CN110420317A - Cblb502蛋白在防治创伤后应激障碍中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CBLB502蛋白在防治创伤后应激障碍中的应用。本发明首次发现CBLB502可以显著抑制电刺激诱导的PTSD综合征的症状。CBLB502可以用于预防和治疗PTSD。本发明对于PTSD的预防和治疗方法研究有重要意义。

Description

CBLB502蛋白在防治创伤后应激障碍中的应用

技术领域

本发明涉及创伤后应激障碍预防和救治领域，具体涉及CBLB502蛋白在防治创伤后应激障碍中的应用。

背景技术

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指在个体遭受重大的、威胁性的、灾难性的创伤事件如战争、恐怖袭击、重大灾害(地震、交通事故等)或性侵害之后所表现出的、致使其职业能力和社会功能受损的难以治愈的慢性持续性精神疾病，最早源自战争中对战斗应激相关精神行为的描述慢性精神疾病。随着现代高科技战争的巨大破坏力和震慑力增加，以及某些特殊场环境对军人心理造成巨大压力，容易引发心理与生理应激调控紊乱，导致PTSD发病率远远高于以往任何时期的传统战争。PTSD可导致患者神经、心血管、呼吸道、胃肠道、内分泌等系统疾病。创伤后应激障碍已成为当前威胁人们心理健康的一类疾病。

2014年，世界精神卫生调查显示，12个月内全球PTSD患病率平均为1.1％，但实际终身患病率远高于此。PTSD的症状包括噩梦、失眠、闪回，以及对创伤事件相关人物、场所和情景的逃避，过度警觉及负向认知情绪变化，在生理、行为、情感等多个方面受到影响。PTSD常常与焦虑、恐惧、抑郁等病症表现上有所重叠。PTSD的产生不仅威胁到患者正常的社交，也会进一步产生较为明显的功能性残疾，加重患者家庭的负担。

目前针对创伤后应激障碍的患者，主要是采取药物加心理干预的治疗方式。其中，心理治疗则是结合心理动力学疗法、催眠疗法、认知行为疗法等方式来实施干预，让患者能够在放松的状态下提升心理健康水平，加快治愈速度。而药物治疗主要是加入镇静及抗焦虑等方面的药物来进行对症处理，这是一种生理上缓解疾病痛苦的方式。但是PTSD的脑机制尚未阐明，治疗药物稀缺。一线药物主要包括选择性5-羟色胺(5-HT)重摄取抑制剂舍曲林和帕罗西汀，属于抗抑郁剂的扩大适应证，二者是目前仅有的获美国食品药品管理局(FDA)批准的PTSD临床用药。它们皆存在起效缓慢(2～6周)、有效率低(50％)和不良反应多(认知功能损伤、性功能障碍)等缺陷。目前，对于抗PTSD的特定靶标除5-HT转运蛋白外几乎阙如，使得PTSD的治疗陷入“瓶颈”，因此，发现抗PTSD的潜在新型药理学靶标具有开拓性意义。

CBLB502是美国人于2008年首先发现，其来自于沙门氏菌鞭毛蛋白，经过结构改造，极大降低了免疫原性，副作用较低，具有非常好的辐射防护作用。

发明内容

本发明的目的是提供CBLB502蛋白在防治创伤后应激障碍中的应用。

本发明首先保护CBLB502蛋白在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防和/或治疗创伤后应激障碍。

所述产品具体可为药物或制剂。

本发明还保护一种产品，其活性成分为CBLB502蛋白；所述产品的用途为预防和/或治疗创伤后应激障碍。

所述产品具体可为药物或制剂。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗创伤后应激障碍的药物组合物，含有有效浓度的CBLB502蛋白和药物赋形剂或辅剂。

本发明还保护CBLB502蛋白在开发用于预防和/或治疗创伤后应激障碍的产品中的应用。

所述产品具体可为药物或制剂。

以上任一所述CBLB502蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列表的序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

(a3)与序列表的序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

以上任一所述CBLB502蛋白具体可通过培养重组菌诱导表达CBLB502蛋白获得；所述重组菌是将含有CBLB502蛋白编码基因的重组表达载体导入出发菌中得到的。所述出发菌为大肠杆菌，更具体为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述重组表达载体具体是将质粒pBV220的SmaI和SalI酶切位点之间的片段替换为序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组表达载体。

所述培养重组菌诱导蛋白表达CBLB502蛋白的方法具体如下：

(1)将所述重组菌接种于LB培养基(也可以采用2×YT基础培养基替代)中，30℃、200rpm震荡培养6h后，于42℃、150-200rpm诱导3小时，诱导结束后8000rpm离心15分钟离心收集菌体；

(2)采用纯化水重悬步骤(1)得到的菌体沉淀，置冰上超声破碎后得到全细胞裂解液；

(3)将步骤(2)得到的全细胞裂解液离心后收集沉淀，将沉淀采用20mM Tris-HCl(pH 6.8)/2M尿素溶解，再经DEAE Fast Flow层析柱、疏水层析柱进行层析纯化，最终获得产物为单一分子量为31KD的CBLB502蛋白。

本发明首次发现CBLB502蛋白可以显著抑制电刺激诱导的PTSD综合征的症状。本发明的发明人应用电刺激模型制备了PTSD小鼠，通过对模型组与对照组小鼠比较发现，PTSD小鼠的不动时间非常显著增加，活动次数非常显著减少，且差异均具有统计学意义(P<0.001)。在小鼠腹腔注射给予CBLB502后，对照给药组与单纯对照组之间各项指标均未见显著差异，提示药物干预不影响正常小鼠。但PTSD模型给药组与模型对照组各项指标之间的差异均非常显著，其中PTSD模型给药组小鼠的不动时间以及不动时间百分比与模型对照组之间相比均非常显著下降，且差异均具有统计学意义(P<0.01)，而活动次数、活动时间、活动速度、活动总距离以及活动轨迹等均显著提高(P<0.05或P<0.01)，尽管仍然低于正常对照给药组小鼠，但与正常对照给药组之间的差异不具有统计学意义(P>0.05)。上述结果提示CBLB502蛋白可以用于预防和治疗PTSD。本发明对于PTSD的预防和治疗方法研究有重要意义。

附图说明

图1为第二周电刺激制备PSTD模型的指标检测。

图2为第三周电刺激制备PSTD模型的指标检测。

图3为各组小鼠不动时间的检测结果。

图4为各组小鼠不动时间百分比的检测结果。

图5为各组小鼠活动次数的检测结果。

图6为各组小鼠活动总距离的检测结果。

图7为各组小鼠活动时间的检测结果。

图8为各组小鼠平均活动速度的检测结果。

图9为各组小鼠活动轨迹的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

C57BL/6小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司，雄性，体重18-22g。

质粒pBV220：参考文献：汤立宣，新型抗放射药物CBLB502在大肠杆菌体系中的表达及其活性的初步研究，安徽医科大学学位论文，2010年.；公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。

实施例1、CBLB502蛋白的制备

CBLB502蛋白如序列表的序列2所示，其编码基因如序列表的序列1所示。

1、将质粒pBV220的SmaI和SalI酶切位点之间的片段替换为序列表的序列1所示的DNA分子，得到重组表达载体。

2、将步骤1得到的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

3、将步骤2得到的重组菌接种于LB培养基(也可以采用2×YT基础培养基替代)中，30℃、200rpm震荡培养6h后，于42℃、150-200rpm诱导3小时，诱导结束后8000rpm离心15分钟离心收集菌体。

4、采用纯化水重悬步骤3得到的菌体沉淀，置冰上超声破碎后得到全细胞裂解液。

5、将步骤4全细胞裂解液离心后收集沉淀，将沉淀采用20mM Tris-HCl(pH 6.8)/2M尿素溶解，再经DEAE Fast Flow层析柱、疏水层析柱进行层析纯化，最终获得产物为单一分子量为31KD的CBLB502蛋白溶液。

CBLB502蛋白的制备方法也可参照文献：汤立宣，新型抗放射药物CBLB502在大肠杆菌体系中的表达及其活性的初步研究，安徽医科大学学位论文，2010年.。

实施例2、CBLB502蛋白在防治创伤后应激障碍中的应用。

1、将实验动物(C57BL/6小鼠)分为对照组、对照给药组、模型组和模型给药组，每组10只。

2、将步骤1分组后，将实验动物于常规饲养环境下放置一周(第一周)。

3、完成步骤2后，即第二周开始分组进行如下操作：

模型组：第二周时，腹腔注射体积为0.1毫升PBS后进行电刺激；电刺激方法如下：将小鼠置于电击箱内，允许其自由探索5min(自发活动时间)，随后的5min(刺激活动时间)内间断予以小鼠共15次不可逃避的足底击(0.8mA，间隔10s，持续时间10s)。第三周再重复一次第二周的操作。其余时间正常饲养。

模型给药组：第二周时，小鼠腹腔注射CBLB502(给药浓度0.2mg/kg体重，体积为0.1毫升)，然后进行电刺激；电刺激方法如下：将小鼠置于电击箱内，允许其自由探索5min(自发活动时间)，随后的5min(刺激活动时间)内间断予以小鼠共15次不可逃避的足底击(0.8mA，间隔10s，持续时间10s)。第三周再重复一次第二周的操作。其余时间正常饲养。

对照组：第二周时，对照组小鼠腹腔注射体积为0.1毫升PBS，将实验动物置于测试箱内10min(前5min作为自发活动时间的对照，后5min作为刺激活动时间的对照)，不施以电击。第三周再重复一次第二周的操作。其余时间正常饲养。

对照给药组：第二周时，对照组小鼠腹腔注射CBLB502(给药浓度0.2mg/kg体重，体积为0.1毫升)，将实验动物置于测试箱内10min(前5min作为自发活动时间的对照，后5min作为刺激活动时间的对照)，不施以电击。第三周再重复一次第二周的操作。其余时间正常饲养。

在第二周和第三周实验过程中测定模型指标，在上述自发时间和刺激时间通过开场上方的摄像机观察和记录小鼠的活动。

第一次电刺激后PSTD模型制备指标检测结果如图1所示。结果表明，各组小鼠在自发阶段的不动时间和活动时间没有差异，但在电刺激后模型组以及模型给药组小鼠的不动时间显著增加、活动时间显著下降(P<0.001)，产生了较为显著的焦虑状态，。

第二次电刺激后PSTD模型制备指标检测结果如图2所示。结果表明，模型组和模型给药组小鼠在自发阶段的不动时间高于对照组和对照给药组，活动时间则相反(P<0.01)。说明前一周模型组和模型给药组经过电刺激后保留了电刺激对小鼠产生的效果。在第二次电刺激后，与对照组和对照给药组相比，模型组以及模型给药组小鼠的不动时间显著增加、活动时间显著下降(P<0.001)，表明模型组和模型给药组小鼠的焦虑状态得到了巩固。

上述结果显示，PTSD模型制备成功。此时，模型给药组中药物并没有发挥作用，原因是药物起作用需要一定时间，并且此时可能刺激因素起主导作用。因此，模型给药组各项指标的变化与模型组相同。

在第四周测定药效指标时，通过开场上方的摄像机观察和记录小鼠的活动5min(全部为自发活动)。通过计算机应用系统自动记录并计算各项指标(包括不动时间、不动时间百分比、活动总距离、活动次数、活动时间、以及平均活动速度)等。第四周不进行电刺激，考察药物对对PTSD的影响。

第四周各组小鼠不动时间的检测结果如图3所示。结果显示，对照组小鼠在自发阶段的不动时间没有显著差异，但模型组小鼠显著升高(P<0.001)，模型组给药组相比模型组显著下降(P<0.01)。

第四周各组小鼠不动时间百分比的检测结果如图4所示。结果显示，第四周，对照组小鼠在自发阶段的不动时间百分比没有显著差异，但模型组小鼠显著升高(P<0.001)，模型组给药组相比模型组显著下降(P<0.01)。

第四周各组小鼠活动次数的检测结果如图5所示。结果显示，第四周，对照组小鼠在自发阶段的活动次数没有显著差异，但模型组小鼠显著下降(P<0.001)，模型组给药组相比模型组显著回升(P<0.05)。

第四周各组小鼠活动总距离的检测结果如图6所示。结果显示，第四周，对照组小鼠在自发阶段的活动总距离没有显著差异，但模型组小鼠显著下降(P<0.001)，模型组给药组相比模型组显著回升(P<0.01)。

第四周各组小鼠活动时间的检测结果如图7所示。结果显示，第四周，对照组小鼠在自发阶段的活动时间没有显著差异，但模型组小鼠显著下降(P<0.001)，模型组给药组相比模型组显著回升(P<0.05)。

第四周各组小鼠平均活动速度的检测结果如图8所示。结果显示，第四周，对照组小鼠在自发阶段的平均活动速度没有显著差异，但模型组小鼠显著下降(P<0.001)，模型组给药组相比模型组显著回升(P<0.05)。

第四周各组小鼠活动轨迹的检测结果如图9所示。结果显示，第四周，对照组小鼠在自发阶段的活动轨迹记录均较少，而且没有显著差异，但模型组小鼠活动轨迹记录下降，模型组给药组相比模型组活动轨迹又显著回升。

上述结果显示，PTSD模型组小鼠在自发阶段的不动时间、不动时间百分比显著高于照小鼠，活动距离、总距离、活动时间以及平均速度均显著低于对照小鼠。PTSD模型给药组小鼠的不动时间、不动时间百分比与模型组小鼠相比显著降低(P<0.01)，而活动距离、总距离、活动时间、平均速度以及活动轨迹等指标则均显著提高(P<0.05)。

上述结果表明CBLB502可以显著抑制PTSD，对PTSD具有显著预防和治疗作用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> CBLB502蛋白在防治创伤后应激障碍中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60

tctcagtcct cactgagttc cgctattgag cgtctgtcct ctggtctgcg tatcaacagc 120

gcgaaagacg atgcggcagg ccaggcgatt gctaaccgct tcacttctaa tatcaaaggt 180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggcatttcta ttgcgcagac cactgaaggt 240

gcgctgaatg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg agttgtctgt tcaggccact 300

aacgggacta actctgattc cgatctgaaa tctatccagg atgaaattca gcaacgtctg 360

gaagaaatcg atcgcgtttc taatcagact caatttaacg gtgttaaagt cctgtctcag 420

gacaaccaga tgaaaatcca ggttggtgct aacgatggtg aaaccattac catcgatctg 480

caaaaaattg atgtgaaaag ccttggcctt gatgggttca atgttaattc cccaggaatt 540

tccggagggg gagggggaat tctggactct atggggacat taatcaatga agacgctgcc 600

gcagccaaga aaagtaccgc taacccactg gcttcaattg attctgcatt gtcaaaagtg 660

gacgcagttc gttcttctct gggggcaatt caaaaccgtt ttgattcagc cattaccaac 720

cttggcaata cggtaaccaa tctgaactcc gcgcgtagcc gtatcgaaga tgctgactat 780

gcaacggaag tttctaatat gtctaaagcg cagattctgc agcaggctgg tacttccgtt 840

ctggcgcagg ctaaccaggt tccgcaaaac gtcctctctt tactgcgtta a 891

<210> 2

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser

85 90 95

Val Gln Ala Thr Asn Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Lys Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Gln Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met

130 135 140

Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu

145 150 155 160

Gln Lys Ile Asp Val Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn

165 170 175

Ser Pro Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Leu Asp Ser Met Gly

180 185 190

Thr Leu Ile Asn Glu Asp Ala Ala Ala Ala Lys Lys Ser Thr Ala Asn

195 200 205

Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Lys Val Asp Ala Val Arg

210 215 220

Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile Thr Asn

225 230 235 240

Leu Gly Asn Thr Val Thr Asn Leu Asn Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu

245 250 255

Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile

260 265 270

Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro

275 280 285

Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg

290 295

Claims (8)

1.CBLB502蛋白在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防和/或治疗创伤后应激障碍。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或制剂。

3.一种产品，其活性成分为CBLB502蛋白；所述产品的用途为预防和/或治疗创伤后应激障碍。

4.如权利要求3所述的产品，其特征在于：所述产品为药物或制剂。

5.一种用于预防和/或治疗创伤后应激障碍的药物组合物，含有有效浓度的CBLB502蛋白和药物赋形剂或辅剂。

6.CBLB502蛋白在开发用于预防和/或治疗创伤后应激障碍的产品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或制剂。

8.如权利要求1至7任一所述的应用或产品或药物组合物，其特征在于：所述CBLB502蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列表的序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

(a3)与序列表的序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。