CN110438094A - 海螺碱合成酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了海螺碱合成酶及其应用，海螺碱合成酶是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列；2)将SEQ ID NO.2中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海螺碱合成酶功能的氨基酸酸序列。该合成酶具有海螺碱合成活性，在烟草中表达海螺碱合成酶能够催化海螺碱合成，在具有托品烷生物碱生物合成途径的资源植物如颠茄、曼陀罗、莨菪、三分三和铃铛子等中表达海螺碱合成酶能够提高海螺碱的含量，对改良并提高药用资源植物中托品烷生物碱的含量具有重要的意义。

Description

海螺碱合成酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及海螺碱合成酶((littorine synthase，LS)，还涉及海螺碱合成酶的应用。

背景技术

托品烷生物碱(tropane alkaloids，Tas)是一类具有巨大医疗价值的抗胆碱药物，广泛用于麻醉、镇痛、止咳、平喘和抗晕动病，也用于控制帕金森病的僵直和震颤。临床上常用的是莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)，两者的市场需求均十分巨大，其中以东莨菪碱毒副作用更弱，药效更强，价格也更昂贵。目前TAs都是从少数茄科TAs资源植物中提取，包括颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stramonium)和莨菪(Hyoscyamus niger)，颠茄是东莨菪碱和莨菪碱最主要的商业栽培药源，也是药典收录的TAs药源植物。野生颠茄植株中莨菪碱质量分数为0.02％～0.17％(干重)，东莨菪碱含量极低，仅为干重的0.01％～0.08％。因此，培育托品烷生物碱高产颠茄一直是该行业长期追求的目标。

大部分植物次生代谢产物其在天然植物中的含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本太高，并且还有许多植物次生代谢产物的生物合成途径不清晰，无法实现化学全合成。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法。例如，在植物中过量表达次生代谢生物合成途径关键酶基因，打破代谢产物合成的限速步骤，从而促进最终有用代谢产物在植物体内的积累，获得更有经济价值的材料。在茄科TAs资源植物生物碱生物合成途径中，大多数合成酶已经被解析，如：AT4苯丙氨酸氨基转移酶；PPAR苯丙酮酸还原酶；PMT腐胺甲基转移酶；MPO甲基腐胺氧化酶；PYKS聚酮合酶；CYP82M3托品酮合成酶；TRI托品酮还原酶I；CYP80F1海螺碱变位酶；H6H莨菪碱6β羟化酶等基因已经被克隆，其中在颠茄中过量表达H6H基因，莨菪碱大量转化为更有价值的东莨菪碱，提高了颠茄的经济价值。但是由托品碱与苯乳酸合成海螺碱过程未被解析，而海螺碱是莨菪碱和东莨菪碱合成的重要中间体，因此对托品碱与苯乳酸合成海螺碱合成过程的解析，对于改良并提高茄科TAs资源植物中托品烷生物碱的含量具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种海螺碱合成酶；本发明的目的之二在于提供所述的海螺碱合成酶的编码基因；本发明的目的之三在于提供含有所述海螺碱合成酶的编码基因的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供含有所述海螺碱合成酶的编码基因的转基因细胞系或转基因重组菌；本发明的目的之五在于提供所述海螺碱合成酶体内或体外催化托品和苯基乳酸合成海螺碱中的应用；本发明的目的之六在于提供所述海螺碱合成酶的编码基因、所述的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物重建海螺碱合成途径中的应用；本发明的目的之七在于提供所述海螺碱合成酶、所述海螺碱合成酶的编码基因、所述的重组表达载体、所述的转基因细胞系或转基因重组菌在具有托品烷生物碱生物合成途径的植物中提高海螺碱含量中的应用；本发明的目的之八在于提供一种提高颠茄生物碱含量的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、海螺碱合成酶，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列；

2)将SEQ ID NO.2中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海螺碱合成酶功能的氨基酸酸序列。

2、所述的海螺碱合成酶的编码基因。

优选的，所述海螺碱合成酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述合成酶的核苷酸序列；

4)与1)或2)所述的序列杂交的核苷酸序列。

3、含有所述海螺碱合成酶的编码基因的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体为将所述的海螺碱合成酶的编码基因插入植物瞬时表达载体或植物表达载体得到表达海螺碱合成酶的重组表达载体。所述植物瞬时表达载体为pEAQ-HT，也可以为其他商业性瞬时表达载体或经改造的可表达的酵母表达载体；所述植物表达载体为pBI121，也可以为其他商业表达载体或经改造的可用植物表达载体。

4、含有所述海螺碱合成酶的编码基因的转基因细胞系或转基因重组菌。

优选的，所述细胞系为植物细胞系。优选的，所述植物细胞系为具有托品烷生物碱生物合成途径的资源植物的细胞系，如颠茄、曼陀罗、莨菪、三分三和铃铛子细胞系，还可以为其他模式植物的细胞系，如烟草细胞系。

优选的，转基因重组菌为细菌或真菌，细菌可以为大肠杆菌、农杆菌等；真菌为酵母等；通过在转基因重组菌重建代谢途径。

5、所述海螺碱合成酶体内或体外催化托品和苯基乳酸合成海螺碱中的应用。

6、所述海螺碱合成酶的编码基因、所述的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物重建海螺碱合成途径中的应用。海螺碱合成酶的编码基因和所述的重组表达载体可以在不具有托品烷生物碱生物合成途径原核和真核生物中重建海螺碱合成途径，获得海螺碱，为合成莨菪碱和东莨菪碱提供原料。

7、所述海螺碱合成酶、所述海螺碱合成酶的编码基因、所述的重组表达载体、所述的转基因细胞系或转基因重组菌在具有托品烷生物碱生物合成途径的植物中提高海螺碱含量中的应用。

8、一种具有托品烷生物碱生物合成途径的植物中海螺碱含量的方法，将通过在具有托品烷生物碱生物合成途径的植物中过量表达所述的海螺碱合成酶的编码基因。

进一步，在茄科TAs资源植物中过量表达所述的海螺碱合成酶的编码基因的方法如下：克隆海螺碱合成酶的编码基因，然后构建植物表达载体，获得含有海螺碱合成酶的编码基因的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化工程菌，最后用工程菌转化茄科TAs资源植物，筛选抗性毛状根或再生植株，PCR筛选阳性克隆，获得过量表达海螺碱合成酶编码基因的植物。

优选的，本发明海螺碱合成酶来源于颠茄，也可以使用来源于其他茄科TAs资源植物的海螺碱合成酶。

优选的，克隆海螺碱合成酶的编码基因的方法为：以颠茄cDNA为模板，SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示序列为引物进行PCR扩增，获得海螺碱合成酶的编码基因。

本发明的有益效果在于：本发明公开了海螺碱合成酶，经研究发现海螺碱合成酶LS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，将海螺碱合成酶在烟草中瞬时表达后注射1mM托品和1mM苯基乳酸作为LS的底物，能够检测到海螺碱的生成；将海螺碱合成酶用于转化颠茄后能够提高颠茄细胞系中海螺碱的含量，为提高颠茄中托品烷生物碱的含量具有重要的意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为UPLC-MS/MS法测定瞬时转化烟草中海螺碱。

图2为转基因毛状根LS基因表达量分析。

图3为转LS超表达载体的转基因毛状根海螺碱含量。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、海螺碱合成酶(littorine synthase，LS)基因的克隆

(1)颠茄须根总RNA的提取

取适量颠茄须根组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，在分光光度计上测定RNA浓度。

(2)LS基因的克隆

以所提取的总RNA为模板，按照天根FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA；设计基因特异性引物，具体引物如下：

F：5’-gtattagtttctggcttgtaattca-3’(SEQ ID NO.7)；

R：5’-cctactctgttatccaagaaaaaga-3’(SEQ ID NO.8)；

通过PCR从总cDNA中扩增LS基因，并测序。

通过上述步骤，获得了颠茄LS基因的全长编码序列如SEQ ID NO.1所示，推导出其蛋白编码序列如SEQ ID NO.2所示，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

实施例2、利用烟草验证LS基因的功能

(1)LS表达载体构建

由于海螺碱生物合成所需要的苯乳酰葡萄糖没有商业化的来源，因此利用烟草来验证LS的功能。构建LS瞬时表达载体pEAQ-LS，以pEAQ-YFP作为对照。载体构建中，正向引物中引入了AgeI的酶切位点，反向引物中引入了XhoI的酶切位点，具体引物如下：

pEAQ-LS-F：5’-cgcaccggtatgaagaaaacaattgtggttcca-3’(SEQ ID NO.3)；

pEAQ-LS-R：5’-cgcctcgagttatagaggttgataatatatcc-3’(SEQ ID NO.4)；

pEAQ-YFP-F：5’-cgcaccggtatggtgagcaagggcgagga-3’(SEQ ID NO.9)；

pEAQ-YFP-R：5’-cgcctcgagttacttgtacagctcgtccatg-3’(SEQ ID NO.10)。

然后以颠茄总cDNA为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物用AgeI和XhoI酶切后连入植物瞬时表达载体pEAQ-HT质粒的AgeI和XhoI酶切位点，获得瞬时表达载体pEAQ-LS。同时用pEAQ-YFP-F和pEAQ-YFP-R引物扩增黄色荧光蛋白YFP，采用AgeI和XhoI酶切YFP扩增产物和pEAQ-HT载体，获得pEAQ-YFP载体，并以此作为烟草瞬时转化的空载体对照。

(2)农杆菌介导的LS在烟草叶片中瞬时表达

将构建好的pEAQ-LS瞬时表达载体和pEAQ-YFP对照载体利用冻融法分别转化根癌农杆菌(如GV3101)，并进行PCR验证。结果表明，含LS的植物瞬时表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

取在温室中培养4-5周大小的烟草，将活化好的LS和对照YFP的瞬时表达工程菌利用1mL的注射器将菌液注射到烟草的叶片中，分别注射了两种菌液的烟草继续正常培养4天后，在叶片上再注射1mM托品和1mM苯基乳酸，提供LS的催化底物，注射后放置24h后收获材料，烟草叶片收获后，冷冻干燥至恒重，称取50mg的干燥样品，加入1mL(80％甲醇水溶液)提取液用于提取叶片中的代谢产物，超声提取30min后，样品经0.22μm滤膜过滤后用UPLC-MS/MS检测样品中海螺碱。

(3)UPLC-MS/MS法测定瞬时转化烟草中海螺碱

a、UPLC条件及系统适用性以及标准溶液的配制

UPLC：采用岛津UPLC(LC-30AD)系列色谱系统，装配AB Sciex Triple Quad 5500质谱检测器，色谱柱为C-18反相硅胶柱(Waters Symmetry，2.1*100mm，3.5μm)，流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈，采用梯度方式洗脱，洗脱程序见表1所示：

表1、采用梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	99	1
2	99	1
			6	80	20
7	5	95
			7.5	5	95
7.6	99	1
			10	99	1

柱温设定为40℃，流速0.4mL/min，进样量2μL，质谱检测器使用电喷雾离子源(ESI)，离子模式为正离子模式，采用多反应检测模式(MRM)，海螺碱鉴定选择离子对为290.2>91，海螺碱的保留时间为5.45min，峰型良好。精密称取海螺碱标准品(TRC公司)1.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到1mg/mL标准品溶液，用0.1％甲酸80％甲醇水溶液稀释成100ng/mL作为海螺碱标准样品。

检测结果如图1所示。结果显示，转pEAQ-LS的烟草中能够检测到海螺碱，而在对照的烟草中没有海螺碱合成，表明LS在烟草中具有催化托品和苯基乳酸生成海螺的碱活性。

实施例3、发根农杆菌介导的LS过表达载体遗传转化颠茄获得转基因颠茄毛状根

(1)含LS基因的植物双元过量表达载体的构建

为研究LS基因对颠茄中托品烷类生物碱的影响，构建LS过量表达载体pBI121-LS。载体构建中，正向引物中引入了BamHI的酶切位点，反向引物中引入了SacI的酶切位点，引物如下所示：

pBI121-LS-F：5’-cgcggatccatgcattataactcaacgtt-3’(SEQ ID NO.5)

pBI121-LS-R：5’-cgcgagctcttagaatctagagagaaact-3’(SEQ ID NO.6)

然后以颠茄总cDNA为模板，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物用BamHI和SacI酶切后连入pBI121质粒的BamH I和Sac I酶切位点，获得植物表达载体pBI121-LS。

本实施例将LS基因可操作性地连接于表达调控序列，该载体可用于通过过量表达LS基因来研究LS对海螺碱生物合成的影响。

(2)含LS超表达载体的发根农杆菌工程菌的获得

将植物表达载体pBI121-LS采用冻融法转入发根农杆菌(如C58C1)，并进行PCR验证。结果表明，含LS的植物双元过量表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株中。

(3)发根农杆菌介导LS基因转化颠茄

a.颠茄外植体准备

颠茄种子用体积分数为75％乙醇浸泡1min，再用质量分数为50％的NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的1/2MS固体培养基中，25℃、16h/8h(光亮/黑暗)光照培养，即可获得颠茄无菌苗。该条件下培养2周左右后，剪取无菌苗叶片和下胚轴外植体用于转化。

b.农杆菌与外植体的共培养

将所述外植体，加入活化好的所述含LS植物双元超表达载体的发根农杆菌工程菌的重悬液(MS+AS 100μmol/L)中，菌液与外植体充分接触5分钟，转到共培养培养基(MS+AS100μmol/L)上，28℃暗培养2d。

c.抗性毛状根的筛选

将所述的共培养2d的颠茄外植体转入到筛选培养基(MS+Kan 100mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃暗培养，每周继代培养一次，经过1-2次继代后即可获得Kan抗性毛状根。将生长良好的毛状根剪下转入培养基(MS+Cb 200mg/L)上培养至完全无菌，从而获得Kan抗性颠茄毛状根。

d.转基因颠茄毛状根的PCR检测

根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和LS分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化颠茄毛状根基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

将获得的转基因颠茄毛壮根采用荧光定量检测，结果如图2所示。结果显示，转基因毛壮根LS-1、LS-3、LS-6和LS-7的LS基因表达量增加，其中LS-6的LS基因表达量最高。

本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化颠茄的含LS植物双元过表达载体的发根农杆菌菌株，利用所构建的发根农杆菌菌株转化颠茄，获得经PCR检测的转基因颠茄毛状根。转基因颠茄毛状根的获得为筛选获得较高海螺碱含量的颠茄毛状根和植株提供了直接素材和理论基础。

(4)UPLC-MS/MS法测定转基因颠茄毛状根和烟草中海螺碱含量

a.UPLC条件及系统适用性以及标准溶液的配制

UPLC：采用Waters UPLC(H-Class)系列色谱系统，装配Waters XEXO TQD质谱检测器，色谱柱为C-18反相硅胶柱(Waters ACQUITY UPLC BEH,2.1*100mm,1.7μm，Waters)，流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈，采用梯度方式洗脱，洗脱程序与表1相同。

柱温设定为40℃，流速0.4mL/min，进样量2μL，质谱检测器使用电喷雾离子源(ESI)，离子模式为正离子模式，采用多反应检测模式(MRM)，海螺碱定量选择离子对为290.1>124.1，海螺碱的保留时间为5.76min，峰型良好。精密称取海螺碱标准品(TRC公司)1.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到1mg/mL标准品溶液，用0.1％甲酸20％甲醇水溶液依次稀释成相应浓度的系列标准溶液1000ng/ml，500ng/ml，200ng/ml，100ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，10ng/ml，5ng/ml,2ng/ml，1ng/ml，用于绘制海螺碱标准曲线。

b.样品的制备和海螺碱含量的测定

收获在MS培养液中培养30天的毛状根，材料于冷冻干燥机中冻干至恒重。磨成粉末，称取约25mg干粉于2ml Eppendorf管中，加入1mL生物碱提取液(20％甲酸水溶液，含0.1％甲酸)，在水平摇床上震荡提取3h，室温静置1h，12000rpm高速离心去除残渣，上层液体过0.22μm滤膜，样品即可用于UPLC-MS/MS测定海螺碱的含量。使用Waters MassLynxV4.1工作站计算样品中海螺碱含量，根据使用的植物材料的干重，从而计算出颠茄毛状根中海螺碱的含量，结果为三次重复的平均值，误差线表示标准差，统计分析用t-test检验，测量结果如图3所示。

结果显示，在转LS超表达载体的转基因毛状根显著提高了海螺碱含量。在普通毛状根中海螺碱含量为240.11μg/g DW时，同时期转LS过表达载体颠茄毛状根中海螺碱的含量平均达到694.47μg/g DW，其含量是非转基因颠茄毛状根含量的2.89倍。

本实施例采用使用UPLC-MS/MS法测定了转基因颠茄毛状根中海螺碱含量，采用转化LS过表达载体代谢工程策略发现LS基因的表达与海螺碱的含量具有明显的关联关系，为利用该基因进行过表达研究进而提高颠茄中海螺碱的含量提供了有力的实验证据。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 海螺碱合成酶及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 颠茄(Atropa belladonna)

<400> 1

atgaagaaaa caattgtggt tccaatcttg aagtaccata agattttgct tctctttgtt 60

ttaatactag tactcttgct ttgcccactg attgaagctg caggtacacc agtcaagtat 120

cttcctggat ttggaccact tccttttgaa tttgaaactg gttatgtagg attaggtgaa 180

tcagaggaag tgcaactctt ctattacttt ttcaagtcag agtcgaatcc agaagttgac 240

cccctcattc tttggatcac tggaggccct ggttgtggtg cacttaatgc aataactact 300

gaactcggac cagtgctact tgatgctaag gagtacgatg ggagcttgcc aacattgtca 360

ttgaatcctt actcatacac aaaggtcgca aatattatct ttctagattc acctgtgact 420

ggtggatttt catatgcaac aactaaagaa gctaatcatt cagataatgt acaaatggct 480

ctacacactc atcaatttgt tcaaaagtgg ttagttgacc attcggagta tttatcaaat 540

gatttttatg tggctggaga ctcatactcg ggaatttcag ttccaattat cactcaggtg 600

atatcagatg gtaatgaagc tggaaataag ccatggataa atcttaaggg atacatactt 660

ggaaatgcag taacatttcg tccagatgaa caaaattata ggataccaca cgctcatgga 720

ttggccctta tatccgacga actttacaag tcattggagt caagctgtgg aggggagtat 780

caatacatag atcaaactaa tacacattgt ttgcagcacg ttcagacttt caatcggttg 840

gtttctggaa tatattttga acacatacta gagcccattt gcaaccctgt ttctacaaaa 900

gctcgtcact tgtctcctca gagaagatat cttaatcaga aacttggaca attgaaaaat 960

cctactatgc ttcctggagt gaaatgtcga gatgagtggc acttgctatc agaaatatgg 1020

gttaatgatg aaactgttca agaagctctt catgttcgaa aggggacaca tggaatatgg 1080

aagcaatgcc caaattatga aaaaatgcct ttcactagaa ctatcaacaa taccataccc 1140

tttcatgcat ctctaagcaa aaaaggttat aggtctttaa tatacagtgg tgattatgat 1200

ctctatgtac catttctttc aacacaagca tggataagat cattaaatta ctctattgat 1260

acggaatgga gacggtggtt cgttgatggt caagttgctg ggtatgtgac aacttactca 1320

aatcaaatga catttacaac cattaagggt gcaggacata ctgctccaga gtacaagcct 1380

gctgagtgtc tggccatgct caagagatgg atatattatc aacctctata a 1431

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> 颠茄(Atropa belladonna)

<400> 2

Met Lys Lys Thr Ile Val Val Pro Ile Leu Lys Tyr His Lys Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Phe Val Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Cys Pro Leu Ile Glu

20 25 30

Ala Ala Gly Thr Pro Val Lys Tyr Leu Pro Gly Phe Gly Pro Leu Pro

35 40 45

Phe Glu Phe Glu Thr Gly Tyr Val Gly Leu Gly Glu Ser Glu Glu Val

50 55 60

Gln Leu Phe Tyr Tyr Phe Phe Lys Ser Glu Ser Asn Pro Glu Val Asp

65 70 75 80

Pro Leu Ile Leu Trp Ile Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Ala Leu Asn

85 90 95

Ala Ile Thr Thr Glu Leu Gly Pro Val Leu Leu Asp Ala Lys Glu Tyr

100 105 110

Asp Gly Ser Leu Pro Thr Leu Ser Leu Asn Pro Tyr Ser Tyr Thr Lys

115 120 125

Val Ala Asn Ile Ile Phe Leu Asp Ser Pro Val Thr Gly Gly Phe Ser

130 135 140

Tyr Ala Thr Thr Lys Glu Ala Asn His Ser Asp Asn Val Gln Met Ala

145 150 155 160

Leu His Thr His Gln Phe Val Gln Lys Trp Leu Val Asp His Ser Glu

165 170 175

Tyr Leu Ser Asn Asp Phe Tyr Val Ala Gly Asp Ser Tyr Ser Gly Ile

180 185 190

Ser Val Pro Ile Ile Thr Gln Val Ile Ser Asp Gly Asn Glu Ala Gly

195 200 205

Asn Lys Pro Trp Ile Asn Leu Lys Gly Tyr Ile Leu Gly Asn Ala Val

210 215 220

Thr Phe Arg Pro Asp Glu Gln Asn Tyr Arg Ile Pro His Ala His Gly

225 230 235 240

Leu Ala Leu Ile Ser Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Leu Glu Ser Ser Cys

245 250 255

Gly Gly Glu Tyr Gln Tyr Ile Asp Gln Thr Asn Thr His Cys Leu Gln

260 265 270

His Val Gln Thr Phe Asn Arg Leu Val Ser Gly Ile Tyr Phe Glu His

275 280 285

Ile Leu Glu Pro Ile Cys Asn Pro Val Ser Thr Lys Ala Arg His Leu

290 295 300

Ser Pro Gln Arg Arg Tyr Leu Asn Gln Lys Leu Gly Gln Leu Lys Asn

305 310 315 320

Pro Thr Met Leu Pro Gly Val Lys Cys Arg Asp Glu Trp His Leu Leu

325 330 335

Ser Glu Ile Trp Val Asn Asp Glu Thr Val Gln Glu Ala Leu His Val

340 345 350

Arg Lys Gly Thr His Gly Ile Trp Lys Gln Cys Pro Asn Tyr Glu Lys

355 360 365

Met Pro Phe Thr Arg Thr Ile Asn Asn Thr Ile Pro Phe His Ala Ser

370 375 380

Leu Ser Lys Lys Gly Tyr Arg Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Asp

385 390 395 400

Leu Tyr Val Pro Phe Leu Ser Thr Gln Ala Trp Ile Arg Ser Leu Asn

405 410 415

Tyr Ser Ile Asp Thr Glu Trp Arg Arg Trp Phe Val Asp Gly Gln Val

420 425 430

Ala Gly Tyr Val Thr Thr Tyr Ser Asn Gln Met Thr Phe Thr Thr Ile

435 440 445

Lys Gly Ala Gly His Thr Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Ala Glu Cys Leu

450 455 460

Ala Met Leu Lys Arg Trp Ile Tyr Tyr Gln Pro Leu

465 470 475

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcaccggta tgaagaaaac aattgtggtt cca 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcctcgagt tatagaggtt gataatatat cc 32

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatcca tgcattataa ctcaacgtt 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcgagctct tagaatctag agagaaact 29

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtattagttt ctggcttgta attca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctactctgt tatccaagaa aaaga 25

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcaccggta tggtgagcaa gggcgagga 29

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcctcgagt tacttgtaca gctcgtccat g 31

Claims (10)

1.海螺碱合成酶，其特征在于：具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列；

2)将SEQ ID NO.2中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海螺碱合成酶功能的氨基酸酸序列。

2.权利要求1所述的海螺碱合成酶的编码基因，其特征在于：所述海螺碱合成酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述碱合成酶的核苷酸序列；

4)与1)或2)所述的序列杂交的核苷酸序列。

3.含有权利要求2或3所述海螺碱合成酶的编码基因的重组表达载体。

4.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述的海螺碱合成酶的编码基因插入植物表达载体得到表达海螺碱合成酶的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述海螺碱合成酶的编码基因的转基因细胞系或转基因重组菌。

6.根据权利要求2或3所述的转基因细胞系，其特征在于：所述细胞系为植物细胞系。

7.权利要求1所述海螺碱合成酶体内或体外催化托品和苯基乳酸合成海螺碱中的应用。

8.权利要求2或3所述海螺碱合成酶的编码基因、权利要求4或5所述的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物重建海螺碱合成途径中的应用。

9.权利要求1所述海螺碱合成酶、权利要求2或3所述海螺碱合成酶的编码基因、所述的重组表达载体、所述的转基因细胞系或转基因重组菌在具有托品烷生物碱生物合成途径的植物中提高海螺碱含量中的应用。

10.一种具有托品烷生物碱生物合成途径的植物中海螺碱含量的方法，其特征在于：将通过在具有托品烷生物碱生物合成途径的植物中过量表达权利要求2或3所述的海螺碱合成酶的编码基因。