CN110408602A

CN110408602A - Pcv2-prrsv重组病毒及其制备方法、基因、应用和疫苗

Info

Publication number: CN110408602A
Application number: CN201910710760.4A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 张伟; 李延涛; 李俊辉; 程兰玲; 高窦; 潘晓梅; 孙黎
Original assignee: Tiankang Biological Ltd By Share Ltd; Tiankang Biology (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Tiankang Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: CN110408602B

Abstract

本发明提供了一种PCV2‑PRRSV重组病毒及其制备方法、基因、应用和疫苗，涉及病毒技术领域。该重组病毒以PCV2病毒为载体，表达PRRSV抗原，利用PCV2基因组小，能够进行滚环复制的特点，具有操作简单、易控制等优点；PRRSV抗原选自从PRRSV中具有较好的免疫原性的多肽，将PRRSV抗原插入PCV2病毒得到的重组病毒具有PRRSV和PCV2的双重抗原特性，能够使机体同时对PRRSV和PCV2产生免疫反应。基于该发明构思还提供了主要由编码PCV2的基因序列和编码PRRSV抗原的基因序列组成的基因，包含他们的生物材料，以及疫苗，其中本发明提供的疫苗具有PRRSV和PCV2双免疫原性，能达到实现一针防两病的目的。

Description

PCV2-PRRSV重组病毒及其制备方法、基因、应用和疫苗

技术领域

本发明涉及病毒技术领域，尤其是涉及一种PCV2-PRRSV重组病毒及其制备方法、基因、应用和疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，为单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)，动脉炎病毒属(Arterivi-rus)成员。1991年荷兰中央兽医研究中心，率先从人工和自然感染病猪分离到病毒，命名Lelystad病毒(LV)美国分离株称为VR-2332。PRRSV病毒粒子呈卵圆形，直径50-65nm，核衣壳直径30-50nm，衣壳上有Snm短突起。该病毒有囊膜、二十面体对称，基因组长15 432b，包括8个开放阅架框架(ORFs)。ORF1是最大的一个阅读框，长约12kb，约占基因组的8000bp。ORF2-7是病毒基因组的结构基因，主要编码病毒的结构蛋白，包括病毒囊膜蛋白(GPs)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。

PRRSV株间存在抗原性差异和毒株变异性，依据病毒遗传基因特征和病原性的差异，可分为以LV株为代表的欧洲型的A群和以北美洲洲型ATCC-VR2332株为代表的B群，我国分离到的一些地方毒株均为美洲型毒株，但由于国内、国际猪只与肉品贸易的日益频繁，我国猪群也存在着受到欧洲型毒株感染的潜在危险。

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type two，PCV2)属于圆环病毒科、圆环病毒2型属，基因组为单股负链DNA，约由1767或1768个核苷酸组成。基因组编码结构蛋白Cap蛋白和非结构蛋白Rep蛋白，病毒衣壳蛋白呈二十面体对称，Cap蛋白是病毒衣壳蛋白的主要成分，其中Cap蛋白很大程度上决定了病毒的抗原性。

PRRSV和PCV2均能使猪患有较严重的疾病，PRRSV可以使母猪严重的繁殖障碍，断奶猪普遍发生肺炎、生长迟缓以及死亡率增加的症状；PCV2是一种仔猪免疫抑制，高度感染猪只的病毒性传染病，可引起各年龄段猪感染，对养殖业造成巨大经济损失。因此，一种能够同时对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型起免疫作用的疫苗是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种PCV2-PRRSV重组病毒，该重组病毒以PCV2为载体表达PRRSV抗原，同时具有PCV2和PRRSV的免疫原性。

本发明的第二目的在于提供一种主要由编码PCV2的基因和编码PRRSV抗原的基因组成的基因。

本发明的第三目的在于提供一种上述PCV2-PRRSV重组病毒，或上述基因相关的生物材料。

本发明的第四目的在于提供一种上述PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法。

本发明的第五目的在于提供一种上述PCV2-PRRSV重组病毒，编码上述PCV2-PRRSV重组病毒的基因，上述生物材料，或上述PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法的应用。

本发明的第六目的在于提供一种疫苗，该疫苗包含上述PCV2-PRRSV重组病毒，编码上述PCV2-PRRSV重组病毒的基因，上述PCV2-PRRSV重组病毒，或上述生物材料。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PCV2-PRRSV重组病毒，所述重组病毒以PCV2病毒为载体，表达PRRSV抗原；所述PRRSV抗原选自如下(a1)～(a9)中的至少一种：

(a1)如SEQ ID NO.1所示序列编码的抗原；(a2)如SEQ ID NO.2所示序列编码的抗原；(a3)如SEQ ID NO.3所示序列编码的抗原；(a4)如SEQ ID NO.4所示序列编码的抗原；(a5)如SEQ ID NO.5所示序列编码的抗原；(a6)如SEQ ID NO.6所示序列编码的抗原；(a7)如SEQ ID NO.7所示序列编码的抗原；(a8)如SEQ ID NO.8所示序列编码的抗原；(a9)如SEQID NO.9所示序列编码的抗原。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种基因，该基因主要由编码PCV2的基因和编码PRRSV抗原的基因组成；所述编码PRRSV抗原的基因选自如下(b1)～(b9)中的至少一种；

(b1)如SEQ ID NO.1所示序列；(b2)如SEQ ID NO.2所示序列；(b3)如SEQ ID NO.3所示序列；(b4)如SEQ ID NO.4所示序列；(b5)如SEQ ID NO.5所示序列；(b6)如SEQ IDNO.6所示序列；(b7)如SEQ ID NO.7所示序列；(b8)如SEQ ID NO.8所示序列；(b9)如SEQ IDNO.9所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，该生物材料选自如下(n1)～(n6)中的一种或多种：

(n1)含有所述基因的表达盒；

(n2)含有所述基因的载体，或含有(n1)所述表达盒的载体；

(n3)含有所述基因的重组微生物，含有(n1)所述表达盒的重组微生物，或含有(n2)所述载体的重组微生物；

(n4)含有所述基因的细胞系，含有(n1)所述表达盒的细胞系，或含有(n2)所述载体的细胞系；

(n5)含有所述PCV2-PRRSV重组病毒的重组微生物；

(n6)含有所述PCV2-PRRSV重组病毒的细胞系。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述PCV2-PRRSV重组病毒的基因。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述PCV2-PRRSV重组病毒，编码上述PCV2-PRRSV重组病毒的基因，上述生物材料，或上述PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法的应用，所述应用包括(x1)～(x3)中至少一种：

(x1)制备抗体或者抗原；

(x2)制备用于检测抗体或者抗原的试剂或试剂盒；

(x3)制备疫苗。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含上述PCV2-PRRSV重组病毒，编码上述PCV2-PRRSV重组病毒的基因，上述PCV2-PRRSV重组病毒，或上述生物材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的PCV2-PRRSV重组病毒，该重组病毒以PCV2病毒为载体，并且表达PRRSV抗原。该PCV2-PRRSV重组病毒以PCV2病毒为载体，利用PCV2基因组小，能够进行滚环复制的特点，具有操作简单、易控制等优点；PRRSV抗原选自从PRRSV中具有较好的免疫原性的多肽，将PRRSV抗原插入PCV2病毒得到的重组病毒具有PRRSV和PCV2的双重抗原特性，能够使机体同时对PRRSV和PCV2产生免疫反应。

基于上述发明构思，本发明还提供了主要由编码PCV2的基因序列和编码PRRSV抗原的基因序列组成的基因，包含他们的生物材料，以及疫苗，其中本发明提供的疫苗具有PRRSV和PCV2双免疫原性，能达到实现一针防两病的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的pBluescriptⅡPCV2-PRRSV质粒图谱；

图2-A为病毒PCV2的3D拓扑结构；

图2-B为PCV2-PRRSV重组病毒的的3D拓扑结构；

图3为本发明实施例2重组pBluescriptⅡPCV2-PRRSV酶切鉴定结果；

图4为本发明实施例4拯救病毒的PCR鉴定结果；

图5-A为阳性PCV2-PRRSV重组病毒的免疫荧光结果；

图5-B为阴性PCV2-PRRSV重组病毒的免疫荧光结果；

图6为PCV2-PRRSV重组病毒的电镜照片。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种PCV2-PRRSV重组病毒，该重组病毒以PCV2病毒为载体，并且表达PRRSV抗原。PCV2-PRRSV重组病毒以PCV2病毒为载体，利用PCV2基因组小，能够进行滚环复制的特点，具有操作简单、易控制等优点，病毒PCV2的3D拓扑结构如图2-A所示；将PRRSV抗原插入PCV2病毒得到的重组病毒具有PRRSV和PCV2的双重抗原特性，能够使机体同时对PRRSV和PCV2产生免疫反应。

所述PRRSV抗原选自从PRRSV中具有较好的免疫原性的多肽，所述PRRSV抗原选自如下(a1)～(a9)所示序列编码的抗原的至少一种，优选以(a1)～(a9)所示序列编码的抗原中的一种或者两种与PCV2整合得到PCV2-PRRSV重组病毒，合适数量的PRRSV抗原可以优化PCV2-PRRSV重组病毒的免疫原性。

在一些优选的实施方式中，作为载体的PCV2病毒具有如SEQ ID NO.10所示序列的基因，具有SEQ ID NO.10所示的基因的PCV2病毒为弱毒株，免疫机体时具有良好的安全性。在一些优选的实施方式中，所述PCV2-PRRSV重组病毒具有感染性，可以在细胞中增殖。

在一些优选的实施方式中，为了使PCV2-PRRSV中的PRRSV的抗原表位更容易被免疫细胞和抗体识别，重组得到的PCV2-PRRSV中PRRSV抗原暴露于重组病毒的表面，其形成的PCV2-PRRSV重组病毒的3D拓扑结构如图2-B所示。PCV2-PRRSV具有典型的20面体对称，病毒粒子约为18-20nm，参见见图6电镜照片。

在一些优选的实施方式中，所述PCV2-PRRSV重组病毒在PK-15细胞中增殖。PK-15细胞为猪肾传代细胞，对猪圆环病毒敏感，PCV2-PRRSV重组病毒能够在PK-15细胞上良好的生长和增殖。

本发明还提供了一种基因，该基因主要由编码PCV2的基因和编码PRRSV抗原的基因组成。其中“组成”指的是编码PRRSV抗原的基因序列例如可以为但不限于为连接在PCV2基因5’端的上游或者PCV2基因3’端的下游，还可以将PRRSV抗原的基因序列插入到PCV2基因中的任何，同时不影响实现重组病毒功能的位置，可以理解的是，基因中还可以包括启动子、终止子、调节基因转录表达的元件以及编码连接PCV2和PRRSV抗原连接肽的序列。所述编码PRRSV抗原的基因选自如下(b1)～(b9)中的至少一种；优选为(b1)～(b9)中的一种或者两种：

在一些优选的实施方式中，所述编码PCV2的基因的序列如SEQ ID NO.10所示序列，具有如SEQ ID NO.10所示序列的PCV2是弱毒株，在保持免疫原性的同时具有较低的致病性。

在一些优选的实施方式中，编码PRRSV抗原的基因位于PCV2的Cap基因的3’端，可以使PRRSV抗原表达后暴露于PCV2-PRRSV重组病毒的病毒粒子表面。

本发明还提供了一些生物材料，这些生物材料指的是：表达盒、载体、重组微生物和细胞系。

其中“表达盒”指的是能够提供和调节其中引入的编码核酸序列的表达的核酸构建体，可选的包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。

“载体”指的是能够使所述基因引入原核或真核细胞中，优选能够在原核或真核细胞中复制和/或表达的载体，载体包括但不限于为质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。

重组微生物指是经过修饰、改变或者工程化等操作后，与起始微生物呈现不同基因型或者表型的，能够复制和/或表达所述基因的微生物。

细胞系指的是经过修饰、改变或者工程化等操作后，与起始微生物呈现不同基因型或者表型的，能够复制和/或表达所述基因的细胞，优选包括但不限于为哺乳动物细胞。

具体的，所述生物材料选自如下：(n1)含有上述基因的表达盒；(n2)含有上述基因的载体，或含有(n1)所述表达盒的载体；(n3)含有上述基因的重组微生物，含有(n1)所述表达盒的重组微生物，或含有(n2)所述载体的重组微生物；(n4)含有上述基因的细胞系，含有(n1)所述表达盒的细胞系，或含有(n2)所述载体的细胞系；(n5)含有上述PCV2-PRRSV重组病毒的重组微生物；(n6)含有上述PCV2-PRRSV重组病毒的细胞系。

本发明还提供了上述PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法，该方法包括在宿主中表达编码所述PCV2-PRRSV重组病毒的基因。宿主指的是可以用外源核酸转化或转染的任何能够复制和/或表达所述基因的原核微生物、真核微生物或者昆虫、植物以及哺乳动物或者他们的细胞等。具体的，包括但不限于为在大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统或者哺乳动物表达系统中表达编码所述PCV2-PRRSV重组病毒的基因。

在一些优选的实施方式中，构建编码所述PCV2-PRRSV重组病毒的基因的感染性克隆，将所述感染性克隆在宿主中表达；病毒的感染性克隆是一种对于真核细胞具有感染性的病毒基因组克隆的质粒形式，将病毒基因组的DNA或cDNA克隆整合到载体中，通过体外转录成RNA或直接转染后，具有感染真核细胞的能力。将编码所述PCV2-PRRSV重组病毒的基因的感染性克隆转入宿主细胞中，并进行病毒拯救，获得PCV2-PRRSV重组病毒。

在一些优选的实施方中，以哺乳动物细胞为宿主，在一些更优选的实施方式中，以PK-15细胞为宿主，以pBluescript II SK作为载体构建感染性克隆，能够使PK-15细胞中PCV2的Cap蛋白的产量显著提高，降低了生产成本。

在一些可选的实施方式中，按照下述方法制备PCV2-PRRSV重组病毒：

(1)将PRRSV抗原多肽与PCV2型全基因组Cap蛋白羧基端相连。通过人工合成整段全基因组，命名为PCV2-PRRSV。

(2)将PCV2-PRRSV全基因组克隆插入到pBluescriptⅡsk(+)载体中，构建出PCV2DNA克隆，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，获得pBluescriptⅡPCV2-PRRSV质粒，质粒图谱如图1所示。

(3)pBluescriptⅡPCV2-PRRSV质粒通过FreeStyle^TM MAX Reagent转染至PK-15细胞，FreeStyle^TM MAX Reagent是一种新型阳离子脂质体转染试剂，通过表面的高正压电荷密度凝聚带负电的DNA分子，形成紧密的FreeStyle^TM MAX-DNA复合物，并可黏附到带有负电荷的细胞表面残基，进入细胞，转染效率极高，命名为PK-PCV2-PRRSV，获得PCV2-PRRSV重组病毒。

(4)PCV2-PRRSV重组病毒感染PK-15细胞并能进行稳定传代，经盲传5代后，其TCID50可以达到10^6.55/mL，与其亲本病毒相近，显示出较高的感染滴度。其中PK-15细胞优选悬浮培养，以提高PCV2-PRRSV重组病毒的产量。

在一些优选的实施方式中，按照如下方法增殖PCV2-PRRSV重组病毒，产量较佳：将PK-PCV2-PRRSV细胞复苏后培养于细胞瓶形成细胞单层，用可消化细胞量的0.25％胰酶-EDTA消化，加入适量DMEM生长液(含8％胎牛血清和1％双抗)吹打，分散细胞成单个，加入DMEM生长液，做10倍梯度稀释至10～20个细胞/ml，铺于96孔板，0.1m1/孔，于37℃，5％CO₂培养10天左右观察孔内细胞克隆数，将单个克隆继续稀释成单个细胞，进一步亚克隆，经三次亚克隆后，挑单克隆株进行扩大培养，并用间接免疫荧光的方法检测其对PCV2的易感性。选择对PCV2增殖敏感的克隆细胞株，置于37℃温箱培养传代3次(标记为P1代)，加入适量细胞冻存液冻存。

本发明还提供了上述PCV2-PRRSV重组病毒，编码上述PCV2-PRRSV重组病毒的基因，和上述PCV2-PRRSV重组病毒，或上述基因相关的生物材料，以及上述PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法的应用。所述应用包括：制备PCV2和/或PRRSV的抗原或者抗体，所述抗体可选的可以通过将含有PCV2和/或PRRSV的抗原的物质注入哺乳动物体内，再收集哺乳动物体内产生的抗体，或者收集能够产生抗体的B细胞，再通过制备杂交瘤细胞获得单克隆抗体。相应地，所述应用还可以包括制备试剂和/或试剂盒，试剂和/或试剂盒包括但不限于为：PCV2-PRRSV重组病毒，编码上述PCV2-PRRSV重组病毒的基因，上述PCV2-PRRSV重组病毒，上述基因相关的生物材料，PCV2和/或PRRSV的抗原或者抗体，包含抗体的血清，和生产抗体的杂交瘤细胞。

在一些的实施方式中，将上述PCV2-PRRSV重组病毒应用于制备疫苗，所述PCV2-PRRSV重组病毒可以作为疫苗的主要活性物质或者辅助活性物质，以辅助主要免疫原增强免疫效果。所述活性物质指的是能够免疫机体使机体产生有效量的抗体的物质。

PCV2-PRRSV重组病毒以PCV2病毒为载体，表达PRRSV抗原，并且该重组病毒在一些优选的实施方式中还具有感染性，因此其可以作为活载体疫苗的主要活性物质。

活载体疫苗是将有效的目的抗原的编码基因通过分子生物学手段导入活载体，构建重组毒株，使目的基因随着重组病毒在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护应。活载体疫苗可诱导动物产生体液免疫和细胞免疫，具有免疫效果好、成本低、稳定性好、诱导位点专一和免疫方式简单等优点。

本发明还提供了一种疫苗，该疫苗以上述PCV2-PRRSV重组病毒，编码上述PCV2-PRRSV重组病毒的基因，和上述PCV2-PRRSV重组病毒，或上述基因相关的生物材料作为主要活性物质，以制备成为基因疫苗、亚单位疫苗或者活载体疫苗。本发明提供的疫苗具有PRRSV和PCV2双免疫原性，能达到实现一针防两病的目的。

在一些优选的实施方式中，所述疫苗以所述PCV2-PRRSV重组病毒作为活性成分。可以理解的是，所述疫苗还可以包含药学上可接受的辅料，所述辅料包括但不限于为疫苗佐剂、稳定剂、保护剂、赋形剂或溶剂。

在一些优选的实施方式中，所述辅料包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包括但不限于为：氢氧化铝胶、弗氏完全或者不完全佐剂、白油佐剂、细胞因子类佐剂或者核算类佐剂。在一些优选的实施方式中，所述免疫佐剂包括CpG-DNA类疫苗佐剂，采用CpG-DNA类佐剂，是根据其能被TLR-9特异性识别并触发免疫应答，会增加IFN-γ的表达。CpG-DNA在疫苗使用中作为免疫增强剂，能促进细胞因子的分泌，减小疫苗使用剂量。该佐剂对细胞的免疫激活是一个很温和却很快速有效的过程，CpG-DNA以其独特的分子结构和对Toll/IL-1R信号通路的激活作用，可激发体内非特异性的体液和细胞免疫反应。在一些优选的实施方式中，CpG-DNA类佐剂中CpG的序列选自SEQ ID NO.11所示序列和/或SEQ ID NO.12所示序列。

编号	序列
		SEQ ID NO.11	TCCAGGACGACCTCACGTT
SEQ ID NO.12	TCATCGTGTGCGGCACGCGCCG

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1 PCV2-PRRSV基因合成

根据登录GenBank获得PRRSV和PCV2型基因组，通过序列比对分析，最终确定候选基因序列，PRRSV中和表位基因序列来源于GenBank:JN654459，本实施例以具有如SEQ IDNO.6所述的PRRSV多肽为例，如SEQ ID NO.6所述的PRRSV多肽来源于PRRSV的Cap5蛋白，Gp5蛋白是由PRRSV的ORF5编码的囊膜糖蛋白，是构成PRRSV的结构蛋白中的唯一糖蛋白，暴露在病毒粒子表面并且存在能与病毒发生作用的表位，至少含有两种中和性抗原决定簇，是PRRSV主要的保护性抗原。将PRRSV Gp5多肽基因序列与PCV2 Cap蛋白基因序列，通过序列首尾相连。在基因两端插入酶切位点HindⅢ，送往合成公司进行基因合成，并插入到克隆载体pMD18T中。

实施例2构建pBluescriptⅡPCV2-PRRSV质粒

(1)酶切：采用限制性内切酶HindⅢ分别双酶切含目的基因的阳性克隆载体和载体pBluescript SKⅡ(+)，具体反应体系如下：

加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，按照OMEGA公司质粒纯化回收试剂盒说明书对酶切片段进行纯化回收。纯化产物溶于30μL无DNA酶、RAN酶三蒸水中。

(2)连接：按照T4 DNA连接酶说明书，在200μL的PCR管中进行连接反应。10μL连接体系如下：

酶切纯化产物	2μL
		pBluescript SKⅡ(+)酶切纯化产物	1μL
10×连接酶缓冲液	1μL
		T4 DNA连接酶	1μL
三蒸水	5μL

加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，室温连接3h。

(3)转化：取新鲜制备的DH5α感受态细胞置于冰上，轻弹管壁使其混匀；吸取10μL的连接物加入感受态细胞的离心管中；轻弹管壁，混匀细胞和连接物，然后冰浴20min；于42℃水浴热激90s后，立即冰浴2min；加入900μL孵育至室温的LB液体培养基，置于37℃，150r/min振荡培养45～60min；吸取100μL菌液涂布于LB/Amp⁺/X-gal/IPTG平板上，37℃培养过夜(12～16h)，观察菌落生长情况，根据蓝白斑筛选重组转化体。

(4)重组质粒的提取：挑取白色菌落(重组子)接种3mL LB/Amp⁺液体培养基中，37℃震荡过夜。按北京天根生物技术有限公司的高纯度质粒小提中量试剂盒说明书操作进行。用20～50μL含RNase A(20g/mL)、无DNase的三蒸水(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀物，置-20℃冻存备用。

(5)酶切鉴定：将筛选的重组质粒按照如下体系进行酶切实验：

pBluescriptⅡPCV2-PRRSV	3μL
		Nde I	1μL
10×Buffer	5μL
		三蒸水	11μL

加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，将酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，酶切鉴定结果如图3所示。

(6)测序鉴定：选取插入目的基因的阳性重组子，利用位于克隆载体pBluescriptSKⅡ(+)两侧的T3启动子和T7启动子通用测序引物结合位点，对DNA进行自动测序，序列测定由上海生物工程技术有限公司完成。

实施例3 pBluescriptⅡPCV2-PRRSV质粒转入PK-15细胞

采用Invitrogen公司脂质体LipofectamineTM2000进行转染。具体步骤如下：

(1)在六孔细胞培养板中每孔加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，并接种10⁵个细胞，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。至细胞达到40％～60％丰度时，各孔细胞用2mL平衡至室温的Opti-MEM无血清培养洗涤一次。

(2)在两个1.5mL Eppendorf管中分别加入250μL Opti-MEM，前者加入4g质粒DNA颠倒混匀；后者加入10μL LipofectamineTM2000轻轻混匀，并在室温孵育5min。待反应结束后将两个管子的反应物加在一起上下混匀后，在室温反应20min。

(3)在无血清Opti-MEM洗涤过的细胞培养板中加入1.5mL Opti-MEM，待上一步的反应结束后，立即将脂质体和质粒的反应混合物加入细胞培养孔中。

(4)37℃作用5h后吸取转染液，加入含10％胎牛血清的DMEM，反应18～48h。

(5)转染时，设一孔细胞直接转染脂质体，作为阴性对照。取转染细胞培养上清接种PK-15细胞，连续盲传5代后进行TCID₅₀测定。

实施例4拯救病毒检测

(1)IFA检测：PBS洗涤转染细胞3次，3min/次；用固定液于室温固定10～15min，同前洗涤，并将细胞37℃或室温干燥30min；PBST洗涤3次，3min/次；加入兔抗PCV2 ORF2多克隆抗体(1∶40稀释)，37℃作用1h，同前洗涤；用稀释液将FITC-羊抗兔作1∶200倍稀释，37℃作用4h后，PBST洗3次，3min/次；试验结束后，进行镜下观察，阳性PCV2-PRRSV重组病毒检测结果如图5-A所示，阴性PCV2-PRRSV重组病毒检测结果如图5-B所示。

(2)RT-PCR检测：根据PCV2全基因组序列，设计一对引物，具有如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示序列：

引物	序列(5'-3')	编号
			Forward1	AAGGGCTGGGTTATGGTATG	SEQ ID NO.13
Reverse2	CGCTGGAGAAGGAAAAATGG	SEQ ID NO.14

上述引物可对PCV2的ORF2进行扩增。用该对引物对反转录产物进行PCR检测，根据扩增结果评定PCV2 ORF2的表达情况。收集细胞，反复冻融三次，按Trizol LS Reagent说明，提取细胞总RNA并进行PCR鉴定，细胞总RNA提取参照天根细胞/细菌总RNA提取试剂盒(DP430)的说明书进行。对按上述方法提取的总RNA进行反转录以合成cDNA。cDNA合成方法按Reverse Transcriptase说明进行，建立20μL反转录体系，42℃2h，然后95℃变性5min，反应体系如下：

5×RT Buffer	12μL
		10mmol/L dNTPs	4μL
50μmol/L Oligo(dT)	1μL
		AMV反转录酶(10U/μL)	1μL
总RNA	2μL

以cDNA作为PCR模板，建立50μL PCR反应体系，反应体系如下：

10×PCR Buffer	5μL
		10mmol/L dNTPs	1μL
25μmol/L上、下游引物各	1μL
		cDNA	2μL
Taq DNA聚合酶	2.5U
		加三蒸水至	50μL

反应程序如下：94℃3min(预变性)；94℃30s，50℃～55℃30s，72℃30～40s，共31个循环；72℃10min(延伸)。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，结果如图4所示，并将PCR产物进行测序鉴定。

(3)PCV2-PRRSV重组病毒的含量测定：将拯救病毒细胞毒按10倍比稀释，取10^-2～10^-8共7个稀释度，接种到96孔板中，每个稀释度接种8孔，0.1ml/孔，另外设立一组对照；加入10％DMEM营养液，0.1ml/孔。37℃培养72h，每天注意观察并途中更换营养液1次；72h后弃去上清，PBS洗涤转染细胞3次，3min/次；用固定液于室温固定10～15min，洗涤3次，并将细胞37℃或室温干燥30min；PBST洗涤3次，3min/次；加入兔抗PCV1 ORF2多克隆抗体(1∶40稀释)，37℃作用1h，洗涤3次；用稀释液将FITC-羊抗兔作1∶200倍稀释，37℃作用4h后，PBST洗3次，3min/次；试验结束后，进行镜下观察。若孔内细胞核被染成亮绿色荧光判定为阳性，未见亮绿色荧光判定为阴性，若孔内细胞核被染成亮绿色荧光判定为阳性，未见亮绿色荧光判定为阴性。

实施例5 PCV2-PRRSV悬浮培养

将250g片状载体装入生物反应器中，校正电极，高压灭菌并进行无菌验证，无菌检验合格后即进行细胞培养。

将生长至单层的PK-15细胞经胰酶消化后，用MEM培养液吹得瓶壁，使细胞分散均匀。细胞计数后，5L生物反应器培养时细胞初始浓度接种量为3×10⁶，接毒剂量为0.1MOI，转速40r/min，培养温度37℃，pH值为7.2，血清浓度4％。在细胞悬浮培养工艺各参数固定不变。每日定时取样进行相关参数测定。一般进行2～3倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37℃培养至第2日将温度降至35℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，每日检测葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当细胞活率低于60％时，收获抗原。

实施例6 PCV2-PRRSV活载体疫苗的制备

将PCV2-PRRSV重组病毒使用PBS溶液稀释，将稀释后的PCV2-PRRSV重组病毒与CpG佐剂按1％比例混合在一起，以8000r/min的转速搅拌10min，在终止搅拌前加入0.01％(体积比)硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀后，按照现行版中国兽药典附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用，制得PCV2-PRRSV重组病毒活载体疫苗。其中CpG-DNA类疫苗佐剂中CpG的序列选自SEQ ID NO.11所示序列。

实施例7 PCV2-PRRSV活载体疫苗的应用

(1)动物试验：挑选18-20g健康BALB/C小鼠40只，隔离饲养观察3日，按照分组进行免疫，分组见表1。

表1 PRRSV与PCV2活载体疫苗组合物分组情况

免后采血检测，评估抗体水平变化规律，首免后21日，进行二次免疫。首免后42日采血和攻毒，分离血清，进行PRRSV中和抗体检测；应用IFA进行PCV2抗体检测。

(2)IFA检测结果：应用间接免疫荧光试验检测可知，各免疫组抗体水平均转阳，PCV2-PRRSV疫苗免疫组PCV2抗体平均效价均不低于1:1024；与各参考疫苗组抗体水平差异不显著；对照组没有抗体产生。说明PCV2-PRRSV重组病毒具有良好的免疫原性，能够产生针对PCV2的特异性抗体，结果如表2所示。

表2疫苗免后28日IFA检测结果

(2)PRRSV中和抗体检测结果：为了解各免疫组抗体产生情况，采集免疫后42日小鼠血清进行PRRSV中和抗体监测，检测情况如表3所示：

表3免疫后42日小鼠血清进行PRRSV中和抗体监测结果

实施例8 PCV2-PRRSV疫苗安全性试验

(1)小鼠安全性试验：为评价疫苗组合物的的安全性，对疫苗组合物的进行小鼠安全性试验研究。选用昆明小鼠，随机分为4组，即空白对照组(NS)、单剂量组(0.2mL/只)、单剂量重复组(0.2ml/只)、超剂量组(0.4ml/只)通过腹腔注射方式进行免疫，自由采食与饮水。连续饲喂14天后，观察小鼠生长状况，有无不良反应，采食是否异常等临床症状；取其心、肝、脾、肺、肾组织固定，用于组织切片检查。结果显示，与空白对照组相比，三个剂量组小鼠均未表现出不良反应，精神状态良好，采食正常，没有小鼠死亡；小鼠脏器组织结构正常，没有出现明显的病理组织变化。实验表明该疫苗组合物安全可靠。

(2)仔猪安全性试验：将疫苗组合物通过颈部肌肉注射途径超剂量(4ml/头)接种21日龄仔猪，连续饲喂观察14天，观察仔猪颈部接种部位是否有化脓、红肿以及不良反应出现，仔猪体温是否升高。结果显示，与对照组相比，疫苗免疫组仔猪颈部接种部位没有化脓、红肿以及不良反应出现，仔猪体温接种时略升高0.5℃，接种疫苗24小时后，体温恢复正常。实验表明该疫苗组合物对于仔猪是安全可靠的。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物(上海)有限公司

天康生物股份有限公司

<120> PCV2-PRRSV重组病毒及其制备方法、基因、应用和疫苗

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 猪繁殖与呼吸道综合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome virus）

<400> 1

ccaccagctg gtactggagg agtgggcctc gtg 33

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<400> 2

cgcggcaaag gtccaggtaa gaagaataaa aataggaacc cagaaaag 48

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<400> 3

cccgaaaagc cccacttccc cctcgctacc gaagacgacg tacgccatca t 51

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<400> 4

tttgtagtaa gaagacccgg ctccacaaca gtaaatggca ctctagtacc ctttaagtcc 60

ctcgtactcg gcggcctg 78

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<400> 5

tcccatctcc agctcatcta taaccttacc atctgc 36

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<400> 6

actcccgtga ctaagatatc cgccgaacaa tggggaagac cc 42

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<400> 7

agaagatttg ctaaatccct caatgctgct agaaga 36

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<400> 8

caagctgctc aaatctttga acccggaaga tcc 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<400> 9

tcccccgctg cttttagaaa aataccccaa tgc 33

<210> 10

<211> 3614

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type two）

<400> 10

gctggctgaa cttttgaaag tgagcgggaa aatgcagaag cgtgattgga agacgaatgt 60

acacgtcatt gtggggccac ctgggtgtgg caaaagcaaa tgggctgcta attttgcaga 120

cccggaaacc acatactgga aaccacctag aaacaagtgg tgggatggtt accatggtga 180

agaagtggtt gttattgatg acttttatgg ctggctgccg tgggatgatc tactgagact 240

gtgtgatcga tatcctttga ctgttgagac taaaggtgga actgtacctt ttttggcccg 300

cagtattctg attaccagca atcagacccc gttggaatgg tactcctcaa ctgctgtccc 360

agctgtagaa gctctctatc ggaggattac ttccttggta ttttggaaga atgctacaga 420

acaatccacg gaggaagggg gccagttcgt caccctttcc cccccatgcc ctgaatttcc 480

atatgaaata aattactgag tcttttttat cacttcgtaa tggtttttat tattcactta 540

gggtcttccc cattgttcgg cggatatctt agtcacggga gtgggtttaa gtggggggtc 600

tttaagatta aattctctga attgtacata catggttata cggatattgt agtcctggtc 660

gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacatgg tctacatttc cagtagtttg 720

tagtctcagc cagagttgat ttcttttgtt attgggttgg aagtaatcga ttgttccatc 780

aaggacaggt ttcggggtaa agtaccggga gtggtaggag aagggctggg ttatggtatg 840

gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggttagggca ttggcctttg ttacaaagtt 900

atcatctaga ataacagcag tggagcccac tcccctgtca ccctgggtga ttggggagca 960

gggccagaat tcaaccttaa ccttccttat tctgtagtat tcaaagggca cagtgagggg 1020

gtttgagccc cctcctgggg gaagaaaatc attaatatta aatctcatca tgtccacatt 1080

ccaggaggga gttctgactg tggttttgtt gacagtataa ccgatggtgc gggagaggcg 1140

ggtgttgaag atgccatttt tccttctcca gcggtaacgg tggcgggggt ggacgagcca 1200

ggggcggcgg cggaggatct ggccaagatg gctgcggggg cggtgtcttc gtctgcggaa 1260

acgcctcctt ggatacgtca tcgctgaaaa cgaaagaggt gcgctgtaag tattaccagc 1320

gcacttcggc agcggcagca cctcggcagc acctcagcag caacatgccc agcaagaaga 1380

gtggaagaag cggaccccaa ccacataaaa ggtgggtgtt cacgctgaat aatccttccg 1440

aagacgagcg caagaaaata cgggagctcc caatctccct atttgattat tttattgttg 1500

gcgaggaagg taatgaggag ggccgaacac cccacctaca ggggttcgct aattttgtga 1560

agaagcaaac ttttaataaa gtgaagtggt attttggtgc ccgctgccac atcgagaaag 1620

cgaaaggaac agatcagcag aataaagaat attgcagtaa agaaggcaac ttactgatag 1680

aatgtggagc tcctagatct caaggacaac ggagtgacct ctctactgct gtgagtacct 1740

tgttggagag cgggagtctg gtgaccgttg cagagcagca ccctgtaacg tttgtcagaa 1800

atttccgcgg gctggctgaa cttttgaaag tgagcgggaa aatgcagaag cgtgattgga 1860

agacgaatgt acacgtcatt gtggggccac ctgggtgtgg caaaagcaaa tgggctgcta 1920

attttgcaga cccggaaacc acatactgga aaccacctag aaacaagtgg tgggatggtt 1980

accatggtga agaagtggtt gttattgatg acttttatgg ctggctgccg tgggatgatc 2040

tactgagact gtgtgatcga tatcctttga ctgttgagac taaaggtgga actgtacctt 2100

ttttggcccg cagtattctg attaccagca atcagacccc gttggaatgg tactcctcaa 2160

ctgctgtccc agctgtagaa gctctctatc ggaggattac ttccttggta ttttggaaga 2220

atgctacaga acaatccacg gaggaagggg gccagttcgt caccctttcc cccccatgcc 2280

ctgaatttcc atatgaaata aattactgag tcttttttat cacttcgtaa tggtttttat 2340

tattcactta gggtcttccc cattgttcgg cggatatctt agtcacggga gtgggtttaa 2400

gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata catggttata cggatattgt 2460

agtcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacatgg tctacatttc 2520

cagtagtttg tagtctcagc cagagttgat ttcttttgtt attgggttgg aagtaatcga 2580

ttgttccatc aaggacaggt ttcggggtaa agtaccggga gtggtaggag aagggctggg 2640

ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggttagggca ttggcctttg 2700

ttacaaagtt atcatctaga ataacagcag tggagcccac tcccctgtca ccctgggtga 2760

ttggggagca gggccagaat tcaaccttaa ccttccttat tctgtagtat tcaaagggca 2820

cagtgagggg gtttgagccc cctcctgggg gaagaaaatc attaatatta aatctcatca 2880

tgtccacatt ccaggaggga gttctgactg tggttttgtt gacagtataa ccgatggtgc 2940

gggagaggcg ggtgttgaag atgccatttt tccttctcca gcggtaacgg tggcgggggt 3000

ggacgagcca ggggcggcgg cggaggatct ggccaagatg gctgcggggg cggtgtcttc 3060

gtctgcggaa acgcctcctt ggatacgtca tcgctgaaaa cgaaagaggt gcgctgtaag 3120

tattaccagc gcacttcggc agcggcagca cctcggcagc acctcagcag caacatgccc 3180

agcaagaaga gtggaagaag cggaccccaa ccacataaaa ggtgggtgtt cacgctgaat 3240

aatccttccg aagacgagcg caagaaaata cgggagctcc caatctccct atttgattat 3300

tttattgttg gcgaggaagg taatgaggag ggccgaacac cccacctaca ggggttcgct 3360

aattttgtga agaagcaaac ttttaataaa gtgaagtggt attttggtgc ccgctgccac 3420

atcgagaaag cgaaaggaac agatcagcag aataaagaat attgcagtaa agaaggcaac 3480

ttactgatag aatgtggagc tcctagatct caaggacaac ggagtgacct ctctactgct 3540

gtgagtacct tgttggagag cgggagtctg gtgaccgttg cagagcagca ccctgtaacg 3600

tttgtcagaa attt 3614

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tccaggacga cctcacgtt 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcatcgtgtg cggcacgcgc cg 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagggctggg ttatggtatg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgctggagaa ggaaaaatgg 20

Claims

1.PCV2-PRRSV重组病毒，所述重组病毒以PCV2病毒为载体，表达PRRSV抗原；所述PRRSV抗原选自如下(a1)～(a9)中的至少一种：

(a1)如SEQ ID NO.1所示序列编码的抗原；(a2)如SEQ ID NO.2所示序列编码的抗原；(a3)如SEQ ID NO.3所示序列编码的抗原；(a4)如SEQ ID NO.4所示序列编码的抗原；(a5)如SEQ ID NO.5所示序列编码的抗原；(a6)如SEQ ID NO.6所示序列编码的抗原；(a7)如SEQID NO.7所示序列编码的抗原；(a8)如SEQ ID NO.8所示序列编码的抗原；(a9)如SEQ IDNO.9所示序列编码的抗原。

2.根据权利要求1所述的PCV2-PRRSV重组病毒，其特征在于，作为载体的PCV2病毒由SEQ ID NO.10所示编码；

优选地，所述PRRSV抗原选自(a1)～(a9)中的一种或者两种。

3.根据权利要求1所述的PCV2-PRRSV重组病毒，其特征在于，所述PCV2-PRRSV重组病毒具有感染性；

优选地，所述PRRSV抗原暴露于重组病毒的表面。

4.根据权利要求1-3任一项所述的PCV2-PRRSV重组病毒，其特征在于，所述PCV2-PRRSV重组病毒在PK-15细胞中增殖。

5.基因，主要由编码PCV2的基因和编码PRRSV抗原的基因组成；所述编码PRRSV抗原的基因选自如下(b1)～(b9)中的至少一种；

(b1)如SEQ ID NO.1所示序列；(b2)如SEQ ID NO.2所示序列；(b3)如SEQ ID NO.3所示序列；(b4)如SEQ ID NO.4所示序列；(b5)如SEQ ID NO.5所示序列；(b6)如SEQ ID NO.6所示序列；(b7)如SEQ ID NO.7所示序列；(b8)如SEQ ID NO.8所示序列；(b9)如SEQ ID NO.9所示序列；

优选地，所述编码PRRSV抗原的基因选自如下(b1)～(b9)中的一种或者两种。

6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，所述编码PCV2的基因如SEQ ID NO.10序列所示；

优选地，编码PRRSV抗原的基因位于PCV2的Cap基因的3’端。

7.生物材料，其特征在于，选自如下(n1)～(n6)中的一种或多种：

(n1)含有权利要求5或6所述基因的表达盒；

(n2)含有权利要求5或6所述基因的载体，或含有(n1)所述表达盒的载体；

(n3)含有权利要求5或6所述基因的重组微生物，含有(n1)所述表达盒的重组微生物，或含有(n2)所述载体的重组微生物；

(n4)含有权利要求5或6所述基因的细胞系，含有(n1)所述表达盒的细胞系，或含有(n2)所述载体的细胞系；

(n5)含有权利要求1-4任一项所述的PCV2-PRRSV重组病毒的重组微生物；

(n6)含有权利要求1-4任一项所述的PCV2-PRRSV重组病毒的细胞系。

8.权利要求1-4任一项所述的PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法，其特征在于，在宿主中表达编码所述PCV2-PRRSV重组病毒的基因；

优选地，构建编码所述PCV2-PRRSV重组病毒的基因的感染性克隆，将所述感染性克隆在宿主中表达；

优选地，以pBluescript II SK作为载体构建感染性克隆；

优选地，所述宿主为哺乳动物细胞；优选为PK-15细胞；

优选地，所述宿主为悬浮培养的PK-15细胞；

优选地，所述制备方法还包括筛选对PCV2-PRRSV重组病毒敏感的单克隆细胞株，并增殖所述单克隆细胞株。

9.权利要求1-4任一项所述的PCV2-PRRSV重组病毒，权利要求5或6所述的基因，权利要求7所述的生物材料，或权利要求8所述的PCV2-PRRSV重组病毒的制备方法的应用，所述应用包括(x1)～(x3)中至少一种：

(x1)制备抗体或者抗原；

(x2)制备用于检测抗体或者抗原的试剂或试剂盒；

(x3)制备疫苗。

10.疫苗，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的PCV2-PRRSV重组病毒，权利要求5或6所述的基因，或权利要求7所述的生物材料；

优选地，所述疫苗以所述PCV2-PRRSV重组病毒作为活性成分；

优选地，所述疫苗还包疫苗佐剂；

优选地，所述疫苗佐剂包括CpG-DNA类疫苗佐剂；

优选地，所述CpG-DNA类疫苗佐剂中CpG的序列选自SEQ ID NO.11所示序列和/或SEQID NO.12所示序列。