CN110420323B - 一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110420323B
CN110420323B CN201910727459.4A CN201910727459A CN110420323B CN 110420323 B CN110420323 B CN 110420323B CN 201910727459 A CN201910727459 A CN 201910727459A CN 110420323 B CN110420323 B CN 110420323B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma bovis
inactivated
vaccine
mycoplasma
bovis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910727459.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110420323A (zh
Inventor
张亮
杨宏军
王基隆
张云飞
刘来兴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Original Assignee
Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science filed Critical Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Priority to CN201910727459.4A priority Critical patent/CN110420323B/zh
Publication of CN110420323A publication Critical patent/CN110420323A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110420323B publication Critical patent/CN110420323B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用，属于微生物和生物制品技术领域。所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株及疫苗佐剂。本发明从牛支原体灭活疫苗的制备的BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和牛支原体灭活疫苗使用的佐剂及临床应用上进行探究，探寻出了最佳的牛支原体BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和免疫佐剂，从而成功制备一种牛支原体灭活疫苗，该牛支原体灭活疫苗在临床应用中显示出良好的保护效果，具有良好的应用推广价值。

Description

一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物和生物制品技术领域，具体涉及一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛支原体(Mycoplasma bovis)是引起牛呼吸道炎症、乳腺炎和关节炎等多种症状的重要病原体之一。自1961年，Hale等人首次从美国乳汁中分离得到牛支原体后，世界各地陆续分离到牛支原体。2008年，我国首次在肉牛中暴发牛支原体肺炎疫情，此后相继在湖北、贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等地区的转运犊牛中发现该病，发病率为50％～100％，病死率高达10％-50％，给我国养牛业造成了巨大的经济损失。
一般而言，难以治疗牛支原体感染的原因在于它们缺乏细胞壁，这使得多数常用的广谱抗生素对它们无效。而且牛支原体的免疫机制非常复杂且特殊，至今尚未完全清楚。研究表明牛支原体与宿主免疫细胞相互作用能产生两种现象：免疫增强和免疫抑制。由于牛支原体基因的DNA高频率重组，表面脂蛋白具有高度的特异性，这就使牛支原体表型多变，也使得国内外有关疫苗的研究进程缓慢，只有美国将商品化的牛支原体疫苗投放市场。美国虽有两种商品化疫苗，但是在2011年，对这两种疫苗进行的犊牛免疫保护试验表明，两种疫苗中一种可以明显提高抗体水平，但是对牛的保护率约44％，而另一种疫苗的免疫效果不显著。因此目前，国内外市场上急需一种有效的商品化牛支原体疫苗，以控制牛支原体的流行和危害，提高犊牛和转运牛只成活率。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明通过优化筛选疫苗制备条件，从而成功制备一种牛支原体灭活疫苗，该牛支原体灭活疫苗在临床应用中显示出良好的保护效果，极具市场推广应用之价值。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种牛支原体灭活疫苗，所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体及疫苗佐剂。
其中，所述牛支原体为牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCC NO:M2019235。
进一步的，所述疫苗佐剂至少包括206佐剂和CpG免疫增强剂。
本发明的第二个方面，提供上述牛支原体灭活疫苗的制备方法，所述方法至少包括：将牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株灭活后，加入CpG免疫增强剂混匀后再加入206佐剂。
其中，所述牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株灭活具体方法包括：将牛支原体(Mycoplasma bovis)16M接种至改良Thiaucourt's培养基中培养后传代培养；加入二乙烯亚胺(BEI)灭活，得灭活牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株培养物。
本发明的第三个方面，提供上述牛支原体灭活疫苗在制备预防和/或治疗牛支原体感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明有益效果：本发明提供一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明从牛支原体灭活疫苗的制备的BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和牛支原体灭活疫苗使用的佐剂及临床应用上进行探究，探寻出了最佳的牛支原体BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和免疫佐剂，成功制备一种牛支原体灭活疫苗，该牛支原体灭活疫苗在实际临床应用中显示出良好的保护效果，同时本发明牛支原体灭活疫苗具有制备简单、成本相对低、对动物体刺激性小、安全有效等优点，推广后可望产生巨大的经济效益和社会效益。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中不同浓度BEI灭活剂对牛支原体的灭活效果图。
图2为实施例2中不同佐剂疫苗免疫后抗体消长规律图。
图3为实施例2中不同佐剂疫苗免疫14天后PBMC增殖水平测定图。
图4为实施例3中不同免疫方式免疫后抗体消长规律图。
图5为实施例4中免疫攻毒组肺脏大体病变图：肺脏表面无明显的实变区域。
图6为实施例4中空白攻毒组肺脏大体病变图：肺脏表面存在明显的实变区域(箭头指示部位)。
图7为实施例4中免疫攻毒组肺脏病理学观察图：肺泡结构完整、肺泡壁无明显增厚，肺间质无增生，200×。
图8为实施例4中空白攻毒组肺脏病理学观察图：肺泡塌陷、肺泡壁明显增厚，肺间质增生，肺泡腔内有少量细胞脱落，200×。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
如前所述，目前，国内外市场上急需一种有效的商品化牛支原体疫苗，以控制牛支原体的流行和危害，提高犊牛和转运牛只成活率。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种牛支原体灭活疫苗，所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体及疫苗佐剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述牛支原体为牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCC NO:M2019235。
该牛支原体16M株是从山东某牛场有气喘等特征的犊牛中进行牛支原体病原学检测，筛选出牛支原体阳性牛只，宰杀剖检后采集具有牛支原体肺炎典型特征病变的犊牛肺脏病变部位，经分离培养、生化鉴定、特异性PCR和16s rRNA测序，确定分离菌为牛支原体。经单菌落纯化后，该牛支原体强毒株在PPLO培养基中增殖滴度高，同时可诱发包括气喘、明显肺部实变等多种牛支原体感染典型临床病症，具有较强的致病力，经BEI灭活处理后，依然保持良好的免疫原性。
本发明的又一具体实施方式中，所述牛支原体灭活疫苗每头份剂量中包含至少4.0×1010CCU的灭活牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株。
本发明的又一具体实施方式中，所述疫苗佐剂至少包括206佐剂和CpG免疫增强剂。
本发明的又一具体实施方式中，每头份剂量牛支原体灭活疫苗为1-4mL(优选为2mL)。
本发明的又一具体实施方式中，所述牛支原体灭活疫苗为皮下注射型疫苗、后海穴注射型疫苗或肌注型疫苗，优选为肌注型疫苗；经试验验证，与皮下注射与后海穴注射方式相比，采用肌注方式免疫牛只，其抗体转阳时间较短，抗体峰值水平较高，抗体水平下降较慢，因此肌注为最佳的免疫方式。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述牛支原体灭活疫苗的制备方法，所述方法至少包括：将牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株灭活后，加入CpG免疫增强剂混匀后再加入206佐剂。
本发明中使用的206佐剂为法国Seppic公司生产，其是一种基于矿物油设计的油佐剂，从而制备水包油包水型乳化疫苗，使得疫苗更稳定和易于注射；本发明使用的CpG免疫增强剂，现有研究表明，其具有独特而强烈的免疫激活作用，能够直接或间接刺激动物B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞以及天然杀伤细胞的活化或增殖作用，本发明通过优化佐剂的选择，选取206佐剂和CpG免疫增强剂作为本发明疫苗佐剂，能够有效提高本发明疫苗的有效性。
本发明的又一具体实施方式中，所述牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株灭活具体方法包括：将牛支原体(Mycoplasma bovis)16M接种至改良Thiaucourt's培养基中培养后传代培养；加入BEI灭活，得灭活牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株培养物。
本发明的又一具体实施方式中，所述BEI终浓度为0.5-1.5％(优选为1.5％)，灭活温度为35-40℃(优选为37℃)，灭活时间为20-40小时(优选为24小时)；通过使用BEI作为灭活剂，既有效灭活牛支原体，同时保证免疫效果的充分发挥。
本发明的又一具体实施方式中，所述BEI灭活后加入无菌硫代硫酸钠终止灭活。
本发明的又一具体实施方式中，将终止灭活后的牛支原体培养物离心收集菌体，PBS清洗，重悬后备用。
本发明的又一具体实施方式中，控制中每头份牛支原体灭活疫苗包含至少4.0×1010CCU(优选为4.0×1010CCU)的灭活牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株。
本发明的又一具体实施方式中，控制每头份牛支原体灭活疫苗包含不低于600微克(优选为600微克)的CpG免疫增强剂；
本发明的又一具体实施方式中，所述206佐剂用量参照常规用量添加，进一步的，按照水相与油相(即206佐剂)质量比为1：1的方式加入206佐剂。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述牛支原体灭活疫苗在在制备预防和/或治疗牛支原体感染引起的疾病的药物中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。
实施例1：牛支原体灭活疫苗的制备的BEI灭活条件研究
将冻存的牛支原体16M菌株复苏后，接种到改良的Thiaucourt’s培养基中，37℃培养3天后1：20传代至950mL培养基中，置37℃培养2天获得1L培养物。测定该培养物中牛支原体的培养量(CCU/mL)，10 000g离心12min收集菌体，PBS清洗1次后，PBS重悬按比例浓缩后得到2.0×1010CCU/mL的牛支原体培养物备用。在培养物中加入BEI(分析纯)使其终浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％，37℃菌体灭活。分别在灭活前(0h)、灭活后4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h取样用于CCU测定。由此可得出牛支原体在不同浓度BEI灭活剂中随时间变化规律曲线，如图1。由图1可知，不同浓度的BEI都能将牛支原体菌株彻底灭活，浓度越大灭活时间越短，因此选择1.5％的BEI进行24h灭活。
实施例2：牛支原体灭活疫苗佐剂的研究
从牛支原体阴性牧场筛选健康的新断奶犊牛(2月龄左右)15头，适应性饲养一周后，将15头试验动物分为实验组A、实验组B和对照组C，每组5头。以免疫试验当天为0d，A组肌肉注射含206佐剂和CpG免疫增强剂的牛支原体灭活疫苗，2mL/头；B组肌肉注射只含206佐剂的牛支原体灭活疫苗，2mL/头；C组以PBS为安慰剂肌肉注射，2mL/头；从第0天至第35天每隔7天颈静脉采血，连续5次，每次采血5mL，分离血清后置于-80℃的冰箱保存备用。由图2可见，A组在免疫7天后部分牛只出现阳性，14天时A组平均抗体水平为阳性，较B组阳转时间短。A组和B组的抗体水平均在免疫后21天达到峰值，A组峰值抗体水平明显高于B组(P<0.05)。21天后，抗体开始下降，但在整个实验过程中A组相比B组一直保持较高的抗体水平。另一方面，分别采集A组和B组免疫后14天全血分离外周血淋巴细胞(PBMC)进行体外培养，并分别用牛支原体外膜蛋白(OMP)、灭活的牛支原体(inactivated M.bovis)和PBS刺激48h后检测细胞增殖情况。增殖实验结果如图3显示，A组中inactivated M.bovis刺激后细胞增殖情况明显高于PBS对照组(P<0.05)，而B组中各刺激物之间的差异不显著。综上所述，A组免疫效果较B组强，故选择206佐剂和CpG免疫增强剂用于牛支原体灭活疫苗的制备。
实施例3：牛支原体灭活疫苗的免疫方式研究
从牛支原体阴性牧场筛选健康的新断奶犊牛(2月龄左右)12头，适应性饲养一周后，将12头试验动物随机分为A、B、C 3个实验组和1个对照组，每组3头。以免疫试验当天为0d，A组肌肉注射免疫2mL/头，B组皮下注射免疫2mL/头，C组后海穴注射免疫2mL/头，对照组不做处理；第21天时每组以同样的方式和剂量加强免疫，从第0天至第35天每隔7天颈静脉采血，连续5次，每次采血5mL，分离血清后置于-80℃的冰箱保存备用。采用牛支原体商品化ELISA检测试剂盒(购自Bio-X公司)对血清中抗体水平进行检测，以确定各实验组疫苗免疫后的抗体消长规律，根据抗体起峰时间、峰值抗体水平和抗体持续时间，确定牛支原体灭活疫苗所用佐剂。由图4可见，三种免疫方式都能达到一定的免疫效果，其中通过后海穴和皮下免疫后抗体转阳时间较长，抗体峰值水平较低，抗体水平下降较快，因此肌注为最佳的免疫方式。
实施例4：牛支原体灭活疫苗的制备及临床应用
将牛支原体16M以1:20的比例接种到牛支原体Thiaucourt's液体培养基中，37℃条件下培养3天得到F1代菌液，再将F1代菌液以1:20接种到950mL液体培养基中，37℃条件下培养2天得到F2，F2代培养物即可用于制备牛支原体灭活疫苗。制备方法：以1:20接种到液体培养基中，37℃条件下培养3d得到F3代菌液；然后测定F3代菌液浓度(CCU/mL)并在F3代菌液中加入BEI溶液，使菌液中BEI终浓度为1.5％，37℃条件下灭活24h，灭活完成后分别吸取灭活菌液100微升涂布于Thiaucourt's固体培养基和普通琼脂培养基，分别进行灭活效果检测和无菌检验。向培养物中加入浓度为50％的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为1.5％，37℃中和并终止灭活1h。将中和后的灭活菌液10 000g离心12min收集菌体，PBS清洗1次后，PBS重悬至原浓度用于牛支原体疫苗的制备。重悬后的菌悬液中添加CpG免疫增强剂(终浓度为300微克/mL)后，与206佐剂进行等质量混合，置30±1℃条件下120rpm磁力搅拌乳化30min。经乳化效果检测合格后，进行疫苗无菌验证和安全性评价，并做好相应记录。
无菌验证：无菌操作吸取0.1mL疫苗，涂布到TSA固体培养基上，37℃倒置培养24h后，观察培养基上是否有菌落存在。若无菌落存在，验证该疫苗无菌；反之，则有菌，应重新制备疫苗。
疫苗安全性评价：选取成年的健康Balb/c小鼠8只，每只25g左右，雌雄各半。每只小鼠分别肌肉注射疫苗0.1mL，连续7天测量体温和观察小鼠精神状态，若小鼠无发热、食欲不振、被毛粗糙、精神萎靡和死亡等症状，该疫苗符合安全性要求；反之，不符合安全性要求，应重新制备疫苗。实验结果显示，合格疫苗在安全性实验中，小鼠均无发热、发热、食欲不振、被毛粗糙、精神萎靡和死亡等不良反应。
制备好的疫苗应冷藏保存于4℃冰箱中，用于临床试验。选取牛支原体、巴氏杆菌和BVDV的血清ELISA检测和鼻拭子PCR均为阴性的60日龄断奶犊牛9头，随机分为免疫攻毒组、空白攻毒组和空白对照组。犊牛免疫剂量为2mL/头/次，首次免疫后第21天进行第2次免疫，在第35天时用牛支原体临床分离株高代次(5代以内)新鲜培养物，调整浓度至5.0×109CCU/mL，对免疫攻毒组和空白攻毒组犊牛进行鼻腔接种攻毒，攻毒剂量为2mL，连续2天攻毒2次。攻毒后第50天将各试验组牛只进行病理剖检，并采集牛只肺脏、气管、喉头、肝脏、脾脏和关节组织各三份：一份固定于10％福尔马林溶液，用于制作石蜡切片和HE染色，光学显微镜下比较观察病理变化；一份用于牛支原体的分离培养；一份用于牛支原体PCR检测。
大体剖检结果如图5和图6显示，免疫攻毒组剖检发现，肺脏无肉眼可见病变；空白攻毒组剖检发现，肺脏组织发生实质性肉变，其他组织均无肉眼可见病理变化。病理学变化如图7和图8显示，免疫攻毒组肺脏和气管组织无明显病理组织学变化；空白攻毒组可见细支气管缩小，皱襞增多，官腔内有少量脱落的上皮细胞，肺泡塌陷、肺泡隔增厚，组织增生，肺泡腔内有少量细胞脱落。牛支原体分离培养与PCR检测结果显示，免疫攻毒组肺脏、肝脏、脾脏和关节等组织均为阴性，而空白攻毒组肺脏组织均检测为阳性。综上所述，牛支原体双佐剂灭活疫苗在临床应用中显示出良好的保护效果，说明本发明的牛支原体灭活疫苗可用于预防犊牛牛支原体肺炎，具有良好的应用推广价值。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于，所述牛支原体灭活疫苗包括灭活的牛支原体和疫苗佐剂；
其中，所述牛支原体为牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCC NO: M2019235；
所述疫苗佐剂包括206佐剂和CpG免疫增强剂；
所述牛支原体灭活疫苗的制备方法包括：将牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株灭活后，加入终浓度为300微克/mL CpG免疫增强剂混匀后再加入206佐剂；
所述牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株灭活具体方法：将牛支原体（Mycoplasmabovis）16M接种至改良Thiaucourt's培养基中培养后传代培养；加入二乙烯亚胺灭活，得灭活牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株培养物；
所述牛支原体灭活疫苗每头份剂量中包含4.0×1010CCU的灭活牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株；
所述牛支原体灭活疫苗为肌注型疫苗；
每头份剂量牛支原体灭活疫苗为2mL。
2.权利要求1所述牛支原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株灭活后，加入终浓度为300微克/mL CpG免疫增强剂混匀后再加入206佐剂；
所述牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株灭活具体方法包括：将牛支原体（Mycoplasmabovis）16M接种至改良Thiaucourt's培养基中培养后传代培养；加入二乙烯亚胺灭活，得灭活牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株培养物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述二乙烯亚胺终浓度为0.5-1.5%，灭活温度为35-40℃，灭活时间为20-40小时。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二乙烯亚胺终浓度为1.5%，灭活温度为37℃，灭活时间为24小时；
二乙烯亚胺灭活后加入无菌硫代硫酸钠，中和并终止灭活；
将终止灭活后的牛支原体培养物离心收集菌体，PBS清洗，重悬后备用。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，每头份牛支原体灭活疫苗包含4.0×1010CCU的灭活牛支原体（Mycoplasma bovis）16M株。
6.权利要求1所述牛支原体灭活疫苗在制备预防和/或治疗牛支原体感染引起的疾病的药物中的应用。
CN201910727459.4A 2019-08-07 2019-08-07 一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用 Active CN110420323B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910727459.4A CN110420323B (zh) 2019-08-07 2019-08-07 一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910727459.4A CN110420323B (zh) 2019-08-07 2019-08-07 一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110420323A CN110420323A (zh) 2019-11-08
CN110420323B true CN110420323B (zh) 2023-02-03

Family

ID=68414828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910727459.4A Active CN110420323B (zh) 2019-08-07 2019-08-07 一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110420323B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1814757A (zh) * 2005-02-03 2006-08-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种CpG DNA新型佐剂及其制造方法和含有该佐剂的疫苗
CN102212524A (zh) * 2010-04-02 2011-10-12 于湛 作为牛和猪免疫调节剂及疫苗佐剂的脱氧寡核苷酸
CN105441368A (zh) * 2016-01-19 2016-03-30 福清市默克兽医院 一株牛支原体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1814757A (zh) * 2005-02-03 2006-08-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种CpG DNA新型佐剂及其制造方法和含有该佐剂的疫苗
CN102212524A (zh) * 2010-04-02 2011-10-12 于湛 作为牛和猪免疫调节剂及疫苗佐剂的脱氧寡核苷酸
CN105441368A (zh) * 2016-01-19 2016-03-30 福清市默克兽医院 一株牛支原体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CpG oligodeoxynucleotide and montanide ISA 206 adjuvant combination augments the immune responses of a recombinant FMDV vaccine in cattle;Jiling Ren, Liang Yang, Haifei Xu, 等;《vaccine》;20111026;第29卷(第45期);摘要，介绍，讨论部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110420323A (zh) 2019-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103263666B (zh) 猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法
JPH06503708A (ja) 不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・バクテリンおよびその使用方法
KR20060054352A (ko) 유럽 기원의 로소니아 인트라셀룰라리스, 및 이의 백신,진단제 및 사용 방법
CN112779193B (zh) 一株滑液囊支原体强毒株及其应用
CN102068694A (zh) 鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生产方法
CN107802831B (zh) 一种灭活乳酸菌疫苗佐剂
CN109306360A (zh) 一种利用杆状病毒表达外源蛋白的方法及其应用
CN104981252A (zh) 包含支原体抗原的免疫原性组合物
JP6313752B2 (ja) Ｂ．ブロンキセプチカ（Ｂ．Ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）感染から保護するためのイヌ呼吸器コロナウイルスでのワクチン接種
CN110420323B (zh) 一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用
Li et al. Study on preparation of a Streptococcus suis ghost vaccine
CN112063596A (zh) 鸽副黏病毒1型ppmv-1/bj-c株及其应用
CN103937817A (zh) 鸡新城疫病毒yt毒株、其全基因组序列及其应用
CN106834168A (zh) 一种猪链球菌2型弱毒株及其应用
CN104069489B (zh) 鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法
CN102139104A (zh) 鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生产方法
CN109134619A (zh) 猪圆环病毒2型抗原、其制备的免疫原性组合物、制备方法和应用
CN109106946B (zh) 一种奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法
Emikpe et al. Intranasal Inactivated Recombinant Mannheimia hemolytica Vaccine is not protective against naturally occurring Pneumonia in Nigerian Goats
CN1202251C (zh) 传染性法氏囊病病毒(ibdv)多聚蛋白基因(vp2/vp4/vp3)真核表达质粒及dna疫苗
CN114573708A (zh) 副鸡禽杆菌ha融合蛋白及其三聚体、制备的疫苗组合物、制备方法和应用
CN107029230A (zh) 一种疫苗组合物、试剂盒及其制备方法和应用
CN112920976B (zh) 一株绵羊肺炎支原体强毒株及其应用
CN103585622A (zh) 猪支原体肺炎疫苗株的应用
CN104498384B (zh) 一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant