液中，边滴加边搅拌，滴加速度为10mL/min，搅拌速度为500～800r/min，滴加完成后，继续搅拌10～15min，在20～35℃水浴条件下进行超声形成W/O型初乳，超声温度30～40℃，超声时间15～25min，超声功率300w。超声完成后，将初乳转移到旋转蒸发瓶中，充入N₂，控制温度为20～35℃，旋转蒸发除去乙醇；

步骤5，将步骤4所得的W/O型初乳，采用200MPa以下的微射流循环处理3～5次，即可得粒径为180～200nm的W/O型初乳；

步骤6，按组分分别称取20.0～50.0％的人成纤维细胞调节培养浓缩液与6.0～27.0％的丙二醇并混合均匀，在水浴温度为20～30℃的条件下，滴加到步骤5所得W/O型初乳中并进行磁力搅拌，滴加速度为10mL/min，搅拌速度为300～600r/min，滴加完成后继续搅拌30～60min，完成后，在冰水浴中超声10～15min，即可得到W/O/W型人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体。

本发明所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体可以以任意比例添加到霜膏、乳液、面膜等产品中。

本发明所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体采用0.22μm无菌滤器过滤除菌，即可得到无菌人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，可直接应用于激光美容术、光子嫩肤术或其他美容术后皮肤的修复和养护中。

实施例1

人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其制备方法如下：

步骤1，制备人成纤维细胞调节培养浓缩液：在无菌环境下，将无血清人成纤维细胞调节培养液采用0.8μm和0.45μm的囊式滤器进行过滤，除去培养上清液中的细胞碎片。然后将滤液采用超滤装置进行超滤浓缩后得到，其总蛋白含量为20mg/mL；

步骤2，称取4000mg卵磷脂、4000mg三油酸甘油酯和200mg的辅酶Q10溶解于16.4mL的无水乙醇中，在50℃的水浴条件下，以800r/min的速度搅拌20min，使其完全溶解，得醇相溶液；

步骤3，称取400mg甘草酸二钾、800mg精氨酸加入到96.6mLpH 6.5的柠檬酸缓冲液中得混合溶液；

步骤4，将步骤3得到的混合溶液滴加到步骤2的醇相溶液中，边滴加边搅拌，滴加速度为10mL/min，搅拌速度为500r/min，滴加完成后，搅拌10min，水浴条件下进行超声形成W/O型初乳，超声温度30℃，超声时间15min，超声功率300w，超声完成后，将初乳转移到旋转蒸发瓶中，充入N₂，控制温度为20℃，旋转蒸发除去乙醇；

步骤5，将步骤4所得W/O型初乳，采用高压微射流在200MPa下，循环处理3次，即可得平均粒径为200nm的W/O型初乳；

步骤6，量取40mL人成纤维细胞调节培养浓缩液与54mL丙二醇混合均匀后，滴加到步骤5所得W/O型初乳中并进行磁力搅拌，滴加速度为10mL/min，水浴温度为20℃，搅拌速度为300r/min，滴加完成后继续搅拌30min，完成后，在冰水浴中超声10min，即可得到W/O/W型人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体。

本实施例得到的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其中，人成纤维细胞调节培养浓缩液20.0％，卵磷脂2.0％，三油酸甘油酯2.0％，抗氧化剂0.1％，稳定剂0.4％，甘草酸二钾0.2％，丙二醇27.0％，柠檬酸缓冲液48.3％，以上组分的质量百分比之和为100％。

本实施例制备的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，平均粒径为210nm，PDI为0.198，可以常温保存18个月。

实施例2

人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其制备方法如下：

步骤1，制备人成纤维细胞调节培养浓缩液：在无菌环境下，将无血清人成纤维细胞调节培养液采用0.8μm和0.45μm的囊式滤器进行过滤，除去培养上清液中的细胞碎片。然后将滤液采用超滤装置进行超滤浓缩后得到，其总蛋白含量为15mg/mL；

步骤2，称取10.0g卵磷脂、1.2g三油酸甘油酯、450mg番茄红素和450mg类胡萝卜素，溶解于66.6mL无水乙醇中，在40℃的水浴条件下，以650r/min的速度搅拌15min，使其完全溶解，得醇相溶液；

步骤3，称取1.8g甘草酸二钾、2.0g蛋氨酸和1.3g辛酸加入到76.8mLpH6.5的柠檬酸缓冲液中得混合溶液；

步骤4，将步骤3得到的混合溶液滴加到步骤2的醇相溶液中，边滴加边搅拌，滴加速度为10mL/min，搅拌速度为700r/min，滴加完成后，搅拌13min，水浴条件下进行超声形成W/O型初乳，超声温度35℃，超声时间20min，超声功率300w。超声完成后，将初乳转移到旋转蒸发瓶中，充入N₂，控制温度为25℃，旋转蒸发除去乙醇；

步骤5，将步骤4所得W/O型初乳，采用高压微射流在200MPa下，循环处理4次，即可得平均粒径为191nm W/O型初乳；

步骤6，量取70mL人成纤维细胞调节培养浓缩液与36mL丙二醇混合均匀后，滴加到步骤5所得W/O型初乳中并进行磁力搅拌，滴加速度为10mL/min，水浴温度为25℃，搅拌速度为450r/min，滴加完成后继续搅拌45min，完成后，在冰水浴中超声13min，即可得到W/O/W型人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体。

本实施例得到的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其中，人成纤维细胞调节培养浓缩液35.0％，卵磷脂5.0％，三油酸甘油酯0.6％，抗氧化剂0.45％，稳定剂1.65％，甘草酸二钾0.9％，丙二醇18.0％，柠檬酸缓冲液38.4％，以上各组分的质量百分比之和为100％。

本实施例制备的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，平均粒径为201nm，PDI为0.203，可以常温保存18个月。

实施例3

人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其制备方法如下：

步骤1，制备人成纤维细胞调节培养浓缩液：在无菌环境下，将无血清人成纤维细胞调节培养液采用0.8μm和0.45μm的囊式滤器进行过滤，除去培养上清液中的细胞碎片。然后将滤液采用超滤装置进行超滤浓缩后得到，其总蛋白含量为10mg/mL；

步骤2，称取8000mg卵磷脂、500mg三油酸甘油酯、1000mg抗坏血酸棕榈酸酯、1000mg维生素E醋酸酯、1000mg愈创树脂和1000mg姜黄素，溶解于47.5mL的无水乙醇中，在30℃的水浴条件下，以500r/min的速度搅拌10min，使其完全溶解，得醇相溶液；

步骤3，称取8.0g甘草酸二钾、2.0g蛋氨酸、2.5g去氧胆酸钠、1.0g PEG400和2.5g聚山梨酯-80加入到15mLpH 6.5的柠檬酸缓冲液中得混合溶液；

步骤4，将步骤3得到的混合溶液滴加到步骤2的醇相溶液中，边滴加边搅拌，滴加速度为10mL/min，搅拌速度为800r/min，滴加完成后，搅拌15min，水浴条件下进行超声形成W/O型初乳，超声温度40℃，超声时间25min，超声功率300w。超声完成后，将初乳转移到旋转蒸发瓶中，充入N₂，控制温度为35℃，旋转蒸发除去乙醇；

步骤5，将步骤4所得W/O型初乳，采用高压微射流在200MPa下，循环处理5次，即可得平均粒径为180nm W/O型初乳。

步骤6，量取50mL人成纤维细胞调节培养浓缩液与6.5mL丙二醇混合均匀后，滴加到步骤5所得W/O型初乳中并进行磁力搅拌，滴加速度为10mL/min，水浴温度为30℃，搅拌速度为600r/min，滴加完成后继续搅拌60min，完成后，在冰水浴中超声15min，即可得到W/O/W型人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体。

本实施例得到的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其中，人成纤维细胞调节培养浓缩液50.0％，卵磷脂8.0％，三油酸甘油酯0.5％，抗氧化剂4.0％，稳定剂8.0％，甘草酸二钾8.0％，丙二醇6.5％，柠檬酸缓冲液15.0％，以上各组分的质量百分比之和为100％。

本实施例得到的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，平均粒径为190nm，PDI为0.143，可以常温保存18个月。

对本发明的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的各项性能进行检测。

1.储存稳定性考察

分别取实施例1、实施例2和实施例3所制备的常温保存0、6、12、18、24个月的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体1mL，采用马尔文激光粒度仪测定柔性脂质体的粒径大小及Zeta电位。平均粒径及Zeta电位变化结果如图2、图3所示。从图2中可以看出人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的粒径在常温保存18个月内，其平均粒径基本没变化，但常温保存24个月后，其平均粒径稍有增大，增大的范围为13～20nm，可能是由于脂质体在放置过程中，由于粒子间的相互接近、融合而使粒径变大，聚集所造成的。从图3中可以看出人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的粒径在常温保存18个月内，其Zeta电位绝对值基本没变化，变化幅度不超过10％，且其绝对值均在40mV以上，说明荷电粒子非常稳定，但常温保存24个月后，Zeta电位绝对值有所下降，下降幅度为30％左右，但其绝对值仍在30mV以上，说明荷电粒子较稳定，但存在聚集的风险。

2.体外透皮实验

选取体重2.0～2.5kg的家兔，处死后取其腹部的皮，剪去皮上的长毛，用剃须刀剃去剩余的毛，至皮肤裸露，务必使皮完好无损；除去皮下脂肪，得到厚度均匀的离体兔皮，确保皮肤表面无明显的破损与裂隙。采用改良的Franz透皮扩散仪，研究人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体体外经皮渗透性。分别于0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h从取样口取2mL样品注入液相色谱仪进行检测，计算人成纤维细胞调节培养液总蛋白的累积透过量。

按下式计算人成纤维细胞调节培养液总蛋白累积透过量：

其中，C_n和C_i分别为第n、i个取样点测得的药物浓度(μg/mL)；A为透皮面积(cm²)；Q为不同时间单位面积的累积透过量(μg/cm²)；V₀为接收池的体积(mL)；V_i为每次取样的体积(mL)。

图4为本发明实施例2所得人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体与未经包裹的相同总蛋白浓度的人成纤维细胞调节培养浓缩液总蛋白的体外累积经皮渗透量随时间变化图；从图4中可以看出，经过24h的体外透皮实验，人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体总蛋白的累积经皮渗透量可达1134μg/cm²，而未经包裹的人成纤维细胞调节培养浓缩液总蛋白的累积经皮渗透量为350μg/cm²，包裹之后的累积经皮渗透量是未包裹的3.2倍。这是因为人成纤维细胞调节培养液中含有很多大分子的活性物质，很难透过皮肤屏障，到达肌底层，但柔性脂质体具有独特的变形性和穿透机理，使其可以以完整的形式，在皮肤水化力的作用下，变形穿透皮肤屏障，由角质层细胞间通道进入皮下组织，达到发挥疗效的作用。

3.活性考察

将本发明所制备的常温保存0、6、12、18、24个月的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体采用维持培养液稀释到与人成纤维细胞调节培养液总蛋白浓度相同约为1mg/mL，作为样品组1(0个月)、样品组2(6个月)、样品组3(12个月)、样品组4(18个月)、样品组5(24个月)。对照组为常温保存0、6、12、18、24个月的人成纤维细胞调节培养液，标记为对照组1(0个月)、对照组2(6个月)、对照组3(12个月)、对照组4(18个月)、对照组5(24个月)。

评判标准：其OD值下降20％以上，即为活性失效。

采用MTT法进行活性考察，靶细胞为L929细胞，检测样品组与对照组在培养72时，对L929细胞增殖能力的影响，即活细胞数量越多，光密度值(OD)就越高，表示所测样品的活性越高。通过酶标仪检测在干预培养72h时其OD值大小。其检测结果如图5所示，从图5中可以得出储存时间为0、6、12、18个月时人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体作用于L929细胞与新制备的人成纤维细胞调节培养液的OD值无明显差别，其OD值变化范围在7％以内，但在存储时间为24个月时，其OD值下降了30.7％。但人成纤维细胞调节培养液常温保存6个月以上时，其OD值较新制备的人成纤维细胞调节培养液下降了93.9％，表明其活性成分已全部失活。由此可以说明，通过脂质体技术将人成纤维细胞调节培养液进行包裹，可以保存其活性，延长其活性保存期限。

4.功效性评价实验

4.1人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体直接应用于美容术后皮肤的功效评价

将本发明的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体采用0.22μm无菌滤器过滤除菌后，直接应用于激光美容术、光子嫩肤术或其他美容术后皮肤的修复和养护中。

本发明临床实验是对60位美容术后患者进行研究，每天早晚各使用受试产品一次，一周为一疗程，连续使用4周。根据治疗前后症状、体征积分，按以下标准进行功效评价：(1)痊愈：症状、体征积分减少≥95％；(2)显效：症状、体征积分减少70％～95％；(3)有效：症状、体征积分减少30％～70％；(4)无效：症状、体征减少＜30％；(5)痊愈+显效+有效的例数计算总有效率。参照面部敏感皮炎标准进行症状评分，具体临床症状及评分观察指征见表1。

计算公式为：(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分×100％

其临床结果见表2，从表中可以看出，术后患者症状、体征积分减少≥95％的人数为41人，占总人数的68.83％；术后患者症状、体征积分减少70％～95％的人数为12人，占总人数的20.0％；术后患者症状、体征积分减少30％～70％的人数为4人，占总人数的6.67％；术后患者症状、体征积分减少＜30％的人数为2人，占总人数的3.33％。综上人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体总有效率为96.67％，说明其直接应用可有效改善激光美容术、光子嫩肤术或其他美容术后皮肤以及敏感性皮肤、皮炎等原因造成的受损皮肤屏障修复和护理情况。

表1

表2

n	临床治愈	显效	有效	无效
					60人	41人(68.83％)	12人(20.0％)	4人(6.67％)	2人(3.33％)

4.2人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体添加到化妆品中的功效评价

将本发明的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体添加到润肤乳中形成含有活性成分的润肤乳，采用此润肤乳进行人体功效评价。人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体润肤乳成分见表3。

表3

润肤乳的制备方法为：A相、B相加热至75℃后，在快速搅拌下将A相加入到B相中搅拌15min，加入C相继续搅拌10min，然后均质3min(6000r/min)，继续搅拌降温，搅拌速率为600r/min，降温至30℃时加入D相，继续搅拌15min后出料。

选择60位皮肤无敏感史，年龄在30～55周岁的女性，进行功效评价试验。受试者每天早晚各使用一次，连续使用8周，测试期间受试者不可使用除测试样品以外的任何护肤品。在产品使用前，使用8周后，采用德国CK公司CM825型水分测试仪检测受试者皮肤含水量，采用MicroSkinⅡ多功能皮肤图像分析系统测试受试者皮肤粗糙度和皮肤弹性。

本次功效测试的60位受试者，在连续8周的使用过程中，受试者无任何强烈刺激性、烧灼感，刺痛，瘙痒和皮肤潮红等不良反应发生。95.3％的使用者认为本款人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体润肤乳肤感良好，主观认为可以起到增加皮肤水含量和皮肤弹性，降低皮肤粗糙度的作用。

通过仪器测量，对数据分析可得出：在连续使用4周后，93％的受试者其皮肤水含量增加了25.7％以上，89％的受试者其皮肤弹性增加了8.5％以上，84％的受试者其皮肤算术平均粗糙度降低了7.9％；在连续使用8周后，93％的受试者其皮肤水含量增加了43.9％以上，89％的受试者其皮肤弹性增加了21.3％以上，84％的受试者其皮肤算术平均粗糙度降低了13.4％。

Claims

1.人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其特征在于，按质量百分比由以下组分组成：人成纤维细胞调节培养浓缩液20.0％～50.0％、卵磷脂2.0％～8.0％、三油酸甘油酯0.5～2.0％、抗氧化剂0.1％～4.0％、稳定剂0.4％～8.0％、甘草酸二钾0.2％～8.0％、丙二醇6.0％～27.0％，柠檬酸缓冲液15.0～49.0％，以上组分质量百分比之和为100％。

2.如权利要求1所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其特征在于，所述人成纤维细胞调节培养浓缩液为无血清人成纤维细胞调节培养液经过超滤浓缩后得到，其总蛋白含量为10～20mg/mL。

3.如权利要求1所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其特征在于，所述抗氧化剂为番茄红素、辅酶Q10、愈创树脂、类胡萝卜素、二丁基化羟基甲苯、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E醋酸酯、姜黄素、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚中的一种或多种；所述稳定剂为蛋氨酸、精氨酸、辛酸、聚山梨酯、PEG400、胆酸钠，去氧胆酸钠中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体，其特征在于，所述人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体粒径为190～210nm。

5.权利要求1所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤2，将步骤1称取的卵磷脂、三油酸甘油酯和抗氧化剂溶解于无水乙醇中，在水浴条件下搅拌一段时间，使其完全溶解，得醇相溶液；

步骤3，将步骤1称取的甘草酸二钾和稳定剂加入到柠檬酸缓冲液中，得到混合溶液；

步骤5，将步骤4得到的W/O型初乳采用高压微射流进行循环处理，即可得粒径均一的W/O型初乳；

步骤6，将步骤1称取的人成纤维细胞调节培养浓缩液与丙二醇混合均匀后，在水浴条件下，滴加到步骤5所得的W/O型初乳中并进行磁力搅拌，滴加完毕后，继续搅拌一段时间，搅拌完成后，在冰水浴中超声，即可得到W/O/W型人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体。

6.如权利要求5所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中卵磷脂、三油酸甘油酯和抗氧化剂总质量与无水乙醇加入的质量之比为1:2～1:5.5，三油酸甘油酯与卵磷脂的质量比为1:1～1:16；抗氧化剂与卵磷脂的质量比1:2～1:20，水浴温度为30～50℃，搅拌时间为10～20min，搅拌速率为500～800r/min；所述步骤3中稳定剂与卵磷脂的质量比1:1～1:5；甘草酸二钾与卵磷脂的质量比1:1～1:10；柠檬酸缓冲液的与醇相溶液的质量之比为1:10～16:5。

7.如权利要求5所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中滴加速度为10mL/min，搅拌速度为500～800r/min，滴加完成后，搅拌10～15min，超声温度30～40℃，超声时间15～25min，超声功率300w，超声完成后，旋转蒸发除去乙醇，水浴温度为20～35℃。

8.如权利要求5所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤5中微射流的压力为200MPa以下，循环处理次数为3～5次，得到的W/O型初乳粒径为180～200nm。

9.如权利要求5所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤6中水浴温度为20～30℃，滴加速率为10mL/min，搅拌速度为300～600r/min，滴加完成后的搅拌时间为30～60min，超声时间为10～15min。

10.权利要求1～4任一项所述的人成纤维细胞调节培养液柔性脂质体可以以任意比例添加到霜膏、乳液、面膜等产品中；也可经0.22μm无菌滤器过滤除菌，直接应用于激光美容术、光子嫩肤术或其他美容术后皮肤的修复和养护中。