CN110438212A

CN110438212A - 用于特定基因片段富集检测的酶切pcr试剂盒和方法

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Publication number: CN110438212A
Application number: CN201910770411.1A
Authority: CN
Inventors: 黄种山; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Fujian Chenxinke Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Huang Zhongshan
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2039-08-20
Also published as: CN110438212B

Abstract

本发明在常规PCR的基础上引入从堆肥样本中分离得到的耐高温限制酶DFh1，构建了用于特定突变基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法。酶切PCR试剂盒中含有酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmart Buffer。使用酶切PCR扩增时，需要在常规PCR体系的基础上再按每25μl扩增体系中加入1.0μg的酶DFh1和0.25μl的10×CutSmart Buffer进行。所构建的酶切PCR试剂盒和方法可以特异性扩增富集含量低至1%的目标突变基因片段，同时野生型基因片段将无法扩增，从而实现简便高效地富集检测样品中的特定突变基因片段，特别适用于低丰度突变基因片段的富集检测。

Description

用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法。

背景技术

肿瘤是一种基因疾病，基因突变检测对其预防和诊治十分关键。然而由于肿瘤样本中自带大量正常细胞，且只有部分肿瘤细胞会发生特定基因突变（肿瘤的异质性），此外很多关键基因突变在早期本身含量很低，这些导致肿瘤样本中低丰度基因突变的富集检测很有挑战性。PCR技术是基因检测的重要基础，然而常规的PCR技术并不具有选择性扩增癌症样本中突变基因片段的特性，此外扩增产物也往往需要借助其它手段进行分析。因此通过对常规PCR的改进来构建一种选择性扩增低丰度目标突变基因片段的方法就具有十分重要的意义，而本发明引入新的具有特殊功能的分子即耐高温限制性内切酶而构建的酶切PCR方法就是其中一种简便有效的方式。

限制性核酸内切酶是可以识别双链DNA上特定的核苷酸序列（通常为4到8个核苷酸），并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等因素，可将限制酶分为I、Ⅱ和Ⅲ三种类型。Ⅱ型限制性内切酶（以下简称限制酶）是基因工程中重要的工具酶，其所识别的位置多为短的回文序列，所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。特定的II型限制酶在特定的识别序列切割DNA分子而不会在其它地方切割，精准的切割性能使其在基因重组、基因克隆、质粒构建、DNA片段分析和突变检测等方面应用广泛。目前发现和商品化的限制酶以常温酶为主，极少有耐高温的限制酶，然而耐热型酶由于稳定性良好，因此对于酶的分离纯化、运输存储和活性发挥均具有明显的优势，并且耐高温限制酶在特定领域中具有独特的应用，如在低丰度基因片段（微量等位基因片段和稀有基因突变片段等）的富集和检测中效果显著。

申请人取福建省境内普通农田中的牛粪秸秆类高温堆肥开展研究，在其微生态体系蛋白提取液中筛选耐高温即耐热限制酶。首先通过含4核苷酸回文结构区的DNA片段即酶切底物筛选体系获知了堆肥蛋白提取液中含有靶向AGCT位点的耐高温限制酶，接着利用转录组测序和目标基因捕获测序并结合生物信息分析，初步锁定了限制酶的候选编码基因，进行基因克隆和蛋白表达纯化并探究酶切特性，结果检测出了1种含有413个氨基酸的新型耐高温Ⅱ型限制酶DFh1，可以识别5’...AGCT...3’核酸片段的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端，并且酶DFh1具有良好的酶活和耐高温性能。本发明获得的新型耐高温Ⅱ型限制酶DFh1可以作为基因工程和基因检测的工具酶，并在低丰度特定基因片段的富集和检测中具有独特的应用。

本发明在常规PCR的基础上引入新获取的耐高温限制酶DFh1以构建酶切PCR体系，可以特异性扩增富集目标突变基因片段，同时野生型基因片段将无法扩增，从而实现简便高效地富集检测样品中的特定突变基因片段，特别适用于低丰度突变基因片段的富集检测。

发明内容

本发明提供了新型的可识别5’...AGCT...3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端的耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1，并探究了其酶切特性；在此基础上，将耐高温限制酶DFh1引入常规PCR中构建了特定突变基因片段的简便高效富集检测试剂盒和方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种新型的耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1，该酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，其编码基因序列如SEQ ID NO：1所示；DFh1酶可识别5’...AGCT...3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端。酶DFh1具有良好的酶活，1μg限制酶DFh1在1×CutSmart Buffer缓冲体系和75℃或72℃温度下，在1h内可以将1nmol的含AGCT回文结构区的双链DNA片段（5’-FAM-F15-AGCT-R15-TAMRA-3’）在G和C之间完全酶切形成平末端。此外，限制酶DFh1具有良好的热稳定性，在95℃热育30min，酶活力仍保留90%以上；置于室温下30min，酶活力仍保留99%以上。限制酶DFh1在PCR缓冲液体系中仍能发挥35%以上的酶活。

在此基础上，本发明的目的在于提供一种用于特定基因片段富集检测的新型酶切PCR检测试剂盒，该试剂盒主要组份包括（1）耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmart Buffer；（2）常规PCR通用组份，主要包括配套的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs；（3）设计用于特异性扩增目标基因片段的常规PCR引物。

其中，试剂盒的组份（2）中的常规PCR通用组份，可采购商品化的PCR试剂，包括单独的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs或者这三者的预混液即PCRmix形式。

此外，本发明还提供了酶切PCR检测试剂盒的使用方法即酶切PCR富集检测方法，主要包括如下步骤：（1）准备好酶切PCR检测试剂盒；（2）配制酶切PCR扩增体系，具体做法是在常规PCR体系的基础上再按每25μl扩增体系中加入1.0μg的酶DFh1和0.25μl的10×CutSmart Buffer获得；（3）在目标基因片段常规PCR扩增条件的基础上延伸时间增加15s以上以及循环数增加5次以上，按照该条件进行酶切PCR；（4）酶切PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中含有目标突变基因片段，没有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中不含目标突变基因片段，酶切PCR可以富集检测含量低至1%的目标突变基因片段。

其中，试剂盒使用方法中步骤（2）中在配制酶切PCR扩增体系时，先加入相关组份，最终再用灭菌超纯水补足所需的扩增体积。

本发明提供的基于耐高温限制酶DFh1的酶切PCR方法能够简便有效地富集检测出含量低至1%的特定基因片段，可以广泛应用于基因突变检测等领域中。

附图说明

图1是5’-FAM-F15-NNNN-R15-TAMRA-3’即含有4核苷酸回文结构区的DNA片段体系的结构示意图，未免大量重复图中含义详见文中表述。

图2是目的基因扩增片段电泳图谱，左起第一泳道的DNA Marker从上到下长度分别为2000bp、1000bp、500bp和250bp，第二泳道为反转录扩增体系产物，第二泳道为基因组扩增体系产物。

图3是目标基因蛋白表达产物的SDS-PAGE图谱，左起第一泳道的蛋白Marker从上到下分子量分别为50kDa、33kDa、28kDa和19kDa，第二泳道为目标蛋白。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 堆肥蛋白提取液含有耐高温限制酶

高温堆肥就是将人粪尿、禽畜粪尿和秸秆等堆积起来，使样本和环境中的细菌和真菌等微生物大量繁殖，细菌和真菌等可以将有机物分解，并且释放出能量形成高温。高温堆肥是生产农家肥料的重要方式，也是分离耐高温微生物和耐高温蛋白的良好来源。取福建省境内普通农田中的牛粪秸秆类高温堆肥样本10份（5g/份），混合均匀后从中取10g，采用德国Qiagen公司的土壤蛋白提取试剂盒（NoviPure Soil Protein Extraction Kit），按照说明书中方法进行总蛋白（包含细胞内和细胞外的蛋白）提取。对提取的总蛋白，经美国Thermo Fisher公司的的Qubit3.0和配套的Protein Quantitation Assay试剂盒进行浓度测定，结果为9.76mg/mL。

接着探究堆肥样品总蛋白中的耐高温限制性内切酶特征谱，首先要制备特定酶切底物即含有拟探究的识别序列的DNA片段筛选体系。由于限制性内切酶的识别序列有一大类是回文结构，因此选择含有回文结构区的DNA片段体系先行进行筛选。合成并制备含有4核苷酸回文结构区的DNA双链片段体系“5’-FAM-F15-NNNN-R15-TAMRA-3’”，其结构如图1所示，类似于TaqMan探针的双链形式。该体系包含8种短DNA片段，每条片段5’端序列都一样，都是15个核苷酸（序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAA-3’即5’-（A）15-3’，其中5’端的第一个核苷酸用荧光报告基团FAM进行标记），记为F15；每条片段3’端序列都一样，都是15个核苷酸（序列为5’-CCCCCCCCCCCCCCC-3’即5’-（C）15-3’，其中3’端的最后一个核苷酸用荧光淬灭基团TAMRA进行标记），记为R15；8条片段唯一不同的是中间的4个核苷酸，是回文结构区（NNNN代表4核苷酸的所有8种回文结构可能，序列都有AATT、ATAT、ACGT、AGCT、CATG、CTAG、CCGG和CGCG）。首先分别单独合成8种DNA单链片段（带有所述荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA的那条DNA单链，简称荧光链），并同时对应单独合成其互补链（互补链无荧光基团修饰），接着将每种荧光链和其对应的互补链等量混合，在表1所示的体系中进行退火反应（在PCR仪中孵育，先95℃下2min，再缓慢降温1h至25℃，并在25℃下维持15min），最终获得含有4核苷酸回文结构区的DNA双链片段体系，对获得的DNA双链片段进行纯化并测定浓度。所述DNA片段的合成、双链的制备和纯化均委托上海生工生物工程股份有限公司进行。

表1 双链制备体系（20μl）

组份	添加量/μl
		荧光链（0.25nmol/μl）	5.0
互补链（0.25nmol/μl）	5.0
		10×PCR Buffer	2.0
去离子水	8.0

如图1所示的DNA双链片段，其5’端的荧光报告基团FAM和3’端的荧光淬灭基团距离非常近，因此FAM发出的荧光将被TAMRA所直接吸收，而检测不到荧光的产生（参照TaqMan探针原理）。若堆肥样品总蛋白提取液中含有能够识别并切割图1所示的DNA双链底物片段的回文结构区的限制酶，则5’端的荧光报告基团FAM和3’端的荧光淬灭基团TAMRA会随切割片段而分离，因此会检测得到有荧光的产生，并且荧光强度能够表征限制酶的活力。酶切体系如表2所示，其中的10×CutSmart Buffer购买自美国NEB公司，是通用型限制酶缓冲液体系（1X CutSmart Buffer Components：50 mM Potassium Acetate、20 mM Tris-acetate、10mM Magnesium Acetate和100 µg/ml BSA；pH 7.9，25°C），也适用于耐高温的Taq^αI等限制性内切酶，前期筛选工作表明该缓冲液体系适合于所探究的酶系；为了更好筛选和探究酶切性能，添加十分足量的1nmol DNA双链底物片段。酶切反应在荧光定量PCR仪（Thermo公司的Steponeplus）上进行，初步探究时共进行了30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃六个温度下的酶切反应，反应时间为30min，在反应前和反应结束时分别收集荧光信号，其差值即为反应的相对荧光强度。以（1）仅含等量的5’-FAM-F15-NNNN-R15-3’即不含荧光淬灭基团TAMRA仅含荧光报告基团FAM的单链（阳性参照，不加堆肥蛋白提取液，其平均荧光强度为15.21，dRn）和（2）含制备的正常双链底物片段5’-FAM-F15-NNNN-R15-TAMRA-3’但不加堆肥蛋白提取液的空白反应体系（阴性参照，其相对荧光强度为0.09）为参照，计算酶切反应体系收集到的相对荧光强度，数据如表3所示。表3中结果显示，除含AGCT回文结构区的DNA片段体系外，其余7种片段体系在各个温度下其相对荧光强度均在0.08-0.15之间，处于空白背景荧光范围内，表明堆肥蛋白中不存在靶向AATT、ATAT、ACGT、CATG、CTAG、CCGG和CGCG这7种回文结构区的限制酶。而对于含AGCT回文结构区的DNA底物片段，其酶切体系在40℃和70℃反应时均检测到了强烈的荧光信号，分别达到了全部潜在荧光强度的50.76%（7.72/15.21）和62.20%（9.46/15.21），初步表明所提取的堆肥蛋白液中存在可识别和切割含AGCT回文结构区的DNA片段的常温和耐高温限制酶，接着需要进一步确定其编码序列。

表2 堆肥样品总蛋白提取液酶切体系（10μl）

组份	添加量/μl
		DNA双链底物片段（0.2nmol/μl）	5.0
10×CutSmart Buffer	1.0
		堆肥总蛋白提取液（9.76mg/mL）	2.0
去离子水	2.0

表3 荧光信号检测结果

实施例2 限制酶基因序列的筛选和鉴定

取实施例1中混匀的堆肥样本10g，将其装入盛有100mL无菌水并带有玻璃珠的1L锥形瓶中，剧烈震荡约5min制成悬液；接着用8层纱布快速过滤悬液得到滤液，滤液再次用8层纱布快速过滤得到新的滤液；再将滤液在4℃、5000r/pm条件下离心2min，弃上清得到沉淀。按照土壤总RNA和总DNA提取试剂盒（美国OMEGA公司）说明书中方法分别对堆肥样本沉淀物进行总RNA和总DNA提取。由于是对耐热酶的筛选，因此只需对mRNA进行测序。采用OMEGA的mRNA捕获试剂盒（Mag-Bind mRNA Enrichment Kit）对总RNA进行mRNA的富集。富集的mRNA经测定其获取量为10.2μg，OD260/OD280=1.93，RIN=8.12，总体评价良好。获取的mRNA送华大基因进行高通量测序分析，采用的是illumina公司的Truseq RNA sample prep Kit构建cDNA文库，再利用Hiseq 2000进行测序（2×100bp），数据过滤后最终得到483Mbp的cleanreads，Q20=91.2%，拼接后得到12538条转录本，平均长度为654.61bp。

将得到的转录本比对到Nr即非冗余数据库中，发现有5条相近序列（平均长度在561-744bp之间）比到了GeneBank数据库上登录号为HM569710.1的序列，覆盖度为45.7-60.6%，并且覆盖区具有很高的一致性（均大于80%）。需要特别指明的是，关注HM569710.1序列，是因为该序列是纤维化纤维微细菌（即Cellulosimicrobiumcellulans）的Alu限制修饰酶基因簇，其中包含了AluI限制酶的编码基因（HM569710.1序列的第539-1765位点的DNA片段），而AluI限制酶恰好可以识别AGCT回文结构区并进行切割，这符合在实施例1中观察到的现象。提示了这5条候选序列其基因编码的可能是限制酶AluI的类似酶。

为了获取全长的mRNA序列（或其编码基因全长序列），选择mRNA测序结果中所有长度大于100bp，并且和纤维化纤维微细菌AluI限制酶的编码基因比对覆盖度不少于50bp且覆盖区域一致性大于60%的序列，委托华大基因公司设计成液相捕获探针（共124条），并以这些捕获探针对提取的mRNA进行捕获测序和拼接，平均测序深度大于1000×。经过捕获测序分析，得到了这5条mRNA的完整序列，并转换成对应的编码基因序列，比对发现可以分成2组，一组为2条相近的较长序列，序列长度分别是1242bp和1254bp；另外一组为3条相近的较短序列，序列长度分别是1191bp、1173bp和1048bp。

选择有2条相近长序列的这组中长度为1242bp的序列（编码基因序列如SEQ IDNO：1所示），根据序列设计引物对P1（5’-GTGGGATCAATCGTCGACCA-3’）和P2（5’-TCAGACCGGACGACGTAGG-3’），以提取富集的mRNA（详见反转录扩增体系）和总DNA（详见基因组扩增体系）为模板进行扩增，扩增体系如表4所示。表4中的相关试剂均购买自天根生化科技（北京）有限公司。反转录体系扩增条件为：42°C逆转录30min；95°C预变性3min；94°C变性30s，53°C退火35s，72°C延伸30s，36个循环；72°C终延伸5 min。基因组体系扩增条件为：94°C预变性3min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸45s，32个循环；72°C终延伸5min。扩增产物进行电泳，相关电泳图谱如图2所示，两种体系的扩增片段条带一致，并且条带清晰且单一，长度（约1200bp）符合预期。

表4 两种扩增体系信息

PCR产物送上海生工进行Sanger测序，反转录扩增体系和基因组扩增体系的扩增产物测出的序列是一样的，如SEQ ID NO：1所示，这和捕获测序的结果是一致的。测定的序列SEQID NO：1在NCBI的核酸数据库进行比对，结果显示其序列和GeneBank数据库上登录号为HM569710.1的序列在99%的覆盖度下，一致性高达94.58%，因此提示SEQ ID NO：1为限制酶AluI的类似酶的基因编码序列，则其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其理论分子量为47.15kDa。对于获取的限制酶候选基因序列，进一步的需要在蛋白水平层面进行探究，首先对其进行基因克隆和蛋白表达纯化。

实施例3 限制酶基因克隆表达

选择Thermo公司的大肠杆菌蛋白表达体系pET303/CT-His，按照说明书中方法并参考相关文献进行SEQ ID NO：1所示基因编码序列的蛋白表达，一般性的步骤参照《精编分子生物学实验指南》（第五版）和《分子克隆实验指南》（第四版）进行。采用带有XbaⅠ和NsiⅠ双酶切位点的引物扩增目的基因（P3：5’-GATTCTAGAGTGGGATCAATCGTCGACCA-3’和P4：5’-TCAGACCGGACGACGTAGGATGCATAGC-3’，扩增体系和条件同表4中使用引物对P1和P2的基因组扩增体系），PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测无误后按照说明书中方法进行XbaⅠ和NsiⅠ双酶，酶切产物进行纯化回收。回收的目的基因扩增片段同经XbaⅠ和NsiⅠ双酶切的pET303/CT-His载体连接构建重组质粒。重组质粒转化感受态细胞BL21，筛选阳性重组子，最后进行阳性克隆的酶切、PCR扩增和扩增片段Sanger测序鉴定。挑取经测序鉴定正确（同SEQ IDNO：1序列）的阳性克隆子接种于100ml含50μg/mlAmp的LB培养基中，37℃摇动培养至对数生长期，按1：5接种至1000ml新鲜的LB培养基中，30℃摇动培养到D600=0.6-0.8，加IPTG至终浓度为0.25mmol/L，于16℃过夜震荡培养，诱导带组氨酸标签（His-tag）的目标蛋白表达。离心收集菌体，超声破碎，离心收集裂解液上清，用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白，纯化产物以10.0%SDS-PAGE分析鉴定。图3的SDS-PAGE图谱显示获得了单一明亮的蛋白表达产物条带，并且分子量符合预期的目标蛋白。经Qubit3.0测定，纯化蛋白的浓度为0.58mg/ml。

由此借助商业化的大肠杆菌表达体系获得了大量纯净的目标蛋白产物，接着进行酶切底物和耐热性能的验证和分析。

实施例4 限制酶DFh1相关酶学性质研究

以5’-FAM-F15-AGCT-R15-TAMRA-3’双链片段为底物，目标蛋白添加量为1μg，参照实施例1中的酶切体系和条件，测定目标蛋白的限制酶活性（表5）。初步探究可知，该酶在60-70℃高温下具有比常温高得多的酶活力，表明这是一种耐高温限制酶，为行文方便将其命名为限制酶DFh1。

表5 限制酶DFh1的温度梯度酶活实验数据

进一步的，设计表6中温度梯度和时间梯度实验更细致地探究其耐热性能与酶活，综合来看在各反应时长下均是75℃的荧光强度最高，可知酶DFh1的最适温度为75℃，且在此温度下反应1h及以上即达到了饱和荧光强度，表明反应1h就可以将底物彻底酶解；72℃的酶活和75℃的基本一致，72℃下反应1h也可以将底物彻底酶解。将酶切产物纯化后送华大基因有限公司进行质谱测定，质谱形成了4个主峰，经分析分子量分别对应于FAM-（A）15-AG、CT-（C）15-TRMRA、（T15）-TC和GA-（G）15这4种片段，由酶切产物反推可知酶DFh1识别AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端。由此可得，1μg限制酶DFh1在1×CutSmartBuffer缓冲体系和75℃或72℃温度下，在1h内可以将含1nmol的AGCT回文结构区的双链DNA片段（5’-FAM-F15-NNNN-R15-TAMRA-3’）在G和C之间完全酶切形成平末端。

表6 酶DFh1的温度时间梯度酶活实验数据

温度 ℃	30min	1h	3h	12h
					50	4.85	6.24	8.18	11.56
55	5.22	6.91	9.05	13.41
					60	9.64	12.30	14.67	15.14
65	11.46	14.30	15.18	15.19
					70	13.63	14.12	15.20	15.21
72	13.71	15.21	15.21	15.21
					75	13.88	15.21	15.21	15.21
80	2.85	3.76	5.27	9.32
					85	0.62	0.73	0.87	1.03
90	0.42	0.48	0.55	0.69
					95	0.15	0.18	0.20	0.24

考虑到利用该耐高温限制酶DFh1构建低丰度基因片段检测试剂盒和检测方法，进一步的探究其热稳定性，选择95℃的极端高温进行测试，选择72℃做为酶反应温度。将DFh1酶液先在95℃下保温30min、1h和3h，再参照本实施例表5中的酶切体系和条件（1μg酶DFh1、1nmol的底物DNA片段，1×CutSmart Buffer缓冲体系和72℃温度）进行1h的酶切反应，对照组的DFh1酶液不进行95℃热保温处理。结果显示，95℃热处理后，体系测得的荧光强度分别是15.21（对照组）、13.83（30min组）、12.64（1h组）和9.27（3h组），因此相比于完全酶切的对照组，95℃热处理后DFh1限制酶在72℃反应温度下的酶活仍保留了90.9%（13.83/15.21，30min组）、83.1（12.64/15.21，1h组）和60.9%（9.27/15.21，3h组）。由此表明，DFh1限制酶具有良好的热稳定性，在95℃热育30min，酶活力仍保留90%以上；95℃热育1h，酶活力仍保留80%以上；95℃热育3h，酶活力仍保留60%以上。

考虑到利用该耐高温限制酶DFh1构建低丰度基因片段检测试剂盒和检测方法，需要基于耐高温DNA聚合酶和耐高温限制酶DFh1的循环扩增和循环酶切联合体系，因此进一步的探究酶DFh1在特定PCR缓冲体系下的稳定性和活力。由于要构建耐热DNA聚合酶和耐高温限制酶的联合PCR扩增体系，因此选择的特定缓冲液主要是PCR buffer，体系如表7所示。同时加入10×PCR Buffer（购买于北京雷根生物技术有限公司）和10×CutSmart Buffer至其最终浓度分别为1×PCR Buffer和0.1×CutSmart Buffer，主要是为了维持可供基因扩增的PCR缓冲体系，而适量导入DFh1酶的缓冲体系。PCR Buffer和CutSmart Buffer的pH分别是8.3和7.9，两者非常接近。反应温度为72℃，反应时间为1h，对照为只加最终浓度为1×CutSmart Buffer的反应体系。经测定对照组的相对荧光强度有15.12，而混合缓冲液组的则有5.63，因此在混合缓冲体系下，DFh1酶的酶切效力发挥了37.24%（5.63/15.12），即其酶活力发挥了37.24%。

表7 酶DFh1在PCR缓冲液体系中的稳定性数据

组份	添加量
		5’-FAM-F15-AGCT-R15-TAMRA-3’短双链DNA片段（0.2nmol/μl）	5.0μl
10×CutSmart Buffer	0.1μl
		10×PCR Buffer	1.0μl
DFh1酶	1μg
		去离子水	补足至10μl

实施例5酶性能比较实验

对比本发明获得的耐高温限制酶DFh1和市面上两款主流的商品化AluI酶（来源于不同的两大品牌公司）的酶活，按照表8种体系和条件进行酶切。这3种AluI酶的添加量均为1μg（均采用Qubit按照说明书方法定量分析），反应底物均是5’-FAM-F15-AGCT-R15-TAMRA-3’短双链DNA片段；购买的两款商品化AluI酶采用各自产品自带的缓冲液体系和添加量，反应温度是说明书推荐的37℃；酶DFh1采用的是1×CutSmart Buffer，反应温度是拟实际应用的72℃；反应时间均为1h，设定实时荧光定量PCR信号采集时间点，分别在反应15min、30min和结束时测定相对荧光强度。结果显示，在反应15min、30min和1h时，酶DFh1测得的相对荧光强度分别是9.25、13.67和15.21；AluI酶1测得的分别是4.83、6.77和10.23；AluI酶2测得的分别是3.30、5.41和7.06。由此可知在各自最适的反应体系和条件下，酶DFh1的AGCT限制性内切酶酶活高于市面上主流的商品化AluI酶（约1.5-2倍）。这一方面是由于酶构造的不同，另外一方面是由于酶DFh1的最适反应温度是高温，有利于酶促反应的进行。

表8 3种限制酶反应体系和条件

此外，将这三种酶至于室温（30℃左右）下30min，再按照表8中体系和条件进行酶切反应。结果显示酶切1h后，酶DFh1、AluI酶1和AluI酶2测得的相对荧光强度分别是15.08、9.51和6.64，其酶活分别保留了99.15%（15.08/15.21）、92.96%（9.51/10.23）和94.05%（6.64/7.06）。由此可知置于室温下30min，酶DFh1酶活几乎不受影响，而AluI酶1和AluI酶2均损失了超过5%的酶活力，则表明酶DFh1常温下更稳定，能够实现更加有效和简便地应用于实际。

综上可知，本发明提供的全新的限制酶DFh1的耐高温特性能够使其分离纯化、运输存储和活性发挥上均显著优于常规的常温同功酶。

实施例6 低丰度基因片段富集检测实验

为了改进常规PCR以富集检测特定突变基因片段，本发明基于新获得的耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1提供了一种新型的酶切PCR检测试剂盒，该试剂盒主要组份包括（1）耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmart Buffer；（2）常规PCR通用组份，主要包括配套的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs；（3）设计于特异性扩增目标基因片段的常规PCR引物。

此外，本发明还提供了酶切PCR检测试剂盒的使用方法，主要包括如下步骤：（1）准备好酶切PCR检测试剂盒；（2）配制酶切PCR体系，具体做法是在常规PCR体系的基础上再按每25μl扩增体系中加入1.0μg的酶DFh1和0.25μl的10×CutSmart Buffer获得；（3）在目标基因片段常规PCR扩增条件的基础上延伸时间增加15s以上以及循环数增加5次以上，按照该条件进行酶切PCR；（4）酶切PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中含有目标突变基因片段，没有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中不含目标突变基因片段，酶切PCR对特定突变基因片段的检测限为1%。

结直肠癌是中国人最常见和最易致死的主要癌症之一，2018年WTO的全球癌症年报显示在中国结直肠癌的发病率和死亡率均高居所有主要癌症的第四位。肺是结直肠癌转移的主要靶器官之一，10%-20%的结直肠癌患者将发生肺转移，导致其成为重要的致死原因。申请人前期在结直肠癌肺转移样本中发现其存在ACVR1B基因第3号外显子的特定缺失突变，提示其可以做为结直肠癌肺转移的基因标志，关键在于及早检测出该突变。

针对上述情况，本实施例将应用获得的耐热限制酶DFh1构建一种酶切PCR，可以简便有效地实现特定低丰度基因突变的简便富集和检测分析。以ACVR1B基因第3号外显子的c.[24679_24683delCTGGT]缺失突变（野生型ACVR1B基因长45384bp，c.[24679_24683delCTGGT]代表其第24679-24683位点的CTGGT这5个核苷酸发生缺失，参照 NCBI核酸数据库登陆号NC_000012 REGION: 51951696..51997079范围序列）为检测对象，野生型ACVR1B基因第3号外显子（为24632-24880位点）在突变范围区含有一个AGCT位点（24677-24683序列为：AGCTGGT，下划线为CTGGT缺失突变），此为酶DFh1的酶切位点，但突变型片段由于c.[24679_24683delCTGGT]缺失突变的发生而导致酶切位点的消失。如果在常规PCR体系中引入耐高温限制酶DFh1，则在每次PCR扩增和酶切循环过程中，结直肠癌癌灶样本中ACVR1B基因第3号外显子野生型扩增片段由于AGCT位点的存在将被酶DFh1酶切而无法做为下一轮扩增的模板，故而扩增产物无法累积；而突变型基因片段由于突变酶切位点消失而导致其不被酶切，则其产物可以快速累积。由于PCR模板基因拷贝数不多，而酶DFh1一开始含量就丰富且在PCR体系酶活保留37%左右（参考实施例4数据），则野生型基因片段很难实现有效扩增，最终电泳检测有PCR扩增片段则表明样本中含有突变基因。

通过结直肠癌患者的血液以及肿瘤手术切除和活检样本，利用PCR和Sanger测序获得了ACVR1B基因第3号外显子野生型基因片段和发生c.[24679_24683delCTGGT]缺失突变的基因片段。相关引物、体系和条件如表9所示，PCR mastermix（即PCR缓冲液、4种dNTP和DNA聚合酶的预混液）为北京天根生化科技有限公司产品，PCR产物送上海生工进行Sanger测序。购买日本Takara公司的胶回收试剂盒、TA克隆载体、大肠杆菌感受态细胞、蓝白筛选相关的其它常规试剂以及质粒抽提试剂盒，按照说明书方法并参考文献将测序验证的野生型基因片段和突变型基因片段构建到T载体上并转入大肠杆菌中，鉴定并培养携带目标基因克隆片段的大肠杆菌，提取质粒DNA并测定浓度。

表9 ACVR1B基因第3号外显子基因片段扩增体系和条件

依据测定的质粒浓度，按99：1的浓度比混合携带野生型基因片段的质粒和携带突变型基因片段的质粒（实验组，突变含量1%）。按照表10的酶切PCR体系进行循环扩增和酶切反应，扩增引物为P5和P6（同表9中引物），反应条件为：95°C预变性3min；95°C变性15s，52°C退火15s，72°C延伸45s，36个循环；72°C终延伸5min（基本同表9中扩增条件，只是延伸时间和反应循环数有所增加）。阳性对照为只含等量的携带突变型基因片段的质粒模板，阴性对照为只含等量的携带野生型基因片段的质粒模板。

理论上，在每一轮PCR的72°C延伸阶段，野生型基因片段的扩增产物将被耐高温限制酶DFh1所切除，而突变型基因片段不被酶切可以做为下一轮扩增的模板，因此最终将只得到突变型基因片段。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析（2%胶浓度），结果显示阴性对照组无目的基因片段扩增产物，而阳性对照组和实验组均成功扩增到目的基因片段，Sanger测序均表明两者的扩增产物为突变型基因片段，测的突变基因序列如Seq ID NO：3所示。Taq DNA聚合酶体系和PCRmix体系结果是一致的。

表10 酶切PCR体系（25μl）

选择12例临床确诊结直肠癌且发生肺转移的患者，肺转移之前均有行病灶切除。取各自的石蜡切片，提取基因组DNA，按照表10中方法检测ACVR1B基因第3号外显子的c.[24679_24683delCTGGT]缺失突变情况，同时采用常规PCR扩增ACVR1B基因第3号外显子（同样采用引物P5和P6，扩增体系和条件参照表10）。结果12例样本两种扩增方法下均有扩增条带产生，送Sanger测序发现采用本发明的酶切PCR方法对12例样本均测得如Seq ID NO：3所示的突变序列（即含有c.[24679_24683delCTGGT]缺失突变的序列），而采用常规PCR方法扩增产物则只有4例测得的是如Seq ID NO：3所示的突变序列，其余8例测得的是野生型序列（无法检出低丰度基因突变），表明常规PCR方法在大量野生型基因背景存在时无法富集检测出特定的低丰度基因突变片段，而本发明提供的酶切PCR方法则可以。

综上可知，本发明提供的特定全新II型限制酶DFh1，可以作为基因工程和基因检测的工具酶，并在低丰度特定基因片段的富集和检测中具有独特的应用；本发明提供的基于耐高温限制酶DFh1的酶切PCR检测试剂盒和检测方法可以有效地检测出含量低至1%的ACVR1B基因第3号外显子的c.[24679_24683delCTGGT]缺失突变片段。

序列表

<110> 福建晨欣科生物科技有限公司

<120> 用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gtgggatcaa tcgtcgacca gatcggccct gatggggaac tcgttccaga cgtcgacacg 60

acgctcagcg aaaaggagaa gaacgacctc ctcctggatc tgcccggcgc cacgacgtcg 120

acgtacggtg gcgcccgcgt ggtcaggttc cacgaccaga tcatcctcaa ggctcaggtc 180

acacacctcg gacacccgtg gcccatcacc ccgttttcgc gcgtcgccta caagaagcgc 240

atccagatcc cgaagtcttg gctggaggtc gagcgacggg ccacgcgcga cggactggtg 300

acccgctttg tcggcatcta tcggtaccgc gccgtcaccg ttttcgtcga cttcgacccg 360

cggacgtaca tccagcgcgc tgccaacaac tctgcggccc acgtctcgac caacgacctg 420

caccaggcac agacgctcgg gctgttcgag cgcgtcgatc gcaacgggaa ctgtctgacc 480

agcgtccggg ctgaactgct cgccgactac cttgtcggtg tcgcagacac cactgacttc 540

ttcactggca gatggctgcg cgctctcgac gcggttcagg agatgcacgc tgccgcgtgg 600

cccgacaggt tccagaacga gtgggctggc ttctacctcg agtaccgctt cgacaggttc 660

gtgagagcgg aggggcttgc ggacatcgtc cagttccaga agaagaagca gcgcgggggc 720

cactacccga gcgtcgacta cgacgatgtg ctggtcttcc acttccggcg ggacgggttc 780

tacttcaacc agggtgatct gaaggcctcc aacatcgcca agcaggaggc catcggcaac 840

gaccgcgacg acctggtccg ctgcctcgag gagttcggcc gcttctggta cgtgatctac 900

gagcacgaca cggtccacgg gaaggccaac ggcgacgtcg ccacgatcga gtggaacgag 960

tggcggcggt ccgtcgggca cgttcagggc aaggagtaca gcccgctctc ctactctggg 1020

cggttcaagg agtcggtgcg gttcgcccgg atgcaggtgc tcgaggtgaa cgaggcgaac 1080

gctagcctcg ttctcggcga ccatcaccaa ggccggcaac ccagcggtgc ctcgcgcgag 1140

cccaaggtca agatcctgaa gaagcacatc gacaacttcc tgatcttctc cagcgcgctg 1200

gtcgaccccg aggtgccgag cggcctacgt cgtccggtct ga 1242

<210> 2

<211> 413

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Val Gly Ser Ile Val Asp Gln Ile Gly Pro Asp Gly Glu Leu Val Pro

1 5 10 15

Asp Val Asp Thr Thr Leu Ser Glu Lys Glu Lys Asn Asp Leu Leu Leu

20 25 30

Asp Leu Pro Gly Ala Thr Thr Ser Thr Tyr Gly Gly Ala Arg Val Val

35 40 45

Arg Phe His Asp Gln Ile Ile Leu Lys Ala Gln Val Thr His Leu Gly

50 55 60

His Pro Trp Pro Ile Thr Pro Phe Ser Arg Val Ala Tyr Lys Lys Arg

65 70 75 80

Ile Gln Ile Pro Lys Ser Trp Leu Glu Val Glu Arg Arg Ala Thr Arg

85 90 95

Asp Gly Leu Val Thr Arg Phe Val Gly Ile Tyr Arg Tyr Arg Ala Val

100 105 110

Thr Val Phe Val Asp Phe Asp Pro Arg Thr Tyr Ile Gln Arg Ala Ala

115 120 125

Asn Asn Ser Ala Ala His Val Ser Thr Asn Asp Leu His Gln Ala Gln

130 135 140

Thr Leu Gly Leu Phe Glu Arg Val Asp Arg Asn Gly Asn Cys Leu Thr

145 150 155 160

Ser Val Arg Ala Glu Leu Leu Ala Asp Tyr Leu Val Gly Val Ala Asp

165 170 175

Thr Thr Asp Phe Phe Thr Gly Arg Trp Leu Arg Ala Leu Asp Ala Val

180 185 190

Gln Glu Met His Ala Ala Ala Trp Pro Asp Arg Phe Gln Asn Glu Trp

195 200 205

Ala Gly Phe Tyr Leu Glu Tyr Arg Phe Asp Arg Phe Val Arg Ala Glu

210 215 220

Gly Leu Ala Asp Ile Val Gln Phe Gln Lys Lys Lys Gln Arg Gly Gly

225 230 235 240

His Tyr Pro Ser Val Asp Tyr Asp Asp Val Leu Val Phe His Phe Arg

245 250 255

Arg Asp Gly Phe Tyr Phe Asn Gln Gly Asp Leu Lys Ala Ser Asn Ile

260 265 270

Ala Lys Gln Glu Ala Ile Gly Asn Asp Arg Asp Asp Leu Val Arg Cys

275 280 285

Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Trp Tyr Val Ile Tyr Glu His Asp Thr

290 295 300

Val His Gly Lys Ala Asn Gly Asp Val Ala Thr Ile Glu Trp Asn Glu

305 310 315 320

Trp Arg Arg Ser Val Gly His Val Gln Gly Lys Glu Tyr Ser Pro Leu

325 330 335

Ser Tyr Ser Gly Arg Phe Lys Glu Ser Val Arg Phe Ala Arg Met Gln

340 345 350

Val Leu Glu Val Asn Glu Ala Asn Ala Ser Leu Val Leu Gly Asp His

355 360 365

His Gln Gly Arg Gln Pro Ser Gly Ala Ser Arg Glu Pro Lys Val Lys

370 375 380

Ile Leu Lys Lys His Ile Asp Asn Phe Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu

385 390 395 400

Val Asp Pro Glu Val Pro Ser Gly Leu Arg Arg Pro Val

405 410

<210> 3

<211> 362

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

actcaggtca cctcaaggag cctgagcacc cgtccatgtg gggcccggtg gagaggcatc 60

atcgccggcc cggtgttcct cctgttcctc atcatcatca ttgttttcct tgtcattaac 120

tatcatcagc gtgtctatca caaccgccag agactggaca tggaagatcc ctcatgtgag 180

atgtgtctct ccaaagacaa gacgctccag gatcttgtct acgatctctc cacctcaggg 240

tctggctcag gtaccaagtt cttcagggca tcatgtctgt ggttggcttt catcagtttc 300

ccagcaggat agagtgcttg tagagaaggc tggaggccct gcatttgttt ctaccagcat 360

tg 362

Claims

1.一种用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒，其特征在于所述酶切PCR试剂盒主要组份包括（1）耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmart Buffer；（2）常规PCR通用组份，主要包括配套的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs；（3）设计用于特异性扩增目标基因片段的常规PCR引物。

2.如权利要求1中所述的一种用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒的使用方法，其特征在于酶切PCR富集检测方法主要包括如下步骤：（1）准备好酶切PCR检测试剂盒；（2）配制酶切PCR扩增体系，具体做法是在常规PCR体系的基础上再按每25μl扩增体系中加入1.0μg的酶DFh1和0.25μl的10×CutSmart Buffer获得；（3）在目标基因片段常规PCR扩增条件的基础上延伸时间增加15s以上以及循环数增加5次以上，按照该条件进行酶切PCR；（4）酶切PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中含有目标突变基因片段，没有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中不含目标突变基因片段，酶切PCR可以富集检测含量低至1%的目标突变基因片段。