CN110396064B - 甲磺酰胺衍生物及其制备方法和防治阿尔茨海默病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供甲磺酰胺衍生物及其制备方法和防治阿尔茨海默病的应用，属于药物领域，该类甲磺酰胺衍生物具有如下的结构通式：

这是一类具有抗阿尔茨海默病潜力的多功能活性小分子，它们具有优异的抗炎活性，能够显著逆转脂多糖(LPS)或β‑淀粉样蛋白(Aβ)诱导的M1型小胶质细胞向M2型转变，促进小胶质细胞对Aβ的吞噬和清除能力，且活体试验结果表明这类甲磺酰胺衍生物可以显著延缓Aβ转基因秀丽隐杆线虫CL4176的瘫痪及延长其寿命，因此表明这类甲磺酰胺衍生物在转变小胶质细胞表型及清除Aβ斑块方面的性能可用于防治阿尔茨海默病。

Description

甲磺酰胺衍生物及其制备方法和防治阿尔茨海默病的应用

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一种甲磺酰胺衍生物及其制备方法和阿尔茨海默病的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种老年人常见的神经退行性疾病。据报道，全球目前约有5000万AD患者，到2050年预计会达到1.52亿人。AD的临床表现为认知功能减退，学习记忆能力受损等，在临床确诊后平均9年内死亡。目前FDA批准的药物有他克林、多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏及美金刚，然而这些药物只能对AD起到轻微和短期的减缓作用，目前还没有治疗或阻止发病进程的有效药物。

AD的病理学特征主要是细胞外由β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集体形成的老年斑(SP)，Aβ聚集沉积过程可能在痴呆症状出现之前数年甚至数十年已经开始。越来越多的证据表明，Aβ的异常聚集是AD发病机制中的一个关键启动事件，从而促进一系列后续病理变化，如慢性炎症反应、进行性突触损伤等。因此，大量文献报道了通过减少Aβ产生，抑制聚集或加速清除聚集体的潜在药物，其中一些针对Aβ生成(Aβ分泌酶抑制剂)或清除(Aβ抗体)的药物已进入临床试验，但大多数药物仍难以改善患者的认知功能，且目前尚未进入临床应用。

在中枢神经系统(CNS)中，Aβ的清除主要是由具有吞噬功能的小胶质细胞介导的(Nat.Cell Biol.2011,13,1-9)，研究结果显示，在大脑淀粉样变性过程中，小胶质细胞的吞噬功能随之受损。小胶质细胞作为CNS中唯一的常驻巨噬细胞，是主动免疫防御的第一道也是最重要的安全防线。AD患者大脑中Aβ斑块周围存在大量活化的小胶质细胞，活化的小胶质细胞有两种相反的表型，即经典活化型(M1)和可替代活化型(M2)。M1型小胶质细胞产生各种神经毒性介质和炎症细胞因子，如白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超氧化物、一氧化氮和活性氧等物质，诱发神经毒性，另外一方面，M2表型小胶质细胞通常产生抗炎细胞因子并促进组织重塑和修复(Brain Behav.Immun.2010,24,1054–1057)，发挥吞噬毒性物质、微生物、死细胞、多余突触、蛋白质聚集体和其他可能危害CNS的微粒和可溶性抗原的功能。然而，在AD进程中常常观察到M2表型的小胶质细胞向促炎M1表型转变(Stroke.2012,43,3063-3070)。因此，通过逆转M1型小胶质细胞向M2型转变，可以清除大脑中的Aβ等有害物质，达到保护中枢神经系统的目的，是一种新颖的具有应用前景的抗AD策略。

发明内容

本发明的目的是针对现有阿尔茨海默病缺治疗药物的存在的缺陷，提供一种甲磺酰胺衍生物及其制备方法，另一目的是提供上述甲磺酰胺衍生物在预防、治疗或改善阿尔茨海默病中的应用。

本发明提供了如下的技术方案：

一种甲磺酰胺衍生物，具有如式I所示的结构：

其中，Ar基团选自

或者

n1、n2、n3和n4为整数0或者1，且当n1或n3为1时，苯环上的两个取代基为对位取代。

如式I所述的化合物为以下结构式表示的任一化合物：

上述甲磺酰胺衍生物的制备方法，包括如下步骤：

S1、将N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺酰胺溶于无水DMF溶液中，并加入碳酸钾，在N₂保护下，室温搅拌；

S2、继续加入

的DMF溶液或

的DMF溶液进行搅拌；

S3、反应结束后，过滤除去沉淀物，减压浓缩，滴加到水溶液中，离心收集沉淀，粗产物通过硅胶柱分离得到目标产品，即甲磺酰胺衍生物。

上述甲磺酰胺衍生物在预防、治疗或改善阿尔茨海默病中的应用。

优选的，所述衍生物还包括立体异构体或其药学上可以接受的盐，以所述衍生物为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的辅料。

优选的，所述衍生物药学上可接受的盐用于中枢神经元再生剂、抗氧化剂、抗炎剂或神经保护剂。

本发明的有益效果是：

目前设计开发的抗AD药物大多是针对某种单一发病机制的天然产物、纳米粒子、抗体等，而对于阿尔茨海默病这类多致病因子疾病，靠单一靶点的药物很难达到理想的治疗效果。本发明中设计的这类甲磺酰胺小分子衍生物具有优异的抗炎性能，能够通过调控M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞转变，降低炎症细胞因子，且含氨基侧链的苯并咪唑或苯并噻唑衍生物对Aβ聚集体具有较高的结合力，这类甲磺酰胺小分子衍生物能够快速吞噬及降解Aβ，最终达到保护神经免受损伤的目的；利用BIPM-1对AD动物模型秀丽隐杆线虫CL4176的行为测试结果表明，BIPM-1对Aβ转基因秀丽隐杆线虫CL4176具有高效的抗Aβ诱导的瘫痪能力，且BIPM-1也可以明显降低Aβ诱导的相关毒性和促炎因子，显著延长Aβ转基因秀丽隐杆线虫的寿命；本发明的制备方法简单易行，故这类甲磺酰胺小分子衍生物在在预防、治疗或改善阿尔茨海默病中具有较大的应用前景。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为BIPM-1的晶体结构图；

图2为BIPM-1的¹H NMR谱图(DMSO-d₆，600MHz)；

图3为BIPM-1的¹³C NMR谱图(DMSO-d₆，600MHz)；

图4为负离子模式下BIPM-1的电喷雾质谱；

图5为BIPM-1对LPS或Aβ刺激的BV-2小胶质细胞产生的炎症细胞因子的影响；

图6为BIPM-1对LPS或Aβ刺激的BV-2小胶质细胞表型的影响；

图7为BIPM-1对BV-2小胶质细胞吞噬和清除Aβ能力的影响；

图8为BIPM-1对Aβ转基因秀丽隐杆线虫CL4176瘫痪的影响；

图9为BIPM-1对Aβ转基因秀丽隐杆线虫CL4176寿命的影响。

具体实施方式

实施例1N-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)甲基)-N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺酰胺(BIPM-1)化合物的制备

S1、将N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺酰胺(0.308g,1mmol)溶于无水DMF溶液(8mL)中，并加入碳酸钾，在N₂保护下，室温搅拌15min；

S2、继续加入2-(氯甲基)苯并咪唑(0.199g,1.2mmol)的DMF溶液并在60℃下搅拌2h，继续在25℃下搅拌过夜；

S3、反应结束后，过滤除去沉淀物，减压浓缩，滴加到水溶液中，离心收集沉淀，粗产物通过硅胶柱分离得到黄色粉末0.247g，产率为56％。¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz,δ,ppm):12.48(s,1H,-NH-),7.92–7.90(q,1H,Ph),7.83–7.82(d,1H,Ph),7.51–7.48(t,4H,苯并咪唑),7.36(d,1H,Ph),7.34–7.32(t,1H,Ph),7.21–7.20(d,2H,Ph),7.15(m,2H,Ph),5.17(s,2H,-CH₂-),3.35(s,3H,-CH₃)。¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz,δ,ppm):155.89,154.51,150.04,148.02,134.93,134.39,131.08,126.25,120.97,118.00,111.67,48.13,40.75.ESI-MSfound(calcd)for C₂₁H₁₈N₄O₅S(m/z):437.92(438.10)[M-H]^-,875.83(438.10)[2M-H]^-。将黄色粉末在乙醇溶液中通过溶剂挥发法得到单晶，通过X-射线单晶衍射仪测得晶体结构，并对其进行结构解析，详细晶体数据存放在剑桥晶体数据中心，CCDC号为1922747，晶体数据如表1所示。

表1 BIPM-1的晶体数据

实施例2 BIPM-1对细胞水平性能影响测试

1、BIPM-1在细胞水平的抗炎性能

操作步骤：将BV-2细胞(3×10⁵个细胞/孔)接种到12孔板中(含10％胎牛血清的DMEM)，并在37℃下培养18h；除去原有培养液，加入不含血清的DMEM培养基；然后，BIPM-1(20μM，4‰DMSO)预处理细胞10h，加入LPS(1μg mL^-1)或预孵育6h的Aβ42(10μM)，在37℃下共培养8h；上述操作完成后，分别收集500μL的细胞上清培养液，并在4℃下以12,000g离心15min，收集上清液；将上清液加入ELISA板的每个孔中，通过酶联免疫分析(ELISA)测得样品中的炎症因子含量。其中LPS指脂多糖，Aβ42指β-淀粉样蛋白。

具体测试结果如图5所示，可见LPS或Aβ在刺激BV-2细胞8h后细胞炎症因子的释放水平明显提高，如IL-6，IL-1β和TNF-α，且与对照组相比，发现BIPM-1预处理后，LPS或Aβ诱导的炎症细胞因子含量显著降低，说明BIPM-1对LPS或Aβ刺激的BV-2细胞(小胶质细胞系)产生的炎症细胞因子有显著的抑制作用。

2、BIPM-1对BV-2小胶质细胞表型的影响

操作步骤：将BV-2细胞接种在20mm玻璃底细胞培养皿(Nest)中，并在37℃下培养18h；然后用BIPM-1(20μM，4‰DMSO)预处理细胞10h，加入LPS(1μg mL^-1)或预孵育6h的Aβ42(10μM)，然后在37℃共培养8h；处理完成后，小心吸出培养液，用冷PBS洗涤细胞，用4％多聚甲醛固定10min，0.5％Triton X-100的PBS溶液透化细胞15min；继续用冷PBS洗涤细胞5min，在室温下用含0.5％BSA的PBS溶液封闭15min；将细胞与相应的一抗在4℃共孵育过夜；用PBS洗涤BV-2细胞两次，并与特异性二抗在室温下孵育1h；最后，PBS洗涤细胞三次，并在ZEISS激光扫描显微镜(LSM 710)下观察。

具体测试结果如图6所示，通过免疫组化分析评估BIPM-1对小胶质细胞表型的影响，以CD86作为小胶质细胞M1型标志物，CD206作为M2型标志物。免疫组化分析显示通过LPS或Aβ刺激BV-2小胶质细胞后M1标志物CD86的表达水平增加，而当用BIPM-1预处理后其表达又显著降低(图6A和B)。另一方面，LPS和Aβ在一定程度上降低了CD206的表达水平，而BIPM-1预处理后恢复且明显提高(图6A和C)，这与释放炎症细胞因子结果一致。相应地，LPS和Aβ可明显增强CD86/CD206极化比，BIPM-1预处理后可恢复及显著降低LPS和Aβ刺激BV-2细胞的CD86/CD206比值(图6A和D)。这些结果都表明BIPM-1可以阻止LPS和Aβ诱导的M1表型小胶质细胞并促进向M2表型小胶质细胞转变，使小胶质细胞从促炎表型向抗炎表型转变。

3、BIPM-1对BV-2小胶质细胞吞噬和清除Aβ性能的影响

操作步骤：将BV-2细胞(3×10⁶个细胞/孔)接种到10cm培养皿中(DMEM+10％胎牛血清)；18h后，将细胞通过BIPM-1(20μM，4‰DMSO)预处理10h，加入预孵育的Aβ42(10μM)，在37℃下分别培养2h、4h和8h，收集细胞；加入细胞裂解液RIPA缓冲液，在冰上将细胞裂解，并在4℃下以8000g离心15min，收集上清；通过斑点印迹免疫分析法(dot blot)对细胞内总Aβ水平进行考察。简言之，在样品中加入loading buffer并在95℃下煮15min，并滴到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；30min后，取出膜并在室温下用5％脱脂奶粉封闭1h；然后将膜与Aβ单克隆抗体(6E10，用PBS-T缓冲液稀释)在4℃孵育过夜；取出膜并用PBS-T缓冲液洗4×5min，膜与辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠lgG抗体(二抗，1:1000)在室温共孵育1h；最后膜上铺满曝光液处理，仪器收集图像。

具体测试结果如图7所示，可见Aβ42与细胞共培养后，与对照组相比，BIPM-1预处理后的小胶质细胞在2h和4h Aβ摄入量显著提高(图7B)；软件定量分析显示，BIPM-1预处理的细胞内摄入的Aβ含量大概提高三倍(图7C)。药物预处理后，当细胞与Aβ42共培养8h后，细胞内摄入的Aβ水平急剧降低(图7B和C)，说明BIPM-1可以加速Aβ摄入和降解清除过程。

实施例3BIPM-1对AD动物模型秀丽隐杆线虫CL4176的行为测试

1、BIPM-1对Aβ转基因秀丽隐杆线虫瘫痪的影响

操作步骤：转基因秀丽隐杆线虫肌肉中的Aβ表达与渐进性瘫痪密切相关。当培养温度从15℃升高至25℃时，肌肉壁细胞中Aβ42大量聚集沉积，引起瘫痪表型。为了研究BIPM-1抑制或延缓Aβ诱导的秀丽隐杆线虫CL4176瘫痪的性能，CL4176线虫转移到含有大肠杆菌OP50及加入尼美舒利(Nimesulide)或BIPM-1(20μM)的NGM培养皿中，不表达Aβ42的CL802线虫作为对照组；让线虫在15℃下产卵2h，弃去成虫，在15℃下生长约36h，当线虫处于L3期时，将NGM培养皿升温至25℃；在升温开始20h后对瘫痪线虫进行计数，在这一时间段，所有线虫都应该达到L4期；每2h对线虫进行一次计数，直到培养皿中所有线虫均瘫痪。

具体结果如图8所示，温度升高36h后，81％未经药物处理的CL4176线虫瘫痪，16.4％尼美舒利药物处理的CL4176线虫瘫痪，BIPM-1处理组仍未发现瘫痪线虫(图8A)。同样地，在显微镜下观察发现，在升高温度36h后CL4176线虫大量瘫痪，线虫不再移动或只是头部移动；而BIPM-1处理后，所有线虫仍然以C型正常运动(图8B)。此外，BIPM处理后并不会影响CL802线虫的正常运动状态(图8A)。总之，这些结果都表明，BIPM-1对Aβ转基因秀丽隐杆线虫CL4176具有高效的抗Aβ诱导的瘫痪能力。

2、BIPM-1对Aβ转基因秀丽隐杆线虫寿命的影响

操作步骤：在16℃下对Aβ转基因秀丽隐杆线虫株CL4176和野生型线虫N2进行寿命测定。简而言之，将同步化后的L4期幼虫转移至含有大肠杆菌OP50的加入尼美舒利或BIPM-1(20μM)的NGM培养皿中，用40μM的FUdR处理以抑制线虫产卵。每两天对线虫进行一次计数，直到每个培养皿中所有线虫都死亡。

具体结果如图9所示，与对照组相比及与尼美舒利处理结果相比，用20μM BIPM-1处理CL4176线虫后其寿命明显延长，表明BIPM-1可以明显降低Aβ诱导的相关毒性，显著延长Aβ转基因秀丽隐杆线虫的寿命。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种甲磺酰胺衍生物，其特征在于，具有如式I所示的结构：

其中，Ar基团选自

或者

n1、n2、n3和n4为整数0或者1，且当n1或n3为1时，苯环上的两个取代基为对位取代。

2.根据权利要求1的一种甲磺酰胺衍生物，其特征在于，如式I所述的化合物的结构式如下：

. 。

3.根据权利要求1的一种甲磺酰胺衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺酰胺溶于无水DMF溶液中，并加入碳酸钾，在N₂保护下，室温搅拌；

S2、继续加入

的DMF溶液或

的DMF溶液，并进行搅拌；

S3、反应结束后，过滤除去沉淀物，减压浓缩，滴加到水溶液中，离心收集沉淀，粗产物通过硅胶柱分离得到目标产品，即甲磺酰胺衍生物。

4.根据权利要求1中所述的甲磺酰胺衍生物在制备预防、治疗或改善阿尔茨海默病的药物方面的应用。

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