CN110412287A - 一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法 - Google Patents

一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平；(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。本发明高通量分析检测提供高灵敏度检测稀有类型的免疫细胞群体，以及弱表达的抗原，提高免疫分型分析精确性，有临床应用前景。

Description

一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及免疫细胞的分析方法，尤其涉及一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法。
背景技术
人体的免疫系统由数量庞大以及类型非常丰富的免疫细胞组成。免疫细胞主要有两大类，淋巴细胞以及骨髓细胞。其中骨髓细胞有粒细胞，单核细胞等，按照细胞形态以及功能的差别又可以分为嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，单核细胞在不同种类的细胞分化因子的刺激性又会分化成各种类型的巨噬细胞或树突状细胞。淋巴细胞是白细胞的一种，是参与机体免疫应答功能最重要的细胞组成成分。按照淋巴细胞分化来源、细胞表面携带的表面抗原以及参与功能的不同，可以分为T淋巴细胞，B淋巴细胞、自然杀伤细胞等类别。其中T细胞又可分为细胞毒性T细胞，辅助性T细胞，调节性T细胞，记忆T细胞等；B细胞又可分为初始B细胞，浆细胞，记忆B细胞等亚细胞类群。
目前在免疫学领域目前已经发现了上百种细胞表面标志物，不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中，出现或者消失的特定抗原，称为分化抗原(CD分子)。这些CD分子主要是免疫细胞表面的黏附分子、细胞因子受体或趋化因子受体等，可以被特定的抗体所识别。这些分子在不同类型的免疫细胞上具有高度的差异性，通过对这些细胞表面标志物的分析可以将免疫细胞分为更为细致的亚细胞分类群，例如辅助性T细胞又可进一步分成原始辅助性T细胞，1型辅助T细胞，2型辅助T细胞，9型辅助T细胞，17型辅助T细胞，22型辅助T细胞，辅助性耗竭T细胞，辅助效应记忆T细胞，辅助中心记忆T细胞等。
免疫细胞分型和多种疾病有着密切的关系。对免疫细胞亚群的绝对定量或多种类群细胞的相对定量，对于如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、I型糖尿病、炎症、病毒感染等多种疾病病理进程的判断、分析发病机制、分析疾病中免疫系统变化程度具有非常重大的意义。例如CD4+T淋巴细胞的绝对计数临床上可用于HIV感染者的疾病分期，以及并发症判断；单核细胞表面HLA-DR的表达与手术和创伤后患者的预后成正相关；CD4+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞比值异常升高常见于类风湿性关节炎、I型糖尿病，以及器官移植后CD4+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞比例明显升高预示免疫排斥发生的可能性较高；CD4+/CD25+/Foxp3+T细胞是免疫耐受的重要参与者，其数量异常可能导致自身免疫疾病的发生，也会用作骨髓移植术前术后的跟踪。
当前用于免疫细胞分型的方法主要有：免疫酶标法，流式细胞术法等。其中免疫酶标法是基于抗原抗体反应，对一个群体的免疫细胞所携带的一个或几个标志物进行检测，但这种方法无法在单细胞水平进行检测，需要的样本细胞数量大，无法同时检测多种细胞标志物，而且存在检测范围窄、操作复杂等缺点，在临床应用中只能检测某几个特定细胞类型。流式细胞术通过多种抗体组合方式，可以在单细胞水平对免疫细胞做足够细致的亚细胞类群分型，其操作相对简单，在临床中得到广泛的应用。但是流式细胞术中，当多通道荧光标记同时使用时，由于荧光发射光谱之间存在重叠，会出现假阳性信号而干扰检测结果。目前普遍的做法是通过荧光补偿的方法修正信号的采集，尽管采用了荧光补偿进行修正，但临床中应用流式细胞术通常采用最多4色组合方案，以保证分析的可靠性，无法在同一个细胞样品中同时对更多的标志分子进行检测。此外，流式细胞仪对单细胞的荧光进行检测理论上可以低至100个荧光分子，但当抗原分子表达量非常低时，检测结果可能会出现很大偏差。因此临床上对免疫细胞分型的检测需要一种新型的检测手段，可以在单细胞水平对足够多的抗原分子同时进行检测，这对细胞量极少的珍贵样本尤为重要；而且要求检测要有足够的灵敏度，以分析弱表达抗原以及稀有细胞群体。
质谱流式是一种新型的流式分析系统，其利用质谱原理来实现单细胞多参数检测的流式技术。其检测原理为通过金属元素标记的抗体对细胞进行染色，通过质谱检测器分析金属元素的含量从而对单个细胞多种蛋白水平进行分析，具有通道多，分析速度快，灵敏度高的特点。因此，基于质谱流式技术在单细胞水平对免疫细胞分型进行定量分析具有十分显著的优势，拟进一步研究开发。
本发明的目的在于提供一种新的基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，解决现有的分析方法中的不足之处，一方面针对免疫细胞高度差异性的特点，在单细胞水平对所有类型的免疫细胞中足够多的抗原标志同时进行高通量分析检测，尽可能用更少的细胞样本获得更多的有效信息；另一方面提供足够高的灵敏度，从而可以稳定可靠地检测稀有类型的免疫细胞群体，以及弱表达的抗原，从而提高免疫分型分析的精确性，为临床中疾病的诊断，疗效的检测等提供更加准确的分析结果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计针对免疫细胞高度差异性的特点，在单细胞水平对所有类型的免疫细胞中足够多的抗原标志同时进行高通量分析检测，
本发明提供一种新的基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法。
本发明方法的检测原理为通过金属元素标记的抗体对细胞进行染色，通过质谱检测器分析金属元素的含量从而对单个细胞多种蛋白水平进行分析，具有通道多，分析速度快，灵敏度高的特点。质谱流式技术可以在单细胞水平对所有的免疫细胞多种抗原分子进行同时标记，其灵敏度远高于流式细胞术，而且基于质谱方式对金属元素标签进行的分析可以提供足够大的分辨度，避免了流式细胞术中荧光标签之间的相互影响的情况。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于单细胞的高通量免疫细胞分型定量分析方法，包括以下步骤：
(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；
(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；
(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；
(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平。
(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图等，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。
本发明方法所述步骤(1)将血液样本离心、过滤后用1mL磷酸盐缓冲液重悬制成单细胞悬液，或者活检组织样本用解剖剪刀解离成细碎小块，加入0.025％胰蛋白酶细胞消化液，37℃消化10分钟，经70微米滤膜过滤，制备成单细胞悬液；单细胞悬液加入1/10体积的16％甲醛溶液，室温(25℃)固定10分钟；弃去上清，加入1mL染色缓冲液(含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液)清洗细胞，离心弃去上清，重复2次，并用0.5mL染色缓冲液重悬细胞；
进一步地，将细胞重悬液中加入步骤(2)中所述含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液配制的、带有金属元素标签标记的、用于免疫细胞分型的抗体的染色缓冲液配制的金属标记的抗体混合物，室温混合孵育30分钟；
本发明方法步骤(2)中所述抗体包括4部分：a)免疫细胞基础分型组合b)骨髓细胞分型组合c)T淋巴细胞分型组合d)B淋巴细胞分型组合，使用中根据检测的目的选择a)免疫细胞基础分型组合或加上b)、c)、d)中一种或多种组合进行联合标记，即可选择其中任意1种或多种组合进行联合标记。
每个组合所包含的抗体和其对应的克隆编号，以及标记时优选的金属标签组合如下：
a)免疫细胞基础分型组合，包括识别下列靶点的抗体：
识别靶点 克隆号 金属标签
CD45 HI30 142Nd
CD11b ICRF44 144Nd
CD16 3G8 145Nd
CD20 2H7 147Sm
CD56 HCD56 151Eu
CD3 UCHT1 154Sm
CD11c Bu15 159Tb
CD19 HIB19 165Ho
CD27 O323 167Er
CD8a SK1 168Er
CD4 RPA-T4 173Yb
CD14 M5E2 175Lu
(表格中“CD45”等是列举所有识别的标志蛋白靶点，而下文中“+/-/lo”表示标志蛋白的表达程度：“+”表示标志蛋白表达阳性，“++”表示标志蛋白高程度阳性表达，“-”表示表达阴性，“lo”表示表达水平低，如CD45+表示该细胞群体CD45表达阳性，CD3-表示CD3表达阴性，这种表述形式为本领域通用表述，且符合卫生部《WS/T 360-2011流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》中的表述。)
其中，造血干细胞为具有CD34+、CD117+特征的细胞(本表述意思为同时具有CD34阳性和CD117阳性的细胞认为是造血干细胞，以下同)；
所有类型白细胞为具有CD45+特征的细胞；
粒细胞为具有CD45+，CD11b+特征的细胞；
单核细胞为具有CD45+，CD14+，CD16+，CD3-，CD19-，CD20-特征的细胞；
T淋巴细胞为具有CD45+，CD3+，CD4+/CD8+特征的细胞；
B淋巴细胞为具有CD45+，CD19+，CD20+特征的细胞；
NK细胞为具有CD45+，CD16+，CD56+特征的细胞；
b)骨髓细胞(Myeloid cells)分型组合，包括识别下列靶点的抗体：
识别靶点 克隆号 金属标签
CD11c Bu15 159Tb
CD123 6H6 143Sm
CD68 298807 148Nd
CD66 CD66a-B1.1 152Sm
CD13 WM15 153Eu
CD11a HI111 146Nd
CD11b ICRF44 144Nd
CD14 M5E2 175Lu
CD15 W6D3 158Gd
CD16 3G8 145Nd
CD33 WM53 160Gd
HLA-DR(人类白细胞DR抗原) L243 176Yb
Siglec8(唾液酸结合Ig样凝集素8) 837535 169Tm
其中，所有类型粒细胞为具有CD45+，CD11b+，CD66+特征的细胞(本表述意思为同时具有CD45阳性和CD11b阳性和CD66阳性的细胞认为是粒细胞，以下同)；
嗜碱性粒细胞为具有CD45+，CD3-，HLA-DR-，CD38++，CD123++特征的细胞；
中性粒细胞为具有CD45+，CD15+，CD16+特征的细胞；
嗜酸性粒细胞为具有CD45+，CD15-，CD16-，Siglec8+特征的细胞；
经典单核细胞为具有CD45+，CD14+，CD11a+，CD11b+，CD16lo/-，HLA-DR+特征的细胞；
巨噬细胞为具有CD45+，CD33+，CD16+，CD68+特征的细胞；
树突状细胞为具有CD11c+，CD123+，CD16+特征的细胞。
c)T淋巴细胞(T lymphocytes)分型组合，包括识别下列靶点的抗体
识别靶点 克隆号 金属标签
CD127 A019D5 139La
CD45RA HI100 155Gd
CD45RO UCHL1 164Dy
FOXP3 PCH101 162Dy
CD183/CXCR3 G025H7 163Dy
CD185/CXCR5 MU5UBEE 172Yb
CD194/CCR4 L291H4 149Sm
CD196/CCR6 G034E3 141Pr
CD197/CCR7 G043H7 161Dy
TCRgd B1 171Yb
CD25/IL-2RA BC96 089Y
CD3 UCHT1 154Sm
CD34 581 166Er
CD11b ICRF44 144Nd
其中，细胞毒性T淋巴细胞为具有CD45+，CD3+，CD8a+特征的细胞；
原始细胞毒性T细胞为具有CCR7+，CD127+，CD45RO-，CD45RA+特征的细胞；
终末分化效应细胞毒性T细胞为具有CCR7-，CD45RO-，CD45RA+特征的细胞；
中心记忆T细胞为具有CCR7++，CD127+，CD45RO+，CD45RA-特征的细胞；
效应记忆T细胞为具有CCR7-，CD127+，CD45RO-，CD45RA-特征的细胞；
原始辅助性T细胞为具有CD4+，CCR7+，CD127+，CD45RO-，CD45RA+特征的细胞；
1型辅助T细胞为具有CD4+，CXCR3+，CXCR5-，CCR4-，CCR5+，CCR6-特征的细胞；
2型辅助T细胞为具有CD4+，CXCR3-，CXCR5-，CCR4+，CCR5-，CCR6-特征的细胞；
d)B淋巴细胞(B lymphocytes)分型组合，包括识别下列靶点的抗体
识别靶点 克隆号 金属标签
IgD IA6-2 156Gd
CD24 ML5 150Gd
CD27 O323 167Er
CD19 HIB19 165Ho
CD20 2H7 147Sm
CD36 5-271 170Er
CD38 HIT2 174Yb
其中，原始B细胞为具有CD27-，IgD+特征的细胞；
记忆B细胞为具有CD27+，IgD-特征的细胞；
记忆静息B细胞为具有CD27+，IgD+特征的细胞；
浆细胞为具有CD27++，CD20-，CD36-，CD38+特征的细胞；
迁移B细胞为具有CD24+，CD38+特征的细胞。
将标记好的细胞样品通过质谱流式系统进行检测；
质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息；
将多维的蛋白丰度信息进行降维算法数据处理，绘制一系列二维散点图；
所述步骤(5)进一步数据进行SPADE分析(密度归一化项目的最小生成树进展分析)(方法来自文献QiuP,NatBiotechnol.2011,doi:10.1038/nbt.1991)，其分析步骤为：
(1)密度相关的下采样，先求出每个细胞邻近范围内的细胞数，作为其密度。将密度小的细胞保留，密度大的细胞随机采样，保证细胞越稀疏则留下的概率越大。这样在保留了细胞绝大部分类型的同时，减少了细胞数，降低了后续计算量；
(2)凝聚层次聚类，将留下的细胞采用层次聚类的方式，聚成指定数量的类。该步骤将性质相近的细胞聚为一类，方便后续分析；
(3)建立最小生成树，计算出聚出的每个类的中心并计算出每个类中心的距离作为相邻类间边的权重，构造出一幅加权无向图。采用Prim算法(文献：Prim,R.C.(November1957),"Shortest connection networks And some generalizations",Bell SystemTechnical Journal,36(6):1389–1401)建立该图的最小生成树。该步骤将细胞的类群构造成为一个树形结构，可以较好地揭示细胞类群之间的联系；
(4)上采样，计算每一个细胞分别与各个类群中心的距离，并将该细胞归入与其距离最近的那个类群。这样就将所有细胞都归入了相应的类群；
(5)可视化，采用Kamada-Kawai算法(文献：Kamada,Tomihisa；Kawai,Satoru(1989),"An algorithm for drawing general undirected graphs",InformationProcessing Letters,Elsevier,31(1):7–15)，根据得到的最小生成树计算出最小生成树中每个结点的二维坐标。根据每个结点上的细胞数量决定该结点的尺寸大小。对于某个特定的特征，计算出每个结点上该特征的中值。根据数值的高低决定该结点的颜色。这样，对不同的特征，就能生成结点坐标和尺寸一致的对应颜色的图像。建立生物信息学分析模型，通过机器学习算法对免疫细胞分型亚群组成进行分析，对各个免疫细胞亚群进行绝对定量以及跨类群之间进行相对定量分析。
根据每个细胞亚群中细胞表面抗原的表达水平，定义每个亚群的细胞类别，例如CD45、CD3、CD8阳性细胞群体为细胞毒性T淋巴细胞。对每个细胞亚群的细胞数量进行绝对定量分析，以及不同亚群细胞之间进行相对定量分析。
本发明提供一种新的基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，解决了现有的分析方法中的不足之处，由于体内免疫细胞群体具有高度异质性，某些稀有细胞群体在其中占比极少，如何在成百上千中免疫细胞表面的抗原分子中选择合适的组合对免疫细胞进行精确而可靠的分群；以及在不同类型的免疫相关疾病患者的组织样本中，免疫细胞各抗原标志物的表达存在较大差异，如何确定其检测信号阈值对于准确进行免疫细胞分型非常重要。本发明方法一方面针对免疫细胞高度差异性的特点，在单细胞水平对所有类型的免疫细胞中足够多的抗原标志同时进行高通量分析检测，尽可能用更少的细胞样本获得更多的有效信息；另一方面提供高的灵敏度而可以稳定可靠地检测稀有类型的免疫细胞群体，以及弱表达的抗原，从而提高免疫分型分析的精确性，为免疫相关疾病的研究等提供更加准确的分析结果，有较好的应用前景和较大的社会效益。
附图说明
图1 NSCLC患者外周血样本中免疫细胞亚群T/B淋巴细胞分群(实施例1)
图2 NSCLC患者外周血样本中免疫细胞亚群CD45分子的表达(实施例1)
图3 NSCLC患者外周血样本中免疫细胞亚群CD3分子的表达(实施例1)
图4 NSCLC患者外周血样本中免疫细胞亚群CD8分子的表达(实施例1)
图5 NSCLC患者外周血样本中免疫细胞亚群CD4分子的表达(实施例1)
图6 SLE患者血液样本中免疫细胞亚群CD19分子的表达(实施例2)
图7 SLE患者血液样本中免疫细胞亚群CD20分子的表达(实施例2)
具体实施方式
实施例使用的样本、原料与试剂除另有说明外，均可以通过市售得到。
本实施例所采用的质谱流式系统为高效质谱流式仪HEMC，上海宸安生物科技有限公司。
下面结合具体样本的分析方式对本发明作进一步的详细描述：
实施例1：
利用本发明对某医院肿瘤科非小细胞肺癌(NSCLC)患者的免疫细胞群体进行定量分型，包括以下步骤：
(1)将NSCLC患者外周血样本(7.5mL)通过离心、过滤后用1mL磷酸盐缓冲液重悬制成单细胞悬液；
(2)在上述单细胞悬液中加入3mL红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀，冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次，450g 4℃离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液，1mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；
(3)细胞悬液加入100μL的16％甲醛溶液，室温(25℃)固定10分钟；
(4)清洗细胞并用染色缓冲液重悬细胞；
(5)细胞悬液中加入染色缓冲液配制的下列金属标记的免疫细胞基础分型组合抗体混合物(其中抗体储液浓度0.5mg/mL，抗体染色工作浓度1μg/mL)
(6)细胞悬液中加入50.0μLFc受体封闭液，室温(25℃)孵育10分钟，加入抗体标记混合液，混匀，室温(25℃)混合孵育30分钟；
(7)500g，4℃离心5分钟，弃去上清，加入2mL染色缓冲液洗涤细胞，重复3遍，1mL染色缓冲液重悬，准备检测；
(8)将标记好的细胞样品通过质谱流式系统进行检测，质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息；
(9)将数据进行SPADE分析：
a)密度相关的下采样。先求出每个细胞邻近范围内的细胞数，作为其密度。
将密度小的细胞保留，密度大的细胞随机采样，保证细胞越稀疏则留下的概率越大。这样在保留了细胞绝大部分类型的同时，减少了细胞数，降低了后续计算量；
b)凝聚层次聚类。将留下的细胞采用层次聚类的方式，聚成指定数量的类。
该步骤将性质相近的细胞聚为一类，方便后续分析；
c)建立最小生成树。计算出聚出的每个类的中心并计算出每个类中心的距离作为相邻类间边的权重，构造出一幅加权无向图。采用Prim算法建立该图的最小生成树。该步骤将细胞的类群构造成为一个树形结构，可以较好地揭示细胞类群之间的联系；
d)上采样。计算每一个细胞分别与各个类群中心的距离，并将该细胞归入与其距离最近的那个类群。这样就将所有细胞都归入了相应的类群。
e)可视化。采用Fruchterman-Reingold算法，根据得到的最小生成树计算出最小生成树中每个结点的二维坐标。根据每个结点上的细胞数量决定该结点的尺寸大小。对于某个特定的特征，计算出每个结点上该特征的中值。根据数值的高低决定该结点的颜色。这样，对不同的特征，就能生成结点坐标和尺寸一致的对应颜色的图像。
实施例结果如图1，图2，图3，图4，图5所示。
图1显示所有免疫细胞的二维散点图，横纵坐标分别显示每个细胞CD20/CD3或者CD4/CD8a蛋白表达量，将所有免疫细胞分成T淋巴细胞，B淋巴细胞，非T/B细胞；以及在T淋巴细胞中，区分出CD8a+细胞毒性T淋巴细胞以及CD4+辅助T淋巴细胞。
图2，图3，图4，图5中每个节点代表一类免疫细胞亚群，节点圆圈大小表示细胞数量多寡，节点圆圈灰度值表示CD45，CD3，CD4或CD8蛋白表达的归一化中值，从该结果中，分别鉴定出CD45+，CD3+，CD8a+T细胞群体和CD45+，CD3+，CD8+T细胞群体。
实施例2：
利用本发明对XX医院皮肤科系统性红斑狼疮(SLE)患者的免疫细胞群体进行定量分型，包括以下步骤：
分析样本为SLE患者的外周血7.5mL，样品处理方法与数据分析方法同实施例1，所选用抗体组合为：[1]免疫细胞基础分型组合+[2]B淋巴细胞分型组合。
实施例结果见图5，图6所示，每个节点代表一类免疫细胞亚群，节点圆圈大小表示细胞数量多寡，节点圆圈灰度值表示CD19或CD20蛋白表达的归一化中值，从该结果中鉴定出CD45+，CD19+，CD20+B细胞群体。

Claims (8)

1.一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；
(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；
(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；
(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平；
(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。
2.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)将血液样本离心、过滤后用1mL磷酸盐缓冲液重悬制成单细胞悬液，或者活检组织样本用解剖剪刀解离成细碎小块，加入0.025％胰蛋白酶细胞消化液，37℃消化10分钟，经70微米滤膜过滤，制备成单细胞悬液；单细胞细胞悬液中加入1/10体积的16％甲醛溶液，25℃固定10分钟；弃去上清，加入1mL染色缓冲液清洗细胞，离心弃去上清，重复2次，并用0.5mL染色缓冲液重悬细胞；所述染色缓冲液为含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)将单细胞悬液中加入所述染色缓冲液配制的金属标记的抗体混合物，室温25℃混合孵育30分钟。
4.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(2)所述抗体包括：a)免疫细胞基础分型组合、b)骨髓细胞分型组合、c)T淋巴细胞分型组合、d)B淋巴细胞分型组合，使用时选择其中任意1种或多种组合进行联合标记。
5.根据权利要求4所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(2)所述a)免疫细胞基础分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD45、CD11b、CD16、CD20、CD56、CD3、CD11c、CD19、CD27、CD8a、CD4、CD14；所述骨髓细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD11c、CD123、CD68、CD66、CD13、CD11a、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD33、HLA-DR、Siglec8；所述T淋巴细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD127、CD45RA、CD45RO、FOXP3、CD183/CXCR3、CD185/CXCR5、CD194/CCR4、CD196/CCR6、CD197/CCR7、TCRgd、CD25/IL-2RA、CD3、CD34或CD11b；所述B淋巴细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：IgD、CD24、CD27、CD19、CD20、CD36或CD38。
6.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述所述步骤(2)用于作为抗体标签的金属元素及其不同原子质量的稳定同位素选自：钇Y、钌Ru、铑Rh、钯Pd、镉Cd、铟In、镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铂Pt或铋Bi。
7.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(5)所述质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息；将多维的蛋白丰度信息进行降维算法数据处理，绘制一系列二维散点图；数据进一步进行SPADE分析。
8.根据权利要求1或4所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(5)SPADE分析步骤为：
(1)密度相关的下采样，先求出每个细胞邻近范围内的细胞数，作为其密度。将密度小的细胞保留，密度大的细胞随机采样，保证细胞越稀疏则留下的概率越大，这样在保留了细胞绝大部分类型的同时，减少了细胞数，降低了后续计算量；
(2)凝聚层次聚类，将留下的细胞采用层次聚类的方式，聚成指定数量的类，该步骤将性质相近的细胞聚为一类，方便后续分析；
(3)建立最小生成树，计算出聚出的每个类的中心并计算出每个类中心的距离作为相邻类间边的权重，构造出一幅加权无向图。采用Prim算法建立该图的最小生成树；该步骤将细胞的类群构造成为一个树形结构，可以较好地揭示细胞类群之间的联系；
(4)上采样，计算每一个细胞分别与各个类群中心的距离，并将该细胞归入与其距离最近的那个类群，这样就将所有细胞都归入了相应的类群；
(5)可视化，采用Kamada-Kawai算法，根据得到的最小生成树计算出最小生成树中每个结点的二维坐标，根据每个结点上的细胞数量决定该结点的尺寸大小，对于某个特定的特征，计算出每个结点上该特征的中值，根据数值的高低决定该结点的颜色，这样，对不同的特征，就能生成结点坐标和尺寸一致的对应颜色的图像，建立生物信息学分析模型，通过机器学习算法对免疫细胞分型亚群组成进行分析，对各个免疫细胞亚群进行绝对定量以及跨类群之间进行相对定量分析；
根据每个细胞亚群中细胞表面抗原的表达水平，定义每个亚群的细胞类别，对每个细胞亚群的细胞数量进行绝对定量分析，以及不同亚群细胞之间进行相对定量分析。
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