CN110386890A - 一种基于胱氨酰胺衍生物的载药纳米水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种基于胱氨酰胺衍生物的载药纳米水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医用高分子材料及化学药物技术领域，涉及一种纳米水凝胶微球的制备、其单体胱氨酰胺衍生物的合成。所述的胱氨酰胺衍生物具有式(I)的结构：其中，R1、R2、R3独立地为H、C1‑C4烷基；发明的胱氨酰胺衍生物通过如下方法制备：利用L‑胱氨酸和无水甲醇为原料，制备L‑胱氨酸二甲酯盐酸盐；然后利用丙烯酰氯对L‑胱氨酸二甲酯盐酸盐进行修饰，得到N’N‑双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯；最后，N’N‑双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯与浓氨水或脂肪胺发生氨解反应，得到丙烯酰基胱氨酰胺衍生物。本发明以该衍生物作为单体和交联剂，通过一步蒸馏沉淀聚合制备得到具有较高的载药量和良好的还原敏感性能的纳米水凝胶微球。

Description

一种基于胱氨酰胺衍生物的载药纳米水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于医用高分子材料及化学药物技术领域，涉及一种纳米水凝胶微球的制备、其单体的合成，尤其涉及基于胱氨酰胺衍生物的纳米水凝胶载药体系及其制备方法。
背景技术
纳米水凝胶材料是由内部共价交联的高分子骨架，在水中吸水溶胀均匀的分散在水中而不会溶解在水中，是一种高分子互穿网络体系。在生物医药、化学化工以及电子信息等方面具有巨大的应用价值，因而得到广泛研究。其中，纳米水凝胶材料与生物医药之间的关系最为密切，常被用于新型给药系统的开发。
研究发现，肿瘤细胞中的谷胱甘肽浓度为正常细胞的5～10倍，是血液中谷胱甘肽浓度的上千倍。利用肿瘤细胞内这一特殊环境，可用于细胞内靶向药物释放的还原敏感型药物载体的研究一直备受大家关注。目前，已报道的药物载体有生物可降解高分子微球、基于脂质体的纳米胶束等。尽管与上述材料相比，水凝胶作为通过共价交联制备的药物载体材料更加稳定，且载药后不易产生药物突释现象，然而纳米水凝胶作为还原敏感药物载体的研究并不多。这和可用于制备水凝胶的交联剂种类不多，附有特殊功能的交联剂更为稀少有关。目前用于水凝胶载药材料的还原敏感型交联剂有：胱胺、N,N'-双(丙烯酰)胱胺、3,3’-二硫代二丙酸等。使用上述交联剂制备的纳米水凝胶微球时，可以在还原条件下发生断裂，将包载在纳米水凝胶微球中的药物释放出来。此外，制备水凝胶微球过程中通常需要用到高分子单体和交联剂两种成分。本发明致力于开发一种由单一成分制备而成的生物可降解的新型还原敏感纳米水凝胶药物载体。
胱氨酸作为一种天然氨基酸，分子内含有一个二硫键，是很好的还原敏感分子。因此，在不改变胱氨酸分子中二硫键的条件下对其进行结构修饰，可以得到一系列新型的还原敏感的交联剂材料。目前，在胱氨酸分子结构上进行化学修饰制备交联剂用于还原敏感水凝胶药物载体材料非常稀少。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一种结构新颖的胱氨酰胺衍生物，并以该衍生物作为单体和交联剂，通过一步蒸馏沉淀聚合制备得到具有较高的载药量和还原敏感性的纳米水凝胶微球。所述的胱氨酰胺衍生物是胱氨酸酰胺化后得到的还原敏感分子。
本发明是通过以下方法实现的：
本发明所述的胱氨酰胺衍生物具有式(I)的结构：
其中，
R1、R2、R3独立地为H、C1-C4烷基；
进一步地，
R1、R2、R3独立地为H、甲基或乙基。
本发明的胱氨酰胺类衍生物通过如下方法制备：
首先，利用L-胱氨酸和无水甲醇为原料，回流条件下，制备L-胱氨酸二甲酯盐酸盐；然后利用丙烯酰氯对L-胱氨酸二甲酯盐酸盐进行修饰，得到N’N-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯；最后，在-4～10℃条件下，N’N-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯与浓氨水或脂肪胺发生氨解反应，得到丙烯酰基胱氨酰胺衍生物。
具体地，包括如下步骤：
第一步，以无水甲醇作为反应溶剂，氯化亚砜：L-胱氨酸为1～5:1的摩尔比下，温度控制为40～100℃加热回流进行反应，反应时间为2～8h，得到澄清透明溶液，旋蒸去除溶剂后，用甲醇与石油醚1:1～1:5进行结晶，抽滤得到L-胱氨酸二甲酯盐酸盐。
第二步，称取L-胱氨酸二甲酯盐酸盐溶于无水四氢呋喃中，加入无水三乙胺，冰浴10～35min，向溶液中滴加丙烯酰氯，恢复室温后，继续反应5～12h。然后加入二氯甲烷，分别用水、5％NaCO3、饱和NaCl萃取1～3遍后，加入干燥剂干燥。将上述混合物抽滤取滤液旋蒸，得到白色固体，用丙酮和乙醚重结晶，可制得N’N-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯，其中，L-胱氨酸二甲酯盐酸盐与无水四氢呋喃的重量体积比为(g/mL)：0.1～0.3，丙烯酰氯与无水四氢呋喃的体积比为：0.1～0.5。
第三步，用过量浓氨水将N’N-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯溶解，搅拌6～12h，旋蒸掉有机溶剂后，用甲醇溶解，弃掉不溶物，滤液旋蒸，既可得到丙烯酰基胱氨酰胺衍生物。
本发明还提供了以所述的胱氨酰胺衍生物作为交联剂和聚合单体的纳米水凝胶微球。所述的纳米水凝胶微球采用蒸馏沉淀法制备，其中，胱氨酰胺衍生物既作单体也作交联剂，反应结束后，胱氨酰胺衍生物单体中的双键消失，单体间以自由基聚合的方式连接，从而得到成分组成单一的纳米水凝胶微球。
本发明所述的纳米水凝胶微球采用如下方法制备：
(1)合成丙烯酰基胱氨酰胺衍生物；
(2)将丙烯酰基胱氨酰胺衍生物溶解在有机溶剂中，搅拌完全溶解；
(3)将自由基聚合的引发剂加入到步骤(2)得到的有机溶液中，搅拌溶解；
(4)在合适的温度条件下，搅拌蒸馏反应；
(5)反应结束后，高速离心、弃上清；
(6)对离心后的下层固体进行洗涤、冻干；
(7)将冻干微球干粉加入到一定浓度的药物溶液中，室温下搅拌24h。之后将该溶液进行高速离心，转移上清，洗涤下层载药微球，之后进行冻干。
本发明所述的步骤(1)中胱氨酰胺衍生物的合成如前所述。
本发明所述的步骤(2)中丙烯酰基胱氨酰胺衍生物的重量体积浓度为：0.1mg/ml～200mg/ml；优选为：0.1mg/ml～50mg/ml。
本发明所述的步骤(2)中所选有机溶剂为：甲醇、无水乙醇以及任意比例的甲醇与无水乙醇的混合溶液；其用量只要使丙烯酰基胱氨酰胺衍生物溶解即可。
本发明所述的步骤(3)中所选自由基聚合的引发剂为：偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)；
本发明所述的步骤(3)中所选引发剂的用量在有机溶液中的重量含量为0.15mg/ml～0.75mg/ml；
本发明所述的步骤(4)中所选反应温度为55℃～90℃；
本发明所述的步骤(4)中加热蒸馏的时间为30min～90min；
本发明所述的步骤(5)中离心的转速为7000～15000r/min；
本发明所述的步骤(6)中所选洗涤下层固体的溶剂为：水、乙腈、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氯化碳、1.4-二氧六环、乙二醇、环己烷、正己烷；优选为：乙醇。
本发明所述的步骤(7)中所述的药物包括抗肿瘤药、抗菌药、抗炎药等，所述的抗肿瘤药物包括：紫杉醇、阿霉素、伊立替康等，所述的抗菌药包括：苯酰甲硝唑、头孢呋辛钠、利福平等，所述的抗炎药包括，地塞米松、氯霉素等。本发明中优选紫杉醇作为胱氨酰胺类纳米水凝胶微球的包载对象；
步骤(7)中所选的药物浓度为0.05mg/ml～10mg/ml,优选为：0.1mg/ml～2mg/ml；
步骤(7)中药物与微球的重量比为20％-200％，优选为60％-80％；
步骤(7)中所选的洗涤下层载药微球，所用溶液为灭菌水、PBS缓冲液。
通过本发明得到的还原敏感载药纳米水凝胶微球粒度在50～2000nm，优选在50～500纳米范围内，载药量可达20％以上，大小可控，稳定性较好。
本发明通过对胱氨酸的羧基进行酰胺化得到一系列胱氨酰胺衍生物，并以此作为原料制备还原敏感的载药纳米水凝胶微球。本发明的制备的纳米水凝胶微球材料的表面及内部电荷为中性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.采用胱氨酰胺类化合物作为聚合单体制备的水凝胶微球，聚合单体简单，可以采用蒸馏沉淀聚合技术、耗时短、无需添加乳化剂或稳定剂、反应温和容易控制，制备工艺十分简单。
2.该纳米水凝胶微球药物载体具有良好的稳定性以及还原敏感性，由于该纳米水凝胶微球是通过共价键交联形成的，所以其稳定性明显高于其他通过分子间作用力自组装制备的微球。此外，由图5可以看出该纳米水凝胶微球在10mM二硫苏糖醇的条件下25min后的降解可达70％，表现出良好的还原敏感性。
3.采用该类单体制备纳米水凝胶微球的内部和表面含有大量的酰胺基团，在水溶液中微球呈现电中性，因此包载药物(紫杉醇等)时可以通过氢键等分子间作用增加药物的载药量；载药量可达15％以上，包封率达45％以上。
附图说明
图1为制备该还原响应纳米水凝胶单体的核磁结果图；
图2为该水凝胶微球与单体的红外谱图结果；
图3为本发明实施例1纳米微球的粒径分布图；
图4为本发明实施例1纳米微球扫描电镜图；
图5为该纳米水凝胶在10mM二硫苏糖醇和10mM谷胱甘肽的条件下降解动力学曲线图；
图6为紫杉醇在PBS pH7.4的条件下释放行为曲线图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的还原敏感型纳米水凝胶进行详细描述。
实施例1
量取150mL无水甲醇于250mL圆底烧瓶中，缓慢滴加SOCl2(8.0mL，108mmol)，然后分批加入10g的L-胱氨酸于反应液中。恢复室温后，60℃条件下回流5h，反应结束后蒸出溶剂，用甲醇与石油醚1:1结晶得到L-胱氨酸二甲酯盐酸盐白色固体。
称取L-胱氨酸二甲酯盐酸盐6.0g溶于50ml无水THF中，加入8.0ml无水Et3N，冰浴20min。向溶液中滴加丙烯酰氯5ml，恢复室温后继续反应6h。反应结束后加入100ml CH2Cl2。然后分别用水、5％的NaHCO3、饱和NaCl溶液萃取洗涤两遍。取有机相向其中加入3.0g无水Na2SO4干燥，静置40min后过滤，蒸除溶剂，得到粗品。然后用丙酮与乙醚1∶1结晶得到N,N'-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯单体。将0.94g N,N'-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯单体溶于7.5ml氨水中，加入搅拌子，于0℃下搅拌6h，旋蒸出溶剂，将其在50℃下真空干燥过夜，可得粗产品。将粗品溶于甲醇，抽滤得滤液，旋蒸后，真空干燥即可得到N,N'-双(丙烯酰)胱氨酰胺单体，结构为
其核磁结果参见图1。
称取N,N'-双(丙烯酰基)胱氨酰胺单体(100mg,0.267mmol)于40ml无水乙醇中，加入引发剂AIBN(15mg,0.09mmol)，超声10min。使用水浴锅进行加热，20min分钟左右水温从室温加热到80℃，继续反应30min后，停止反应。恢复室温后，将上述溶液转移至15ml离心管中，然后高速离心8000r/min，10min。转移上清，加入无水乙醇，超声分散30min，然后高速离心8000r/min,10min，转移上清，再加入无水乙醇，超声分散30min，得混浊溶液，冻干后，得到白色水凝胶微球。微球与单体的红外对比结果见附图2。
称取紫杉醇3mg于5ml无水乙醇中溶解，称取冻干水凝胶微球5mg溶于上述溶液中，超声分散10min，避光室温下搅拌24h。将上述溶液转移至1.5ml离心管中，每个离心管1.0ml溶液。然后高速离心12000r/min，10min，转移上清，加入1.0ml PBS缓冲液，超声分散30min，重复洗涤三次。收集上清液，用UV检测游离的紫杉醇的浓度。下层固体冻干后即为制备的载药纳米水凝胶微球，其载药量为15.42％，包封率为30.40％。
用马尔文激光粒度仪和扫描电镜对所得到的纳米微球进行测试表征，其动态光散射平均为300nm，扫描电镜的平均粒径在500nm左右，结果参见图3和图4。
实施例2
称取紫杉醇1mg于5ml无水乙醇中溶解，称取冻干水凝胶微球5mg溶于上述溶液，超声分散10min，避光室温下搅拌24h。将上述溶液转移至1.5ml离心管中，每个离心管1.0ml溶液。然后高速离心12000r/min，10min，转移上清，加入1.0ml PBS缓冲液，超声分散30min，重复洗涤三次。收集上清液，用UV检测游离的紫杉醇的浓度。下层固体冻干后即为制备的载药纳米水凝胶微球。本实施例制备的纳米微球药物载体，其载药量为1.28％，包封率为6.49％。
实施例3
称取紫杉醇2mg于5ml无水乙醇中溶解，称取冻干水凝胶微球5mg溶于上述溶液中，超声分散10min，避光室温下搅拌24h。将上述溶液转移至1.5ml离心管中，每个离心管1.0ml溶液。然后高速离心12000r/min，10min，转移上清，加入1.0ml PBS缓冲液，超声分散30min，重复洗涤三次。收集上清液，用UV检测游离的紫杉醇的浓度。下层固体冻干后即为制备的载药纳米水凝胶微球。本实施例制备的纳米微球药物载体，其载药量为8.61％，包封率为23.55％。
实施例4
称取紫杉醇3mg于5ml无水乙醇中溶解，称取冻干水凝胶微球5mg溶于上述溶液中，超声分散10min，避光室温下搅拌24h。将上述溶液转移至1.5ml离心管中，每个离心管1.0ml溶液。然后高速离心12000r/min，10min，转移上清，加入1.0ml PBS缓冲液，超声分散30min，重复洗涤三次。收集上清液，用UV检测游离的紫杉醇的浓度。下层固体冻干后即为制备的载药纳米水凝胶微球。本实施例制备的纳米微球药物载体，其载药量为15.42％，包封率为30.40％。
实施例5
称取紫杉醇4mg于5ml无水乙醇中溶解，称取冻干水凝胶微球5mg溶于上述溶液中，超声分散10min，避光室温下搅拌24h。将上述溶液转移至1.5ml离心管中，每个离心管1.0ml溶液。然后高速离心12000r/min，10min，转移上清，加入1.0ml PBS缓冲液，超声分散30min，重复洗涤三次。收集上清液，用UV检测游离的紫杉醇的浓度。下层固体冻干后即为制备的载药纳米水凝胶微球。本实施例制备的纳米微球药物载体，其载药量为24.81％，包封率为41.06％。
实施例6
称取紫杉醇5mg于5ml无水乙醇中溶解，称取冻干水凝胶微球5mg溶于上述溶液中，超声分散10min，避光室温下搅拌24h。将上述溶液转移至1.5ml离心管中，每个离心管1.0ml溶液。然后高速离心12000r/min，10min，转移上清，加入1.0ml PBS缓冲液，超声分散30min，重复洗涤三次。收集上清液，用UV检测游离的紫杉醇的浓度。下层固体冻干后即为制备的载药纳米水凝胶微球。本实施例制备的纳米微球药物载体，其载药量为11.32％，包封率为12.76％。
实验结果表明，制备纳米微球时，微球与紫杉醇药物的用量比例不同，其载药量与包封率均不同。结果如下：
药物：微球(mg/mg) 载药量(％) 包封率(％)
20％ 1.28±0.01 6.49±0.04
40％ 8.61±0.07 23.55±0.22
60％ 15.42±0.53 30.40±1.21
80％ 24.81±0.07 41.06±0.15
100％ 11.32±0.10 12.76±0.12
实施例7
称取4.0mg冻干的胱氨酸纳米水凝胶微球(实施例1)于30mL西林瓶中，量取10mL磷酸盐缓冲液(pH7.4 PBS)于上述西林瓶中，超声分散10min，将水凝胶微球均匀的分散在溶液中。然后向加入溶液中加入还原剂(DTT or GSH，10mM)，超声分散1min，然后置于37℃水浴恒温震荡器中，分别在预设时间点取样100μL，使用紫外-可见分光光度计检测其在波长630nm处的透光率。
本实施例制得的还原纳米水凝胶微球的还原降解动力学见附图5。由附图可以看出该纳米水凝胶微球在10mM二硫苏糖醇的条件下25min后的降解可达70％，表现出良好的还原敏感性。
实施例8
称取实施例4中的载药纳米水凝胶微球(载药量为24.81％)3mg，分散在3mL(pH7.4PBS)缓冲溶液中，超声分散10min，转移至截留分子量为3500透析袋中。然后将透析袋放入含有100mL(pH 7.4PBS)缓冲溶液的烧杯中，随后向溶液中加入还原剂(DTT or GSH，10mM)，然后用保鲜膜将烧杯封口置于37℃恒温水浴震荡器中。开始计时，并在预设时间点取样60μL，同时补加60μL缓冲溶液。使用紫外分光光度计UV-2700检测溶液在λ227nm波长处的吸光度值A。根据紫杉醇标准曲线计算释放的药量。
本实施例制得的还原纳米载药水凝胶微球的释药效果见附图6。载药水凝胶微球在10mM谷胱甘肽和10mM二硫苏糖醇的PBS pH＝7.4溶液中24h累计释药分别为.87.6％和90.2％。

Claims (10)

1.式(I)所示的胱氨酰胺衍生物，
其中，
R1、R2、R3独立地为H、C1-C4烷基；。
2.权利要求1所述的胱氨酰胺衍生物，
其中，
R1、R2、R3独立地为H、甲基或乙基。
3.如权利要求1或2所述的胱氨酰胺衍生物的制备方法，其特征在于，首先以L-胱氨酸和无水甲醇为原料，回流条件下，制备L-胱氨酸二甲酯盐酸盐；然后利用丙烯酰氯对L-胱氨酸二甲酯盐酸盐进行修饰，得到N’N-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯；最后，在-4～10℃条件下，N’N-双(丙烯酰)胱氨酸二甲酯与氨水或脂肪胺反应，即得。
4.一种纳米水凝胶微球，其特征在于，以权利要求1或2所述的胱氨酰胺衍生物作为交联剂和聚合单体，采用蒸馏沉淀法制备。
5.如权利要求4所述的纳米水凝胶微球，其特征在于，包含如下步骤：
(1)如权利要求3所述方法合成丙烯酰基胱氨酰胺衍生物；
(2)将丙烯酰基胱氨酰胺衍生物溶解在有机溶剂中，搅拌完全溶解；
(3)将自由基聚合的引发剂加入到步骤(2)得到的有机溶液中，搅拌溶解；
(4)在合适的温度条件下，搅拌蒸馏反应；
(5)反应结束后，高速离心、弃上清；
(6)对离心后的下层固体进行洗涤、冻干；
(7)将冻干微球干粉加入到一定浓度的药物溶液中，室温下搅拌24h,之后将该溶液进行高速离心，转移上清，洗涤下层载药微球，之后进行冻干。
6.如权利要求5所述的纳米水凝胶微球，其特征在于，
步骤(2)中丙烯酰基胱氨酰胺衍生物的重量体积浓度为：0.1mg/mL～200mg/mL；优选为：0.1mg/mL～50mg/mL；有机溶剂为甲醇、无水乙醇以及任意比例的甲醇与无水乙醇的混合溶液。
7.如权利要求5所述的纳米水凝胶微球，其特征在于，
步骤(3)中所选自由基聚合的引发剂为：偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)；所选引发剂的用量在有机溶液中的含量为0.15mg/ml～0.75mg/ml。
8.如权利要求5所述的纳米水凝胶微球，其特征在于，
步骤(4)中所选反应温度为55℃～90℃；加热蒸馏的时间为30min～90min；步骤(5)中离心的转速为7000～15000r/min；步骤(6)中所选洗涤下层固体的溶剂为：水、乙腈、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氯化碳、1.4-二氧六环、乙二醇、环己烷、正己烷。
9.如权利要求5所述的纳米水凝胶微球，其特征在于，
步骤(7)中所述的药物包括抗肿瘤药、抗菌药、抗炎药，中的一种或几种，其中优选紫杉醇作为包载药物；药物浓度为0.05mg/mL～10mg/mL,优选为：0.1mg/mL～2mg/mL；药物与微球的重量比为20％-200％，优选为60％-80％。
10.权利要求1或2所述的胱氨酰胺衍生物在制备纳米水凝胶微球中的应用。
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