CN110447534A - 一种基于ems诱导的藜麦突变体构建方法 - Google Patents
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Abstract
本公开属于EMS诱变技术领域，具体涉及一种基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法。藜麦是一种具有良好经济意义的作物，目前藜麦育种异交率较高，育种工作并不完备，构建稳定的突变体材料有利于保障藜麦的育种工作。本公开提供了一种基于EMS试剂的藜麦突变体构建方法，针对藜麦种子在震荡过程中易受损、浸泡易发芽，种子表面具有皂苷物质干扰等问题。本公开提供了一种采用吐温‑20水溶液清洗种子后，将种子低温浸泡于EMS溶液中的方案。采用吐温‑20对种子表面进行清洗，并通过低温解决种子易发芽的问题，配合种植方案，能够高效的获取突变体，保证种植效率。
Description
技术领域
本公开属于EMS诱变技术领域，具体涉及一种基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法、该方法获得的藜麦突变体以及二者在藜麦育种工作中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
藜麦是苋科藜属双子叶植物，具有营养价值高，抗逆性强，单产量高等诸多优点，藜麦已经成为应对国际粮食安全问题的重要作物。在近7000年的人工驯化和栽培过程中，藜麦形成了一个完整的产业体系。在育种方面，藜麦作为一个自然作物，存在异交率高的现象，不仅造成品种的退化，也使得现有的许多藜麦品种遗传背景复杂，严重影响育种工作的进行。值得注意的是到目前为止藜麦还没有完善的遗传转化体系，藜麦的相关研究也很难从反向遗传学角度进行，构建稳定的突变体材料是进行藜麦育种工作的重要保障。
诱变是创新突变体的有效手段，其基本原理是诱导基因突变，从而获得新的变异个体，是研究物种功能基因和丰富育种资源的有效手段。常见的诱变技术主要有两类：(1)物理诱变，利用激光，离子束或超声波等电离辐射和非电离辐射，迫使植物基因组DNA发生片段的缺失、异位等。(2)化学诱变，利用叠氮化合物，碱基类似物，烷化剂等化学试剂，改变植物碱基的组成，造成基因突变。在众多的化学试剂中，EMS是常用的诱变烷化剂，基于EMS诱变技术已经在玉米，小麦，大豆等众多作物突变体创建中得以应用。
目前，在植物诱变的方法中，特别是利用种子进行EMS诱变的植物中，关键的操作在于设定合适的诱变剂量和处理时间从而达到半数致死，保证诱变效率。在已发表的方法中，棉花通常采用2.45％-3.2％的EMS浓度(体积分数)震荡处理2-3h，拟南芥常采用0.23％-0.3％震荡处理10h-12h，高粱作物种子，采用0.1％的诱变浓度进行震荡处理，增加EMS诱变剂与种子的接触。总之，不同作物有其特定的诱变时间及诱变浓度，诱变效率通常通过半数致死率以及诱变处理后植物生长表型所反应。
发明人发现，目前藜麦还没有关于利用EMS诱变技术进行突变体构建的报道，没有确切的诱变浓度及诱变震荡处理时间。发明人认为，在藜麦EMS诱变方法中必须克服的问题有：(1)克服藜麦浸泡易发芽的问题。藜麦种子极易发芽，这就造成利用传统的植物诱变方法，在诱变震荡过程中将导致种子发芽，发芽后的种子在震荡过程中极易受损，进而影响最终的诱变库构建。(2)克服EMS试剂与藜麦种子接触不充分的问题。藜麦种子直径在1.5-2mm左右，种子相对较大且表面常含有皂苷等物质，种皮较厚，在EMS诱变过程中需要克服藜麦种子表面物质的干扰，保证藜麦种子与EMS诱变剂充分接触(3)克服藜麦诱变时间与诱变剂量的选择，保证半数致死率。诱变时间及诱变浓度是进行突变体构建的核心问题，由于目前没有藜麦EMS诱变方法作为参考，需要设置多种诱变时间及诱变剂量的组合，选择最为合适的诱变时间及剂量。(4)克服M1(诱变后的种子成为M1)种子的种植方法问题。通常诱变种子的粒数在20000粒，数量极大。诱变结束后种子常常是浸湿的，一般无法采用播种机播种的方法，对于相对较小的植物诱变后的种子通常采用喷洒的方式进行布种，对于体积大种子通常采用夹取的方式进行种植。而藜麦种子无法通过喷洒的方式进行种植，而夹取的方法耗时耗力，并非最佳方案。
发明内容
针对上述技术背景，本公开提供了一种基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，弥补了现有技术中藜麦突变诱导技术的空白，很好的克服了藜麦种子表面皂苷影响及浸泡易发芽等问题。
针对上述研究背景，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一种基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，所述方法包括采用吐温-20及EMS试剂处理藜麦种子。
优选的，所述构建方法包括以下步骤：
步骤a：向种子M0中加入吐温-20的水溶液清洗处理获得种子M1；
步骤b：向种子M1中加入EMS溶液后置于2～8℃条件下处理；
步骤c：将步骤b获得的种子置于琼脂溶液中悬浮混均后转移至育苗基质中进行基础育苗。
所述步骤a：
进一步优选的，向种子M0中加入8～12倍体积的吐温-20水溶液。
进一步优选的，所述吐温-20的水溶液为0.1～0.3％(v/v)。
进一步优选的，所述加入吐温-20水溶液的种子M0通过震荡进行清洗处理。
所述步骤b：
进一步优选的，向种子M1中加入4～6倍体积的EMS溶液。
进一步优选的，所述EMS溶液的浓度为0.7～0.9％。
进一步优选的，所述种子M1加入EMS溶液后震荡处理。
所述步骤c：
进一步优选的，所述琼脂溶液的浓度为0.2～0.4％(v/v)。
进一步优选的，所述步骤c还包括以下步骤：基础育苗进行至第三周时，施加水溶性肥料后将存活的藜麦移栽至育苗盆中。
本公开的关键点在于构建以一整套完备的藜麦EMS诱变体系及种植方案。技术要点在于：(1)诱变浓度为0.8％，处理时间为12h，避光处理温度为5.6℃。避免了藜麦种子在常温条件下萌发的技术问题(2)在进行诱变处理前采用0.2％的吐温-20水溶液进行种子处理，去除种子表面的污物，提高诱变剂与种子的接触效率。(3)在M1种植过程中，改变胶头滴管口径，利用0.3％的琼脂悬浮藜麦种子，更为便捷迅速的进行种子种植。
本公开第二方面，提供第一方面所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法得到的藜麦突变体。
本公开第三方面，提供第一方面所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法和/或第二方面所述藜麦突变体在藜麦育种领域的应用。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
本公开的优点在于利用合适的条件处理方式，保证了藜麦的诱变效率和种植效率。优点如下：(1)采用低温诱变技术，减缓藜麦种子在长时间诱变过程中的发芽率(2)探究出适宜藜麦种子表面清洁的吐温-20浓度及处理时间，进一步清洁藜麦种子(3)设置了藜麦EMS诱变的处理时间及诱变浓度，保证了诱变效率(4)创新藜麦诱变种子的种植方法，采用对应浓度的无菌琼脂悬浮液及新型胶头滴管，提高了种植效率，采取先育苗后移栽的种植方案，可以高效利用土地资源，避免因随机播种条件下，诱变半数致死带来的土壤低效利用。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中藜麦突变体构建流程图；
图2为藜麦种子诱变后育苗盘播种及生长情况；
其中，图2A为藜麦种子诱变后育苗盘播种情况照片；
图2B为藜麦种子在育苗盘中的生长情况。
图3为藜麦育苗移栽后情况；
其中，图3A为藜麦出苗后14天生长情况；
图3B为藜麦出苗后20天生长情况；
图3C为藜麦出苗后120天生长情况；
图3D为藜麦出苗后125天生长情况。
图4为诱变后M1生长过程情况图；
其中，图4A为单侧叶片数目发育异常突变体；
图4B为单侧叶片形态发育异常突变体；
图4C为对侧叶片数目发育异常突变体；
图4D为单侧叶面积异常突变体；
图4E为单侧叶片分裂异常突变体；
图4F为对侧叶片卷曲异常突变体。
图5为M1生殖生长过程中变异情况图；
其中，图5A为生长125天藜麦穗形；
图5B为生长125天早熟藜麦突变体；
图5C为生长125天整株颜色变红突变体。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中藜麦突变体的诱变技术尚不成熟，为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
S1：M0种子准备，
首先挑选饱满的藜麦种子1000粒进行称重，重复该操作3次，得出平均千粒重藜麦质量为0.3g，随后共称取6g种子，约20000粒，均匀放置于500ML锥形瓶中。每瓶约2000粒种子。
S2：M0种子诱变前处理
向瓶中加入10倍体积的含0.2％的Tween-20(吐温-20)水溶液，在室温条件下180转震荡30min，为防止水洗过程中，种子随水冲洗到瓶外，造成浪费，剪取10cm×10cm的40目孔径的滤膜，包住锥形瓶口，防止种子流出，水洗5遍去除多余的吐温-20水溶液。
S3：M0种子诱变处理
穿好防护服后，将被吐温-20处理后的锥形瓶于通风橱内，打开通风后，向每个锥形瓶中加入5倍体积的0.8％EMS溶液。加入EMS诱变液后，将锥形瓶密封好，外加锡箔纸包裹，将小型震荡摇床置于低温冷藏柜中，设置温度为5.6℃，180转速下震荡处理12h。
S4：M1种子处理
经过8h诱变处理的种子即为M1种子，穿好防护服后，将锥形瓶再次放置于通风橱中，打开通风，将EMS诱变液倒入0.5M的NaOH溶液中，反复水洗种子20次(操作类似于S3中水洗操作)，去除残余的EMS诱变液。
S5：M1种子种植双重策略
配置浓度为0.3％的琼脂溶液，并进行灭菌处理。将冷却后的琼脂溶液与M1种子进行混合，悬浮混匀。将塑料胶头滴管吸嘴减至直径为1.5mm，用该类胶头滴管吸取藜麦种子均匀的滴到育苗基质中进行基础育苗，待长到3周左右时，施加花无缺，促进存活下来的藜麦幼苗生长，随后将存活后的藜麦M1移栽至规格为的育苗盆中，促进M1藜麦生长。
实施例2
不同诱变处理方案的对比：
(1)常温24℃震荡培养12h与低温5.6℃震荡培养12h，种子萌发情况对比表：
表1
| 常温 | 低温 | |
| 避光 | 40％ | 8.7％ |
| 不避光 | 62.3％ | 10％ |
(2)不同藜麦预处理方案的比较：
在诱变过程中通常采用浸泡法对植物种子进行预处理，增加诱变剂与种子的接触，直接清水浸泡10h左右，操作简单方便，但由于藜麦极易发芽，此方法不利于后续诱变操作。采用去污剂是一种有效的代替方法，去污剂分为作用较为强烈的离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠等，作用较为强烈，常用的非离子去污剂有吐温-20、TritonX-100等，作用条件较为温和。针对植物种子处理，选取非离子去污剂既能清除种子表面，又能不损伤种子，防止影响后续致死率的计算。吐温-20已报道有帮助种子提高透性的能力，因而吐温-20是较为合适的去污剂。用0.1％、0.2％、0.3％不同浓度的吐温-20水溶液震荡浸泡饱满的藜麦种子30分钟，水洗干净后，观察两个指标：(1)清洁后种子在无菌滤纸上生长3天左右的种子萌发率(2)是否存在长菌情况，进行统计分析比较，(3)最低水洗遍数以水洗后第一次无明显气泡为标准。
表2
| 0.1％ | 0.2％ | 0.3％ | |
| 萌发率 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 是否长菌 | 长菌 | 无菌斑 | 无菌斑 |
| 最低水洗清洁遍数 | 5 | 7 | 10 |
综合比较分析，经过不同浓度吐温-20处理后不会影响藜麦种子的正常萌发，0.1％吐温水溶液不能满足实验要求，而利用0.2％、0.3％吐温水溶液处理后藜麦萌发过程中都不会长菌，利用0.2％的吐温水溶液处理藜麦更为便捷高效
(3)不同诱变时间及诱变浓度的设置选择，
在参照多种植物的EMS诱变体系，本实施例设计了3次独立重复的预实验摸索适合藜麦诱变的EMS诱变剂量，处理时间等条件。根据EMS诱变最佳诱变剂量为致死率达到50％最佳的标准，通过设置不同浓度梯度的EMS诱变浓度找到最佳诱变剂量。研究结果表明在处理12h,诱变浓度为0.8％时，可以保证萌发过程中40％的死亡率，考虑到诱变后植物后期的死亡情况，确定了核心诱变标准。
表3
| 0％ | 0.2％ | 0.3％ | 0.4％ | 0.6％ | 0.8％ | 1.2％ | 2.0％ | |
| 组一 | 85.96％ | 80.47％ | 76.78％ | 67.64％ | 64.13％ | 57.94％ | 46.95％ | 0％ |
| 组二 | 85.84％ | 84.55％ | 69.91％ | 67.52％ | 63.30％ | 60.00％ | 41.17％ | 0.83％ |
| 组三 | 94.69％ | 91.86％ | 76.99％ | 75.21％ | 69.72％ | 69.03％ | 50.42％ | 13.55％ |
(4)M1不同种植策略的比较
传统诱变后M1种子利用人工的方式单粒或多粒的种植，该方法耗时耗力，且在操作中易造成布种不均匀。本方法测评不同浓度的琼脂悬浮液对藜麦种子的悬浮效果，发现0.3％的悬浮液能够最大效率混匀藜麦种子，由于藜麦种子直径在1-2mm左右，常规的移液枪头及吸管无法匹配藜麦，通过扩大胶头滴管口径，设置1.5mm直径的胶头吸管，可以精确控制单粒藜麦种植，方便高效。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述方法包括采用吐温-20及EMS试剂处理藜麦种子。
2.如权利要求1所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
步骤a：向种子M0中加入吐温-20的水溶液清洗处理获得种子M1；
步骤b：向种子M1中加入EMS溶液后置于2～8℃条件下处理；
步骤c：将步骤b获得的种子置于琼脂溶液中悬浮混均后转移至育苗基质中进行基础育苗。
3.如权利要求2所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述步骤a，向种子M0中加入8～12倍体积的吐温-20水溶液。
4.如权利要求3所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述吐温-20的水溶液为0.1～0.3％(v/v)。
5.如权利要求2所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述步骤b，向种子M1中加入4～6倍体积的EMS溶液。
6.如权利要求5所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述EMS溶液的浓度为0.7～0.9％。
7.如权利要求2所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述步骤c，所述琼脂溶液的浓度为0.2～0.4％(v/v)。
8.如权利要求2所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法，其特征在于，所述步骤c还包括以下步骤：基础育苗进行至第三周时，施加水溶性肥料后将存活的藜麦移栽至育苗盆中。
9.权利要求1-8任一项所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法得到的藜麦突变体。
10.权利要求1-8任一项所述基于EMS诱导的藜麦突变体构建方法和/或权利要求9所述藜麦突变体在藜麦育种领域的应用。
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| CN112931196A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-06-11 | 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所 | 一种基于ems提高小麦突变率的诱变方法 |
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| CN108901832A (zh) * | 2018-08-31 | 2018-11-30 | 山西稼祺农业科技有限公司 | 一种藜麦的二元杂交方法 |
| CN110199884A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-09-06 | 云南农业大学 | 一种藜麦组培苗无菌条件下的结籽培育方法 |
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