CN110387388A - 一种红曲菌利用麦糟产降脂成分Monacolin K的方法 - Google Patents

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吕楚君
陈磊
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Abstract

本发明公开了一种红曲菌利用麦糟产降脂成分Monacolin K的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明利用红曲菌固态发酵麦糟产Monacolin K，Monacolin K产量高达8.704mg/g。麦糟作为啤酒酿造过程的主要废弃物，本身是可食用无危害的，将麦糟应用于红曲固态发酵产降脂成分Monacolin K，可以降低红曲产品的生产成本，同时满足了绿色环保和可持续发展的需求，是变废为宝的体现，具有重大的研究意义和经济价值。而且该方法可以推广到白酒、黄酒酿造废弃物酒糟的利用，同样具有较好的经济效益。

Description

一种红曲菌利用麦糟产降脂成分Monacolin K的方法
技术领域
本发明涉及一种红曲菌利用麦糟产降脂成分Monacolin K的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
心脑血管疾病成为人类健康的主要杀手之一，这与人体血液中胆固醇的过多积累有重要关系。Monacolin类物质作为真菌代谢的一种活性物质，是胆固醇合成的关键酶HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂，可有效维持胆固醇处于较低的密度水平。在抑制胆固醇合成方面，Monacolin K属于Monacolin类物质中效果极佳的，但根据现有研究，Monacolin K目前仍以发酵为主要生产方式，但其产率较低。近几年来，心血管疾病的发病率、死亡率已经跃居全球首位，降血脂类药物的需求量越来越大，同时人们对生活质量的要求越来越高，功能食品的需求量大大增高，功能食品行业快速发展，因此，Monacolin K的发酵法生产具有广阔的前景。
红曲菌是药食两用丝状真菌，在我国已有一千多年的使用历史，早在东汉时期已有红曲作为食物的记载，后来的《本草纲目》，《天工开物》，《神农本草经》等著作中已有红曲相关药用价值的记载。这与红曲菌在发酵过程中产生的多种功能活性物质紧密相关，其中最重要的就是具有降胆固醇功效的生理活性物质Monacolin K。
传统的红曲固态发酵主要以大米等谷物作为发酵基质，目前也有许多以农产品废弃物为基质进行红曲固态发酵生产Monacolin K的研究，例如，田洁等以麸皮为基质进行红曲菌固态发酵，得到的Monacolin K含量只有0.043mg/g；许建生等以红曲菌制备麦曲用于黄酒的酿造，为开发具有降脂功能的黄酒提供基础，但是通过含水量、接种量等发酵条件的优化最后仅得到1.252mg/g的Monacolin K含量；刘安军等以豆粕为基质进行红曲菌固态发酵产Monacolin K的研究，Monacolin K的最高含量只达到了0.0325mg/g。这些研究中Monacolin K含量普遍较低。
麦糟是啤酒酿造过程产生的废弃物，麦糟产量约占啤酒产量的四分之一，如果能够有效的再利用，也可获得可观的经济利益。同时，麦糟本身是可食用无危害的，这样的农产品废弃物高附加值利用，可以达到物尽其用的效果。但是麦糟主要包括麦芽的皮壳、叶芽、不溶性蛋白质、脂肪、半纤维素、灰分及少量的未分解淀粉和未洗出的可浸出物。其成分与大米存在很大的区别，使得红曲菌固态发酵麦糟存在很大的难点，如营养成分不足。大米的成本比较高，而麦糟基本没有成本。如果能够实现麦糟废弃物的高附加值利用，将能满足环保和可持续发展的理念。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明将麦糟应用于红曲菌固态发酵产降脂成分Monacolin K，Monacolin K产量高达8.704mg/g，不仅降低红曲产品的生产成本，同时满足了绿色环保和可持续发展的需求，是变废为宝的体现，具有重大的研究意义和经济价值。而且该方法可以推广到白酒、黄酒酿造废弃物酒糟的利用，同样具有较好的经济效益。
本发明的第一个目的是提供一种发酵生产Monacolin K的方法，所述方法是利用红色红曲菌9901固态发酵麦糟生产Monacolin K；所述麦糟初始含水量为45％～65％(m/m)；所述麦糟中添加额外碳源或氮源。
在一种实施方式中，所述麦糟初始含水量优选为45％(m/m)。
在一种实施方式中，所述固态发酵为：在25-35℃条件下培养1-3天，再在20-30℃条件下培养14-29天。
在一种实施方式中，所述额外碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖；所述额外氮源为硫酸铵、硝酸钠、玉米粉、酵母膏或蛋白胨。
在一种实施方式中，所述额外碳源为蔗糖。
在一种实施方式中，所述蔗糖的添加量为2.0-10.0％(m/m)。
在一种实施方式中，所述蔗糖的添加量优选为5％(m/m)。
在一种实施方式中，所述额外氮源为硝酸钠。
在一种实施方式中，所述硝酸钠的添加量为1.0-5.0％(m/m)。
在一种实施方式中，所述硝酸钠的添加量优选为2％(m/m)。
在一种实施方式中，所述麦糟具体为：基质为麦糟，含水量45％～65％(m/m)，硝酸钠1.0-5.0％(m/m)，蔗糖2.0-10.0％(m/m)。
在一种实施方式中，所述麦糟优选为：基质为麦糟，含水量45％(m/m)，硝酸钠2.0％(m/m)，蔗糖5.0％(m/m)。
在一种实施方式中，所述方法是将红色红曲菌9901接种到种子培养基中得到种子液，然后将种子液以5％～25％(v/v)的接种量接种于麦糟中发酵生产Monacolin K。
在一种实施方式中，所述接种量优选为10％(v/v)。
在一种实施方式中，所述种子培养基为(g·L-1)：葡萄糖40-80，鱼粉蛋白胨10-40，硝酸钠1-5，七水硫酸镁0.5-2，磷酸氢二钾0.5-2，玉米粉2-10，pH调至3-8。
本发明还提供所述方法及其制备得到的Monacolin K在药物制备或食品领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用红曲菌固态发酵麦糟产Monacolin K，Monacolin K产量高达8.704mg/g。麦糟作为啤酒酿造过程的主要废弃物，本身是可食用无危害的，将麦糟应用于红曲固态发酵产降脂成分Monacolin K，可以降低红曲产品的生产成本，同时满足了绿色环保和可持续发展的需求，是变废为宝的体现，具有重大的研究意义和经济价值。
附图说明
图1：红曲菌利用麦糟产降脂成分Monacolin K。
具体实施方式
Monacolin K的测定方法：
(1)固态发酵样品的预处理
将红曲菌利用麦糟固态发酵结束的产品放于电热鼓风干燥箱中烘干，用研磨机打碎至粉末状态，将每一份样品的粉末混匀，取0.50g样品于50mL比色管中，用70％乙醇定容至50mL，55℃水浴1h，每20min震荡一次，水浴结束后冷却至室温，用0.45μm滤膜过滤，滤液待用。
(2)液态发酵样品的预处理
取10mL发酵液于50mL比色管中，用70％乙醇定容至50mL，55℃水浴1h，水浴结束后冷却至室温，取上清液经0.45μm滤膜过滤，滤液待用。
(3)液相色谱检测(HPLC检测)
仪器：Waters2487；色谱柱型号：20RBA×SB-C18；流动相：乙腈:水＝55:45(v/v)，磷酸调pH至2.5；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：20-30μL；检测器：紫外检测器；检测波长：238nm；
(4)Monacolin K含量的计算：Monacolin K含量(mg/g)＝c(mg/L)*0.05(L)/0.5(g)
式中：
c：萃取液中Monacolin K浓度(mg/L)；
0.05：50mL转换成(L)；
0.5：0.5g样品质量。
实施例1：不同菌株发酵生产Monacolin K
种子液培养基：葡萄糖60g·L-1，鱼粉蛋白胨25g·L-1，硝酸钠2g·L-1，七水硫酸镁1g·L-1，磷酸氢二钾1g·L-1，玉米粉6g·L-1，pH调至6.0。
发酵培养基：麦糟，50％含水量。
(1)种子液的制备
将红色红曲菌9901(参见姜冰洁的硕士学位论文《红曲菌固态发酵高产MonacolinK的研究》，公开日：2015-12-31，在该论文2.1.1节记载了紫色红曲菌(Monascuspurpureus)9901，后将该菌送中科院鉴定为红色红曲菌(Monascus ruber)，因此写为红色红曲菌9901)，CICC编号为41649，CICC编号为41232的红色红曲菌，CICC编号为41601，CICC编号为5046的紫色红曲菌，CGMCC编号为3.4633，CGMCC编号为3.4647的丛毛红曲菌活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。
(2)发酵培养
将步骤(1)中得到的处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量分别为50％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；然后在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量分别为4.253mg/g，3.125mg/g，1.225mg/g，2.556mg/g，1.514mg/g，0.175mg/g，2.435mg/g。
表1不同红曲菌发酵的结果
实施例2：不同初始含水量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：麦糟，不同初始含水量。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子以体积比10％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，发酵培养基初始含水量分别为45％，50％，55％，60％，65％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d.。发酵结束后测得Monacolin K含量为6.243mg/g，5.149mg/g，4.783mg/g，2.326mg/g，1.904mg/g。
表2不同初始含水量发酵的结果
实施例3：不同接种量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：10g麦糟，45％含水量。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比5％，10％，15％，20％，25％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为50％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。发酵结束后测得Monacolin K含量为4.58mg/g，6.085mg/g，5.248mg/g，4.306mg/g，4.506mg/g。
表3不同接种量发酵的结果
实施例4：添加不同碳源发酵生产Monacolin K
发酵培养基：麦糟，45％含水量，4％含量的不同碳源添加。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为50％，额外添加碳源种类分别为甘油，葡萄糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，添加量为4％(m/m)。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。发酵结束后测得Monacolin K含量为6.755mg/g，6.373mg/g，7.641mg/g，6.968mg/g，6.269mg/g。
表4添加不同碳源发酵的结果
实施例5：不同蔗糖添加量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：麦糟，45％含水量，不同含量的蔗糖添加。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为50％，额外添加碳源种类为蔗糖，添加量分别为2％，3％，4％，5％，6％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为6.223mg/g，6.518mg/g，7.562mg/g，8.131mg/g，7.724mg/g。
表5不同蔗糖添加量发酵的结果
实施例6：添加不同氮源发酵生产Monacolin K
发酵培养基：麦糟，45％含水量，1％含量的不同氮源添加。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为50％，额外添加氮源种类分别为硫酸铵，硝酸钠，玉米粉，酵母膏，蛋白胨，添加量为1％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d.结束后测得Monacolin K含量为6.498mg/g，7.241mg/g，6.683mg/g，6.137mg/g，6.381mg/g。
表6添加不同氮源发酵的结果
实施例7：不同硝酸钠添加量发酵生产Monacolin K
发酵培养基：麦糟，45％含水量，不同含量的硝酸钠添加。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为50％，额外添加氮源种类为硝酸钠，添加量分别为0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为6.361mg/g，7.175mg/g，7.204mg/g，7.334mg/g，7.247mg/g。
表7不同硝酸钠添加量发酵的结果
实施例8：不同培养时间发酵生产Monacolin K
发酵培养基：麦糟，45％含水量，5％蔗糖，2％硝酸钠。
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有15g麦糟的250mL三角瓶中，初始含水量为50％，额外添加5％蔗糖和2％硝酸钠。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，分别发酵培养12d，14d，16d，18d，20d，22d。结束后测得Monacolin K含量为6.469mg/g，7.767mg/g，8.358mg/g，8.704mg/g，8.660mg/g,8.323mg/g。
表8不同发酵培养时间发酵的结果
实施例9：其它废弃物发酵生产Monacolin K
参照实施例1-8的方法，对不同废弃物发酵生产Monacolin K的发酵参数进行优化。测定Monacolin K的最高产量。
(1)红曲菌利用甘蔗渣发酵生产Monacolin K
发酵培养基：甘蔗渣，50％含水量
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g甘蔗渣的250mL三角瓶中，初始含水量为50％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为2.2mg/g。
(2)红曲菌利用玉米芯发酵生产Monacolin K
发酵培养基：玉米芯，50％含水量
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g玉米芯的250mL三角瓶中，初始含水量为50％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为0mg/g。
(3)红曲菌利用麸皮发酵生产Monacolin K
发酵培养基：麸皮，50％含水量
将实施例1中得到的处于对数生长期的红色红曲菌9901液体种子分别以体积比10％的接种量接入装有10g麸皮的250mL三角瓶中，初始含水量为50％。在温度30℃条件下，发酵培养2d；在温度25℃条件下，发酵培养18d。结束后测得Monacolin K含量为1.9mg/g。
表9不同废弃物发酵生产Monacolin K
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种发酵生产Monacolin K的方法，其特征在于，所述方法是利用红色红曲菌9901固态发酵麦糟生产Monacolin K；所述麦糟初始含水量为45％～65％(m/m)；所述麦糟中添加额外碳源或氮源。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述额外碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖；所述额外氮源为硫酸铵、硝酸钠、玉米粉、酵母膏或蛋白胨。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述额外碳源为蔗糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蔗糖的添加量为2.0-10.0％(m/m)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述额外氮源为硝酸钠。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述硝酸钠的添加量为1.0-5.0％(m/m)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述麦糟具体为：基质为麦糟，含水量45％～65％(m/m)，硝酸钠1.0-5.0％(m/m)，蔗糖2.0-10.0％(m/m)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是将红色红曲菌9901接种到种子培养基中得到种子液，然后将种子液以5％～25％(v/v)的接种量接种于麦糟中发酵生产Monacolin K。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为(g·L-1)：葡萄糖40-80，鱼粉蛋白胨10-40，硝酸钠1-5，七水硫酸镁0.5-2，磷酸氢二钾0.5-2，玉米粉2-10，pH调至3-8。
10.权利要求1-9所述方法及其制备得到的Monacolin K在药物制备或食品领域的应用。
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