CN110420234A

CN110420234A - 八宝丹在制备用于预防或治疗流感继发细菌性感染的药物中的用途

Info

Publication number: CN110420234A
Application number: CN201910880295.9A
Authority: CN
Inventors: 关斌; 钱景; 墙世发; 王毅; 程翼宇; 詹志学; 南淑华; 赖志成; 陈西翌; 陈晓琳; 郑珊珊; 许玉珍; 何敏婉; 曾智发; 阳丽华
Original assignee: XIAMEN TRADITIONAL CHINESE MEDICINE CO Ltd
Current assignee: XIAMEN TRADITIONAL CHINESE MEDICINE CO Ltd
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2039-09-18
Also published as: CN110420234B

Abstract

本发明涉及八宝丹在制备用于预防或治疗流感继发细菌性感染的药物中的用途。

Description

八宝丹在制备用于预防或治疗流感继发细菌性感染的药物中的用途

技术领域

本发明属于中药领域，更具体而言，本发明涉及八宝丹在制备用于预防或治疗流感继发细菌性感染的药物中的用途。

背景技术

八宝丹源自中药古方，具有清利湿热、活血解毒、去黄止痛等功效。适用于湿热蕴结所致发热、黄疸、小便黄赤、恶心呕吐、纳呆、肋痛腹胀、舌苔黄腻或厚腻干白，或湿热下注所致尿道灼热刺痛、小腹胀痛，以及传染性病毒性感染、急性胆囊炎、急性泌尿系统感染等。

现代药理学研究表明八宝丹具有抗炎、解热、镇痛、保肝、利胆、去黄等功效。临床实验显示，八宝丹胶囊治疗慢性胆囊炎总有效率高于胆舒胶囊。八宝丹胶囊辅助黄疸型病毒性肝炎治疗，可改善临床症状及肝功能，具有较好的退黄效果，疗效和苦黄胶囊相似；可有效地改善病毒性肝炎所致的难治性黄疸；对慢性病毒感染引起的肝细胞损伤具有一定的保护作用。

此外，八宝丹还可用于肿瘤的辅助治疗。八宝丹对体外培养的人肺腺癌A549细胞、人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌LoVo细胞均有明显的杀伤作用。八宝丹抑制骨肉瘤U-20S细胞增殖并诱导其凋亡，药效呈时间和剂量的依赖关系。八宝丹与抗肿瘤药物联合用药，在临床上能够降低化疗药物的副作用，提高患者生活质量。此外，八宝丹可促进正常及荷瘤小鼠的T淋巴细胞免疫功能，可降低荷瘤小鼠外周血、脾脏和骨髓细胞中髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)比例，改善肿瘤免疫。

流感是由流感病毒感染引起的急性呼吸道传染病。流感病毒可增加细菌易感性，因此流感患者极易发生细菌和真菌共感染和继发感染。流感继发细菌感染的患者往往表现出比原发性细菌性感染更严重的症状，可出现失控的细胞因子风暴，病死率高。

流感后继发细菌感染是指病毒转阴后，机体由于病毒感染导致对细菌易感，从而发生的细菌感染。流感继发细菌性肺炎的主要感染细菌为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌，酿脓链球菌和流感嗜血杆菌等。流行病学方面，无论是流感大流行还是季节性流感，流感继发细菌感染均是死亡的重要高危因。

目前，尚未有研究表明八宝丹的抗炎效应是否对流感继发细菌性感染具有治疗效果。

发明内容

本发明人首先采用感染性小鼠急性肺损伤模型以及巨噬细胞活化模型，研究八宝丹抗流感继发细菌感染的药效。

如实验所证实的，本发明采用流感病毒和金黄色葡萄球菌序贯感染小鼠急性肺损伤模型，发现八宝丹可显著改善感染小鼠肺部炎症反应，抑制IL-6、TNF-α、KC、MIP2等炎症因子的表达和释放；采用巨噬细胞Toll样受体(TLRs)活化模型，发现八宝丹可显著抑制免疫细胞过度活化所致炎症因子分泌。由此，证实了八宝丹具有抗流感继发细菌感染的作用。

因此，本发明提供八宝丹在制备用于预防或治疗流感继发细菌性感染的药物中的用途。

所述流感继发细菌性感染可以为流感继发细菌性肺炎，特别是金黄色葡萄球菌导致的感染性急性肺损伤。

本发明的药物可以为本领域常规的各种剂型，例如固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液、混悬液、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂和散剂等。所述药物的给药途径可以为注射给药或口服给药。所述注射给药可以包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。

基于质量百分比，所述药物可以包括0.01～99.99％八宝丹或其提取物，以及99.99～0.01％的辅助成分。

所述药物可以包括一种或多种药学上可接受的常规辅料。所述药学上可接受的常规辅料可以为赋形剂、填充剂或稀释剂等。

附图说明

图1显示生存曲线。

图2显示肺组织病理切片。

图3显示肺细菌载量(CFU计数)(P>0.05)。

图4显示BALF中细胞总数。

图5显示BALF细胞分类计数。

图6显示BALF中KC、MIP2、IL-1β和IL-10的浓度。

图7显示BALF中TNF-α和IL-6的动态变化。

图8显示肺匀浆中炎性因子mRNA表达。

图9显示八宝丹对Raw 264.7细胞的毒性。

图10显示八宝丹对LPS刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用。和模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图11显示八宝丹对Pam3CSK4刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用。和模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图12显示八宝丹对Poly(I:C)刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用。

图13显示八宝丹对Poly(I:C)+Pam3CSK4刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用。和模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

实验药品及配制方法

八宝丹胶囊性状：胶囊内容物为黄褐色或灰棕褐色的内容物，给药组1批号：150332020，给药组2批号：140103067，提供单位：厦门中药厂有限公司，贮存方法：阴凉、干燥、室温保存。

灌胃用药物配制方法：称取胶囊内容物，加适量MiliQ水溶解至所需浓度(40mg/mL)，冰浴超声30分钟后4℃保存，2小时内使用。

细胞实验用药物配制方法：称取八宝丹胶囊内容物，加入适量DMEM细胞培养液超声30分钟，用0.22μM滤膜过滤后，加入10％的灭活FBS和100X青链霉素，加入DMEM补体积，得到2mg/mL八宝丹溶液。4℃保存，24小时内使用。

主要试剂

小鼠KC、MIP2 ELISA检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)；小鼠IL-1β、IL-10、IL-6、TNF-αELISA检测试剂盒(eBioscience)；超纯RNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，RNase-Free DNase Set(QIAGEN)，HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，UltraSYBR Mixture(北京康为世纪生物科技有限公司)，引物序列见下表1，引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

主要仪器

M1000 PRO多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)，Mastercycler gradientPCR仪(Eppendorf公司)，CFX96^TMTouch实时定量PCR系统(BIO-RAD公司)，化学发光成像仪(BIO-RAD公司)。

[表1]

数据处理及统计学分析

使用GraphPad v6.01软件进行数据处理及分析。数据以Mean±SEM表示，生存率采用Log-rank(Mantel-Cox)检验进行分析，其他均采用方差分析(ANOVA)并进行两两比较，P<0.05为有统计学差异。

实施例1：八宝丹对流感病毒PR8继发SA感染所致急性肺损伤的保护作用

实验动物

SPF级C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，体重16～21g。浙江大学动物实验中心提供，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物质量合格证：SCXK(沪)2007-0005。实验动物于浙江大学动物中心清洁级饲养，室温20～22℃，光照为12h照明，12h黑暗，给予充足的标准饲料和饮用水。实验操作规程严格遵循浙江大学《实验动物管理条例》。

实验细菌及病毒

H1N1流感病毒毒株PR8(Puerto-Rico/8)以及金黄色葡萄球菌(SA)由本实验室保存。常规培养、扩增、滴定，保存于-80℃。

造模及给药

将小鼠随机分为PR8+SA模型组、八宝丹给药组1(BBD TR)、八宝丹给药组2(BBDRG)以及空白对照组(生存率实验n＝8～16只/组，其余每项检测分别n＝3～5只/组)。

以异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，以PR8感染PR8+SA模型组、BBD TR组、BBD RG组小鼠，感染方式为滴鼻感染(1×10⁴PFU/mL，20μL)。感染完成后，观察其恢复情况。感染病毒当天为第0天。感染病毒后第5天进行SA感染。BBD TR组、BBD RG组于SA感染前2小时按剂量1.0g生药/kg灌胃给药(约0.4～0.5mL药液)。对照组(Control)和模型组(Model)按照体重给予相应体积的溶剂(MiliQ水)。以异戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉后，模型组、BBD TR组、BBD RG组小鼠经喉镜引导气管滴注金黄色葡萄球菌悬液50μL进行感染。生存率和肺病理检查实验菌量为5×10⁷CFU，其他为2.5×10⁷CFU。

1.1、一般及存活情况观察

SA感染后2h内苏醒的小鼠被纳入一般及存活情况观察。一般情况观察指标包括：活动度、精神状态、呼吸情况、对外界刺激反应等。存活情况观察频率为：在感染24h内，每隔2或4h记录1次，此后每隔6或12h观察并记录至72h。

结果：

一般情况观察：模型组小鼠出现严重精神萎靡不振、呼吸急促、对外界刺激反应淡漠等症状，大部分小鼠在感染24h后死亡。与模型组相比，BBD TR及BBD RG组小鼠的一般情况有所改善。

生存率统计结果：与模型组相比，BBD TR及BBD RG组小鼠48和72小时存活率有提高趋势(P>0.05)(图1)。

1.2、肺病理检查

SA感染12h后，颈椎脱臼处死小鼠。打开胸腔，取全肺，观察肺实变和充血情况后立即用多聚甲醛固定，进行常规石蜡包埋、切片及HE染色(赛维尔(谷歌)生物科技有限公司)。显微镜下观察切片，记录肺泡结构完整性、炎症细胞浸润等肺部病理改变情况。

结果：

大体观察结果显示：模型组小鼠肺表面有血红色病变区、肺叶肿胀且体积增大；与模型组相比，八宝丹能改善肺损伤，肺表面血红色病变区减少、肿胀和充血程度减轻。

HE染色显微镜观察结果显示(图2)：模型组肺泡腔部分消失，肺泡壁增厚，伴有大量中性粒细胞浸润；BBD TR组肺组织炎症细胞浸润缓解、部分肺泡结构恢复。

1.3、肺组织匀浆与细菌载量检测

SA感染12h、24h后，颈椎脱臼处死小鼠。打开胸腔，取全肺置于含1.0mL PBS的匀浆管中，匀浆(Tissuelyser-48全自动样品快速研磨仪)，匀浆液体积记为1.0mL。取100μL置于含0.9mL裂解液TRIzol(北京康为世纪生物科技有限公司)的EP管中用于RNA提取。剩余匀浆组织1000rpm离心5min，弃沉淀大块组织。取少量进行细菌载量检测，其余-80℃冻存。

细菌载量检测采用肺组织匀浆集落形成单位(CFU)检测方法：取20μL肺组织匀浆于96孔板，吸取10μL进行10倍梯度稀释(一般稀释8个梯度)，每个稀释浓度按从高到低的次序取5μL滴到细菌培养板上，在细菌孵化箱中过夜培养，第二天计算菌落数。

结果：

SA感染后12、24h，BBD TR给药组和模型组之间的肺组织细菌载量均没有明显差异(图3)。

1.4、肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及分类计数

SA感染12h、24h后，戊巴比妥钠(1.5％)腹腔注射麻醉小鼠，打开小鼠胸腔，暴露气管及肺。在会厌软骨处做一T形切口，插入套管固定，使用1mL注射器对小鼠全肺进行支气管肺泡灌洗术，每次抽取0.8mL PBS，反复抽注2次，回收率在80％以上，约1.6mL。得到的肺泡灌洗液立即置于冰上，4℃1000rpm离心5分钟，转移上清至干净的EP管中，分装后立即于-80℃保存，用于炎性因子检测。离心所得的细胞用于细胞计数及染色分类计数。

细胞计数及分类：用氯化铵溶液重悬离心所得的细胞，裂解红细胞，3min后4℃1000rpm离心5分钟，弃上清，用PBS重悬，适当稀释后取10μL用细胞计数仪计数。BALF中细胞总数＝计数仪读数*稀释倍数*体积。另取30～60μL细胞悬液制备细胞涂片，吉姆萨(南京建成生物工程研究所)染色后行中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞分类计数，并计算百分比。

结果：

SA感染后，模型组BALF中出现大量炎性细胞(图4)。感染12h时，主要为中性粒细胞；感染24h时，淋巴细胞及单核细胞比例有所上升(图5)。与模型组相比，感染后12h、24h，BBD TR组细胞总数没有明显差异(图4)；感染后24h，淋巴细胞比例下降(图5)。

1.5、BALF中炎症因子的表达

取1.4中所得肺泡灌洗液(BALF)按照ELISA试剂盒操作说明书检测各样本中的TNF-α、IL-6、KC和MIP2等细胞因子。

结果：

与正常对照组相比，PR8+SA模型组12h和24h BALF中TNF-α、IL-6、KC、MIP2、IL-10及IL-1β浓度显著增加(P<0.05)，八宝丹干预组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP2均呈下调趋势，其中IL-6显著下调(P<0.05)(图6和7)。

动态变化检测结果显示SA感染后2h细胞因子即出现升高，其中TNF-α和IL-6分别在SA感染后6h和12h的水平达到顶峰。八宝丹显著地抑制6h和12h IL-6的表达(P<0.05)，并对12h TNF-α表达有抑制效果(P>0.05)(图7)。

1.6、肺组织中炎症因子mRNA的表达

如1.3中所述获得肺组织匀浆，进行RNA提取后，以RT-qPCR检测细胞因子mRNA的表达水平。具体而言，按照超纯RNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)操作说明提取RNA，经DNase处理后，用NanoDrop 2000测定RNA浓度，取2μg RNA按照HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)的操作步骤逆转录得cDNA。RNA于-80℃保存，cDNA于4℃短期保存。使用UltraSYBR Mixture(北京康为世纪生物科技有限公司)试剂盒进行荧光定量PCR。引物序列见上表1。荧光定量PCR基线采用Bio-Rad公司CFX managerV3.0软件的自动设定，以β-actin为内参基因并用2^-△△CT法计算基因相对表达量。

结果：

与空白对照组相比，PR8+SA模型组12h和24h肺组织匀浆中TNF-α、IL-6、IL-10、KC、MIP2及IL-1β的表达均显著增加(P<0.05)，BBD TR组炎症因子IL-6、KC、MIP2呈下调趋势(P>0.05)(图8)。

实施例2：基于巨噬细胞TLRs活化模型的八宝丹抗炎药效评价研究

细胞培养

小鼠单核巨噬细胞系Raw 264.7(ATCC TIB-71)，培养液为含有10％灭活FBS及青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基，培养条件为37℃、5％CO₂。取对数生长期的细胞用于实验。

2.1八宝丹对Raw 264.7细胞的毒性

MTT法测定细胞活率

按照细胞实验用药物配制方法配制八宝丹20mg/mL DMEM溶液，并稀释得到20、10、4、2、1、0.4、0.2、0.1mg/mL的八宝丹溶液。

将Raw 264.7细胞以5～10×10³/孔铺于96孔板中，24h后，细胞融合度为70％，加入上述八宝丹溶液继续培养24h，加入MTT，4h后弃去上清，加入DMSO溶解细胞内MTT，检测吸光度(检测波长580nm)，计算细胞活率。

结果：

如图9所示，当八宝丹浓度大于1mg/mL时对Raw 264.7细胞毒性显著增加(活率<80％)。选择1mg/mL为起始浓度，按不同比例稀释后，进行后续实验。

2.2八宝丹对TLRs活化引起的细胞因子的表达的作用

TLRs激动剂及工作浓度清单见下表2。

实验方案如下：Raw 264.7细胞以1×10⁵/孔种于12孔板中。24h后换含八宝丹的培养液。22h后再次换含药培养液，2h后加入TLRs激动剂，24h后收取细胞上清液。以ELISA检测TNF-α和IL-6。

[表2]TLRs激动剂及工作浓度

2.2.1八宝丹对LPS刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用

如图10所示，LPS(100ng/mL)刺激24h可以显著地引起Raw 264.7细胞分泌TNF-α和IL-6；八宝丹对LPS引起TNF-α和IL-6的分泌具有显著的抑制作用，并呈现量效关系，对IL-6释放的抑制作用尤为明显。

2.2.2八宝丹对Pam3CSK4刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用

如图11所示，Pam3CSK4(1μg/mL)刺激24h可以显著地引起Raw 264.7细胞分泌TNF-α和IL-6；八宝丹对Pam3CSK4刺激引起IL-6分泌具有显著的抑制作用，对TNF-α分泌的抑制作用不明显。

2.2.3八宝丹对Poly(I:C)刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用

如图12所示，八宝丹对Poly(I:C)(10μg/mL)刺激24h对Raw 264.7细胞释放TNF-α和IL-6的作用较弱。

2.2.4八宝丹对Poly(I:C)+Pam3CSK4刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的作用

如图13所示，Poly(I:C)+Pam3CSK4刺激24h可以显著地引起Raw 264.7细胞分泌TNF-α和IL-6，其程度远远高于Poly(I:C)或Pam3CSK4单一刺激。八宝丹对Poly(I:C)+Pam3CSK4引起的TNF-α和IL-6分泌具有抑制作用，对IL-6释放的抑制作用尤为明显，并呈现一定的量效关系。

上述结果表明八宝丹对不同TLRs受体被激活后引起细胞因子(尤其是IL-6)的释放具有显著的抑制作用，从而起到抗炎效应。其中Poly(I:C)+Pam3CSK4刺激模拟了流感继发细菌性感染过程中的过度炎症反应，八宝丹具有显著抗炎效应。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门中药厂有限公司

<120> 八宝丹在制备用于预防或治疗流感继发细菌性感染的药物中的用途

<130> DI19-1387-XC37

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向序列

<400> 1

gtatcctgac cctgaagtac c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向序列

<400> 2

tgaaggtctc aaacatgatc t 21

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向序列

<400> 3

aataacgctg atttga 16

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向序列

<400> 4

acccgtaggg cgattaca 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向序列

<400> 5

acatactgct aaccgactc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向序列

<400> 6

aatgctcctt gatttctgg 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向序列

<400> 7

ttccagaaac cgctatga 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向序列

<400> 8

ggttgtcacc agcatcag 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向序列

<400> 9

cctccttgcc tctgatgg 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向序列

<400> 10

agtgctgcct aatgtccc 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向序列

<400> 11

acccaaaccg aagtcata 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向序列

<400> 12

aggtgccatc agagcagt 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向序列

<400> 13

cccagacaga agtcatagc 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向序列

<400> 14

tcctttccag gtcagtta 18

Claims

1.八宝丹在制备用于预防或治疗流感继发细菌性感染的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述流感继发细菌性感染为流感继发细菌性肺炎。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述流感继发细菌性肺炎为金黄色葡萄球菌导致的感染性急性肺损伤。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物为固体、半固体或液体的形式。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述药物的制剂为水溶液、非水溶液、混悬液、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或散剂。

6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物的给药途径为注射给药或口服给药。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述注射给药包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射。

8.根据权利要求1所述的用途，其中，基于质量百分比，所述药物包括0.01～99.99％八宝丹或其提取物，以及99.99～0.01％的辅助成分。

9.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物包括一种或多种药学上可接受的常规辅料。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述药学上可接受的常规辅料为赋形剂、填充剂或稀释剂。