CN110381968A

CN110381968A - 包含肝细胞的共培养物的组合物和方法

Info

Publication number: CN110381968A
Application number: CN201880018300.9A
Authority: CN
Inventors: 玛莎·林恩·罗奇; 理查德·哈罗德·马拉瓦卡; 希洛·杰西·巴菲尔德
Original assignee: Nixon Biological Products
Current assignee: Nixon Biological Products
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2019-10-25
Also published as: US20200010806A1; AU2018214822A1; CA3053146A1; AU2022275422A1; EP3595686A4; IL268303A; KR20190113854A; EP3595686A1; JP2020505076A; WO2018144284A1

Abstract

本发明提供了用于在生长停滞的基质细胞的存在下共培养肝细胞的方法和组合物，其导致将肝细胞功能和表型维持包含至少30天的延长的培养时间。

Description

包含肝细胞的共培养物的组合物和方法

技术领域

本发明涉及体外共培养系统，该系统将哺乳动物原代肝细胞与哺乳动物肝脏非实质基质细胞进行组合，该基质细胞生长停滞在支持或维持分离的肝细胞的寿命和功能性的数量中；以及涉及使用该共培养系统来确定药剂对细胞共培养模型系统中的细胞的活性或作用的方法。

背景技术

代谢在整个身体中发生，但最集中于哺乳动物肝脏，主要通过被称为肝细胞的上皮实质细胞。制药产业历史上已经单独地使用动物和人类肝细胞的悬浮或单层培养物作为用于药物代谢与药物动力学（DMPK）的金标准，DMPK包括吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）试验和病毒学的病毒感染性。最近，已经开发了动物来源的支持细胞（饲养细胞）和人类肝细胞的共培养物。尽管这是该行业当前的技术水平，但它不是最佳的，因为肝细胞毒性仍然是后期临床试验中药物撤回的最常见原因。因此，在药物进入临床试验之前，需要具有更好地支持肝毒性的预测的体外模型。每一个撤回都转换成对医药产业的数以亿计的或接近十亿美元的损失。这主要是由于当前可用的用原代动物或人类肝细胞实施的试验并不总是预测药物在人类对象中的性能。

肝细胞构成了肝脏质量的约80%，并且分离自供体肝脏，该供体肝脏是被移植排斥的或来自手术的切除（也称为切除术）。使肝脏经受酶消化，随后从非实质基质细胞中分离肝细胞，以获得相对纯的肝细胞群体。如果与肝细胞一起留下，则基质细胞将使培养物过度生长，导致肝细胞的死亡。因此，历来在肝细胞的分离之后会将剩余的基质细胞丢弃。因为肝脏功能随年龄而下降，所以成熟功能的高质量肝细胞的来源是有限的。使用冷冻保存的成单层培养物的肝细胞的限制为：平均仅10-15%的所有处理过的肝脏产生分离的肝细胞，该肝细胞可铺板至该细胞可以在培养物中维持其自身超过10天的程度。这迫使许多研究使用缺乏最优功能性的悬浮液或培养物中的细胞来实施。培养物中的肝细胞寿命对于最佳的可铺板（plateable）批次（lot）通常是仅3-7天，对于边缘的可铺板批次通常是1-2天，如果有细胞外基质覆盖物则多几天，而对于不可铺板的悬浮液批次则当天进行试验。尽管在该产业中这是金标准，但它达不到所需，这也是为什么FDA发起了寻找用于肝细胞维持和功能的更好的体外模型的倡议。其他的涉及肝细胞的共培养物通常具有缺点（例如，被培养的肝细胞具有有限的生存力和次优的功能中的一种或多种），该缺点限制它们用于在对一种或多种肝功能和肝毒性建模中的广泛应用。

发明内容

本发明提供体外共培养系统，其中肝细胞功能和表型中的一种或多种在体外培养物中维持了延长的时间。该共培养系统可以用于确定药剂对共培养系统中的细胞的活性或作用（“活性”）。在一方面，确定的是药剂对共培养系统中的肝细胞的活性。

在另一方面，本发明提供包含饲养细胞（feeder cell）和肝细胞的体外共培养系统，其中饲养细胞和肝细胞是同种异体的（例如，饲养细胞和肝细胞分离自相同的种类（species）），并且饲养细胞包含生长停滞（growth-arrested）的细胞。

在另一方面，本发明提供体外共培养系统，该系统包含：包含基质细胞的饲养细胞，以及肝细胞；其中饲养细胞和肝细胞是同种异体的，并且其中饲养细胞包含生长停滞的细胞。在进一步的方面，饲养细胞和肝细胞是人类来源的。

在另一方面，本发明提供体外共培养系统，该系统包含：包含生长停滞的肝脏非实质基质细胞的饲养细胞，以及肝细胞；其中饲养细胞和肝细胞是同种异体的并且是哺乳动物来源的。在进一步的方面，饲养细胞和肝细胞是人类来源的。

在另一方面，本发明提供体外共培养系统，该系统包含饲养细胞和肝细胞，其中饲养细胞和肝细胞是同种异体的；其中饲养细胞包含生长停滞的基质细胞；并且进一步包含一种或多种额外的细胞群体或亚群体（例如免疫细胞、内皮细胞、肝脏前体细胞等）。在进一步的方面，饲养细胞和肝细胞是人类来源的（例如分离自人类），并且所述一种或多种额外的细胞群体是以下来源的，该来源选自人类来源、或动物（即哺乳动物）来源，但是该动物来源已经如本领域技术人员已知地被基因修饰来模仿人类细胞（“人源化”）。

在另一方面，该体外共培养系统进一步包含用于三维培养的结构，该结构包含：用于培养的基质或支架；在共培养系统中的基质的和/或细胞的微图形化（micropatterning）；含有以下组份的生物打印支架，该组份选自细胞、组织组份、人工组织构建体或其组合；含有用于在该系统中进行共培养的细胞的球状体。该结构可进一步包含如本领域技术人员已知的用于流体流动的通道（例如，生物芯片中的微流体的通道）。

在另一方面，本发明提供了用于肝细胞的培养的方法，其包含在体外（in vitro）或离体（ex vivo）培养系统中使肝细胞与饲养细胞接触；其中饲养细胞和肝细胞是同种异体的；其中饲养细胞包含生长停滞的基质细胞；其中该培养系统包含用于细胞接触的基质，以及用于维持培养系统中的细胞的生存力和功能的细胞培养基；并且其中在足以促进培养系统中的细胞的生存力和功能的条件下孵育培养系统中的细胞。肝细胞可以包含新鲜分离的肝细胞或冷冻保存的肝细胞。基质细胞可以包含新鲜分离的基质细胞或冷冻保存的基质细胞，并且基质细胞可以包含肝脏非实质基质细胞。在冷冻保存之前、或在冷冻保存之后并在解冻过程中或在解冻之后，可以将基质细胞处理成生长停滞的。该方法可以进一步包含向培养系统加入除了肝细胞和基质细胞之外的一种或多种细胞类型、群体或亚群体。该方法可以进一步包含细胞培养系统，该培养系统包含用于三维培养的结构。该方法可以进一步包含对来自该培养物的或在其中的一种或多种细胞的标记物进行评估。

在另一方面，本发明提供使用体外共培养系统来确定药剂对该共培养系统中的细胞的活性的方法，该方法包含将药剂引入共培养系统中，并且然后测量或评估共培养系统中含有的一种或多种细胞类型的功能、代谢活性、表型、基因表达活性、形态学、或其组合中的一种或多种的标记物。在进一步的方面，对肝细胞的标记物进行评估，或者可以对饲养细胞的标记物进行评估，或者可以对一种或多种额外的细胞群体或亚群体的标记物进行评估，或其组合。基于药剂和评估药剂的活性的目的，可以在使用共培养系统的期间加入试剂超过一次。类似地，在共培养的期间，药剂的活性的评估可以发生超过一次。

在另一方面，本发明提供包含分离的、生长停滞的基质细胞的组合物，其用于与肝细胞共培养，产生经培养的肝细胞，例如与新鲜分离的原代肝细胞相比，该经培养的肝细胞在培养物中维持肝细胞特性（例如功能、表型、基因表达、形态学以及生存力中的一种或多种）至少30天，通常至少40天。在另一方面，该基质细胞包含肝脏非实质基质细胞。该基质细胞也可以分离自与将与该基质细胞共培养的肝细胞所分离自的相同的种类。在进一步的方面，该基质细胞是人类来源的。在另一方面，该组合物包含冷冻保存的、分离的、生长停滞的基质细胞。

本发明的另一方面提供了试剂盒，该试剂盒包含：包含分离的基质细胞的组合物，以及包含分离的肝细胞的组合物，其中基质细胞和肝细胞分离自相同的哺乳动物种类。在进一步的方面，基质细胞和肝细胞分离自人类。包含分离的基质细胞的试剂盒组合物可以包含生长停滞的基质细胞，替代地，试剂盒组合物可以包含分离的基质细胞，并且试剂盒可以进一步包含含有用于基质细胞的生长停滞的化学制剂或分子的组合物，试剂盒的使用者可以使用其来处理基质细胞，以产生生长停滞的基质细胞。在试剂盒中的分离的基质细胞可以包含冷冻保存的基质细胞。在试剂盒中的分离的基质细胞可以包含肝脏非实质基质细胞。包含分离的肝细胞的组合物可以包含冷冻保存的肝细胞。该肝细胞可以是人类细胞。试剂盒可以进一步包含一种或多种组合物，该组合物包含除肝细胞和基质细胞之外的细胞类型、群体或亚群体。该试剂盒可进一步包含用于培养细胞的试剂（例如细胞培养基、或营养组分）、以及用于保存该组合物的包装。该试剂盒可进一步包含被期望用于表征来自该试剂盒的细胞以及随后共培养的试剂中的一种或多种。

附图说明

图1为示出在成年人类肝细胞（“成年人”）和新生儿肝细胞（“新生儿”）中的基础细胞色素p450 CYP3A4活性的图，每一种肝细胞都单独铺板（“单独”）或与生长停滞的成年人类非实质基质细胞共培养（“Hep/Strom”）。

图2是示出在成年人类肝细胞（“成年人”）和新生儿肝细胞（“新生儿”）中的基础细胞色素p450 CYP3A4活性的图，将每一种肝细胞都铺板成与人类生长停滞的非实质基质细胞共培养在体外超过42天。

图3示出的多个图代表了成年人类肝细胞（“成年人”）和新生儿肝细胞（“新生儿”）与人类生长停滞的非实质基质细胞共培养，并在体外铺板后的第22、29、36 和 43天在用利福平诱导（图3A-D）或用酮康唑抑制（图3E-H）之后测量细胞色素p450 CYP3A4活性。

图4示出了将人类成年肝细胞铺板成与生长停滞的非实质基质细胞共培养，并且在体外培养的43天内对包括形态学和胆小管形成的肝细胞特性进行评估的显微照片。

图5示出了将人类新生儿肝脏细胞铺板成与生长停滞的非实质基质细胞共培养，并且在培养的43天内对包括形态学和胆小管形成的肝细胞特性进行评估的显微照片。

图6示出了人类成年肝细胞或新生儿肝细胞或生长停滞的基质细胞作为单层培养物进行铺板，并且在第10天在培养物中对生存力、或形成小管的能力进行评估的显微照片。

发明详述

本发明描述了人类肝细胞/人类肝脏基质细胞共培养系统，该系统导致在培养开始超过40 天在体外培养物中维持肝细胞的特性，共培养的肝细胞展示了经受药物诱导和抑制研究、药物代谢和细胞色素P450活性以及到胆小管中的功能化转运的能力。在该共培养系统中，生长停滞的基质细胞提供了培育肝细胞所必需的可溶性因子、细胞外基质和细胞-细胞相互作用，从而使得培养物中的肝细胞的长寿命以及在体外共培养系统中进行低剂量长期研究的能力成为可能，而这目前使用常规肝细胞培养物不能完成。该共培养系统也使以前不能用于肝细胞研究的代谢活性低的肝细胞的供体批次的应用，现在具有在以前不可能的价值、延伸的效用和应用。

在一方面，在用于共培养系统之前，使用产业中标准的方法，将被用于共培养系统中的或作为用于共培养系统的试剂盒中的组分的肝细胞，从肝脏中分离，冷冻保存，然后储存于液氮冷冻柜中。非实质基质细胞也分离自肝脏，在支持基质细胞群体中的所有细胞类型的增殖的培养基中生长培养，随后冷冻保存，并且在用于培养系统之前储存于液氮冷冻柜中。在冷冻保存之前基质细胞可以是生长停滞的，或在冷冻保存之后解冻然后使用本领域已知的方法使其生长停滞。可以随着肝细胞的解冻，同时解冻生长停滞的基质细胞，以用于共培养。在将肝细胞加入到共培养系统之前，可以首先将生长停滞的基质细胞加入到共培养系统中。替代地，生长停滞的基质细胞可以与适合于接种肝细胞培养物的细胞培养基（这样的培养基是本领域技术人员已知的并且商业上可获得）中的肝细胞组合，最佳地，以一系列的比例将生长停滞的基质细胞与肝细胞组合，该比例可为培养物中的肝细胞提供最佳支持，以维持肝细胞特性。用于引入共培养系统的肝细胞与生长停滞的基质细胞的比例可以是约1：1、1：2、1：3、1：4、1：5或1：至大于5。基质或结构（例如组织培养板、微量滴定板、生物芯片等）可以包被有促进细胞粘附的包被材料（“粘附材料”例如蛋白质、糖蛋白、脂质、碳水化合物、胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶、透明质酸、聚胺、等离子蚀刻的聚合物表面、由脱细胞肝组织组成的生物基质或其组合）。然后将共培养系统孵育在足以维持肝细胞功能（例如生存力和功能）的条件（例如，37℃，5至6％CO₂）下。该共培养系统允许肝细胞受益于基质细胞的存在以及与其的接触，并且防止基质细胞使共培养的肝细胞过度生长而损害肝细胞。由于共培养系统，所以肝细胞在体外被培养超过40天，同时维持了肝细胞的特性，例如在药物代谢与药代动力学（DMPK）试验中保持生理功能，该试验包括吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）、病毒学、药物-药物相互作用试验、诱导和抑制试验。此外，使用此共培养系统，来自未成熟供体（胎儿、新生儿小儿和青少年）的肝细胞在肝脏代谢和转运活动中达到成熟的生理功能，并在铺板后（在共培养开始后）超过40天在体外维持此功能。此外，由于该共培养系统中肝细胞的长寿命，所以肝细胞可被例如A、B或C型的肝炎病毒感染，并且受感染的肝细胞将开始产生病毒粒子，使该共培养系统能够用于筛选抗病毒药剂。同样，由于该共培养系统中肝细胞的长寿命，所以在共培养的40+天的过程中肝细胞在相同细胞的重复试验中保持功能，这使得能够在相同的细胞群体中随着时间测量代谢和转运活性，证明了在相同细胞的重复试验中经历药物诱导和抑制研究、药物代谢和细胞色素P450活性以及到胆小管中功能转运的能力。该共培养系统概括了肝脏的天然环境的各个方面，并且可以展现出肝脏功能或肝细胞的特性，包括：蛋白质合成；尿素的形成；血清白蛋白、凝血因子、酶和许多其他蛋白质的产生；胆红素代谢过程中胆汁的形成和排泄；脂质合成和血浆脂蛋白的分泌；碳水化合物稳态的调节；胆固醇代谢的控制；营养素维生素矿物质的储存；以及药物和其他外来物质的新陈代谢或解毒。因此，该共培养系统扩展了可以用体外或离体肝细胞进行的试验和研究的类型。

定义 - 尽管可以认为生物技术领域的普通技术人员很好地理解以下的术语，但以下定义仍被阐明以便于解释本发明。

术语“肝脏非实质基质细胞”是指从哺乳动物肝脏中分离的非实质细胞。该非实质细胞包含多种细胞类型、群体和亚群体的组合，包括但不限于免疫细胞、内皮细胞、间质细胞、库普弗细胞（Kupffer cell）、星状细胞和成纤维细胞。可以使用本领域技术人员已知的任何方法，包括但不限于实施例1中所示的方法，从肝脏中将非实质基质细胞分离。

可以被加入至肝细胞和生长停滞的基质细胞的共培养物的术语“额外的细胞类型、群体或亚群体”，在本文中用于表示中性粒细胞、胆管细胞、肝脏前体细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、免疫细胞、成纤维细胞、脂肪细胞或其他细胞中的一种或多种，尤其是当试图代表共培养系统中肝脏的病理状态时。肝细胞与额外的细胞类型、群体和亚群体的比例将根据待被加入的额外细胞而变化，但可以在1：0.5至1：0.005的范围内变化）。

当在本文中用于指基质细胞或肝脏非实质基质细胞时，术语“生长停滞”是指与未用生长抑制剂处理的细胞相比，用能够抑制这种被处理细胞的生长同时仍然保存该被处理细胞的实质性生存力和功能的分子或组合物处理之后的这种细胞。分子或组合物的说明性的例子是本领域技术人员已知的，并且可包括但不限于丝裂霉素C（mitomycin C）、曲古菌素A（trichostatin A）、秋水仙碱、埃博霉素B（Epothilone B）、MPC6827、Pladienolide B、diadzein、Plumbagin和CPI203。

术语“药剂”在本文中用于指评估其对共培养系统中的细胞的活性（并且特别是对肝细胞的作用）的物质、组合物或生物体，是指激素、感染性药剂（例如感染肝细胞的病毒，包括但不限于A型肝炎病毒、B型肝炎病毒和C型肝炎病毒、任何可以感染肝脏的病毒）、蛋白质、脂质、脂质体、囊泡、细胞毒素、药物、生物制剂、生长因子、细胞因子、消费产品、纳米粒子、碳水化合物、营养食品、天然产品（一种或多种草药、草药提取物）、营养产品、药物和化学制品中的一种或多种。

术语“维持肝细胞特性”是指维持肝细胞功能。肝细胞功能可包括但不限于以下中的一种或多种：代谢和转运活性、白蛋白分泌、细胞色素P450活性、尿素合成、碳水化合物和脂质代谢、凝血因子的产生、解毒。维持功能可以由共培养物中的肝细胞表示，该肝细胞展示出由新鲜分离的肝细胞所展示的同样测量的肝细胞功能的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。用于测量肝细胞功能的说明性的方法可以通过本领域已知的方法进行，包括代谢试验、转运蛋白试验、免疫试验、聚合酶链式反应（用于测量基因表达）和高内涵成像。

本发明将在以下实施例中进行描述，这些实施例本质上是说明性的。

实施例 1

在此实施例中，阐明了肝脏非实质基质细胞（包括生长停滞的基质细胞）的分离和处理。通过知情同意书获得整体或切除的肝脏，并且使用本领域已知的用于肝脏组织的酶消化的标准方法进行处理，产生肝脏细胞悬浮液。使用胶质的培养基（例如Percoll）将肝脏细胞悬浮液进一步处理用于梯度离心，以分离实质肝细胞。将包含非实质基质细胞（“肝脏基质细胞”）的剩余的细胞悬浮液通过在4℃以500 g离心5分钟来团块化。将所产生的细胞团块重悬于适当的商业上可获得的细胞培养基（例如MSC生长培养基，PhoenixSongs）中，该培养基进一步补充有20 ng/ml表皮生长因子（ECF）和0.1 mM β巯基乙醇，然后将该细胞以每瓶10.0 x10⁶个细胞铺板在T225组织培养瓶中，然后放置在具有6% CO2的湿润的培养箱中。第二天对该肝脏基质细胞进行完全的培养基更换，并且此后在培养中每隔一天进行更换。

当肝脏基质细胞达到85-90%融合度时，用商业上可获得细胞分离试剂（ACCUTASE）分离细胞。例如，将细胞培养基从肝脏基质细胞中移除，并且将15 ml细胞分离试剂在室温加入至在细胞培养瓶中的细胞10-15分钟。然后将被分离的细胞转移到管中，在4℃以500 g离心5分钟。然后将产生的细胞团块重悬在细胞培养基中。如果在该过程中有多个团块，则合并所有的团块到一个细胞混悬液中。然后取一个等份来测定细胞数量和生存力。然后将肝脏基质细胞以3 x 10⁶个细胞/瓶的密度铺板于T255组织培养瓶中，并放回至湿润培养箱。可以重复该过程以进行肝脏基质细胞的连续的扩增和冷冻保存。

在该实施例中，阐明了肝脏细胞的冷冻保存。从合并的被分离的肝脏基质细胞中，移除一个等份来测定细胞数量和生存力。通过在4 ℃以500 g离心5分钟，将合并的细胞混悬液再一次团块化。以9 x 10⁶个细胞/mL的细胞密度将肝脏基质细胞的团块重悬在商业上可用的冻存培养基中，并且等分成每小瓶1 mL用于冷冻保存，作为主库。将冷冻的小瓶储存在液氮冷冻柜中。

在该实施例中，阐明了将肝脏基质细胞处理成生长停滞的。将来自主库的一个小瓶解冻到细胞培养基中，并且通过在4 ℃以500 g离心5分钟以团块化。将团块重悬于细胞培养基中，并且铺板到3个T225培养瓶中，然后将培养瓶转移到37 ℃、6% CO²的湿润培养箱中。当肝脏基质细胞达到85-90%的融合度时，如在此实施例中上文所述地将细胞分离。当将肝脏基质细胞扩增至约5-10 x 10⁸个时，使该肝脏基质细胞生长停滞。例如，当肝脏基质细胞为100%融合时，通过在补充有生长抑制剂（例如10 ug/ml 丝裂霉素C）的细胞培养基中在37℃孵育2小时，使细胞生长停滞。将补充有生长培养基的培养基移除，并且将肝脏基质细胞解离，然后如在此实施例中前文所述地进行冷冻保存。将生长停滞的肝脏基质细胞以5 x10⁶个细胞/mL且每小瓶1 mL进行冷冻保存。将冷冻保存的生长停滞的肝脏基质细胞储存于液氮冷冻柜中。

实施例2

在此实施例中，阐明了用于共培养肝细胞和生长停滞的肝脏基质细胞的组合物和方法。将一个小瓶的冷冻保存的肝细胞解冻到商业上可用的肝细胞恢复培养基中，并且将一个小瓶的生长停滞的肝脏基质细胞解冻到商业上可用的肝细胞铺板培养基（“细胞培养基”）中。将这些细胞悬浮液中的每一个都进行离心（肝细胞以100 g，肝脏基质细胞以500g，均在4 ℃ 5分钟）以将细胞团块化，以移除冷冻保护培养基。将每一种细胞团块都重悬在细胞培养基中。为了进行比较，将新鲜的肝细胞悬浮液以100 g在4 ℃ 5分钟离心以将细胞团块化，以移除运输培养基。将新鲜的肝细胞重悬在细胞培养基中。将肝细胞（新鲜的或冻存的）与生长停滞的肝脏基质细胞悬浮液以最佳的比例（在此示出为1:1的比例）进行组合。然后将合并的肝细胞和生长停滞的肝脏基质细胞以对组织培养板最佳的密度（参见表1）进行铺板，该平板已经包被有粘附材料。可以将合并的肝细胞和生长停滞的肝脏基质细胞的悬浮液铺板到任何形式平板中，该平板已经包被有特定代谢或转运试验所需的所期望的粘附材料。例如，在将合并的肝细胞和生长停滞的肝细胞的群体进行铺板之后的第二天，通过移除细胞培养基并用商业上可获得的用于肝细胞维持的细胞培养基（PhoenixSongs Cat.#: CMM-250或CMM500）将其替换，用完全培养基更换来更新细胞培养基。在细胞保持共培养的期间（40+天），当通过从细胞中移除培养基并且用新鲜的细胞培养基替换其来每日更新细胞培养基时，在共培养中的肝细胞和肝脏基质细胞表现健康且有功能。

表1：用于在1:1的比例的人类肝细胞和人类肝脏基质细胞的铺板密度。

培养皿/培养瓶尺寸	生长面积(cm<sup>2</sup>)	每孔培养基体积（ml）	每孔肝细胞个数	每孔基质细胞个数
					6-孔	9.6	2	1.44 x 10<sup>6</sup>	1.44 x 10<sup>6</sup>
12-孔	3.8	1	5.70 x 10<sup>5</sup>	5.70 x 10<sup>5</sup>
					24-孔	2.0	0.5	3.00 x 10<sup>5</sup>	3.00 x 10<sup>5</sup>
48-孔	1.1	0.2	1.65 x 10<sup>5</sup>	1.65 x 10<sup>5</sup>
					96-孔	.32	0.1	4.80 x 10<sup>4</sup>	4.80 x 10<sup>4</sup>
384-孔	.136	0.05	2.04 x 10<sup>4</sup>	2.04 x 10<sup>4</sup>

实施例 3

在此实施例中阐明的是，共培养肝细胞和生长停滞的肝脏基质细胞的组合物在肝细胞代谢功能上的应用和结果。在胶原I包被的96孔板上的商业上可用的细胞培养基中，将成年人类肝细胞或新生儿肝细胞单独地进行铺板或其与生长停滞的人类非实质基质细胞一起铺板进行共培养，以将传统的肝细胞培养方法与此共培养的方法进行比较。在铺板后的第二天以及此后每天，将培养基移除并用新鲜培养基替换。使用肝细胞的功能性来比较单独铺板的肝细胞和与生长停滞的非实质肝脏基质细胞一起铺板的肝细胞。作为维持肝细胞的特性的代表性量度，测量的是细胞色素P450 CYP3A4活性。将商业上可用的荧光CYP3A4/荧光素-IPA生物化学实验以96-孔的形式用于测量基础细胞色素P450 CYP3A4的基础活性。根据肝细胞的相同处理，将样品单独地铺板，并且将另一样品与生长停滞的人类肝脏基质细胞一起铺板。在铺板后的第1、5、15、19和25天实施试验。在试验的当天，将培养基移除，并用60 µL的含有CYP3A4/荧光素-IPA底物的细胞培养基进行替换，并且将平板放回至湿润的培养箱用于反应以在37℃ 6% CO₂下继续1小时。在孵育之后，将50 µL的反应物转移到白色荧光试验平板中，并且将50 µL 的荧光检测溶液加入如至试验平板的每一个孔中。在黑暗中将反应实施20分钟，然后将平板放置到光度计中。在肝细胞之内的CYP3A4代谢酶将代谢生成荧光的P$50 CYP3A4/荧光素-IPA底物，并且产生荧光素代谢物，该代谢物将在与荧光检测试剂的反应中释放光，这将被光度计检测到。光的量直接与在肝细胞内的CYP3A4活性的量相关。

如图1所示，在体外的25天内，在与生长停滞的人类肝脏基质细胞共培养的人类成年肝细胞中，以及在与生长停滞的人类基质细胞共培养的人类新生儿肝细胞中，维持了CYP3A4基础活性。相反的是，没有与肝脏基质细胞一起培养的人类成年肝细胞和人类新生儿肝细胞示出CYP3A4 基础活性的快速下降，其中对于成年人肝细胞在第5天不能测量到活性，并且在第5天在新生儿肝细胞中仅检测到最小活性（图1）。到第5天，许多没有与肝脏基质细胞一起培养的肝细胞正在死亡。

实施例 4

在此实施例中阐明的是，使用重复试验中的共培养的肝细胞与生长停滞的肝脏基质细胞的组合物以证明肝细胞的功能以及结果。如上文所述地，并以4.8 x 10⁴个细胞/孔的密度将成年人肝细胞和人类新生儿肝细胞进行铺板，与生长停滞的人类肝脏基质细胞共培养。第二天以及此后每天移除培养基，并用新鲜的商业上可获得的细胞培养基替换。如上文所述地对人类肝细胞中的细胞色素P450 CYP3A4活性进行测量。在铺板后42天内在相同的细胞上每日重复试验，以证明与生长停滞的人类基质细胞共培养的人类肝细胞能够在铺板后40天内经受对相同细胞的每日试验，并且维持例如代谢功能的肝细胞特性。例如，在试验的每一天，将培养基移除并用60 µL的含有CYP3A4/荧光素-IPA底物的细胞培养基替换，并且将平板放回至湿润培养箱用于反应以在37℃ 6% CO2下继续1小时。在孵育后，将50 µL的反应物转移到白色荧光试验平板中，并且将50 µL的荧光检测溶液加入至试验平板的每一个孔中。在黑暗中实施反应20分钟，然后将平板放置到光度计中。如图2所示，在与生长停滞的人类肝脏基质细胞共培养的成年人肝细胞和与生长停滞的人类基质细胞共培养的人类新生儿肝细胞中，在重复试验的42天内维持了CPY3A4基础代谢活性。因此，如通过CYP3A4基础活性所测量的，在体外42天的过程内证明了肝细胞特性的维持（例如，维持的是代谢活性）。

实施例 5

在此实施例中阐明的是，使用重复试验中的共培养的肝细胞与生长停滞的肝脏基质细胞的组合物，以证明肝细胞对用于诱导细胞色素P450 CYP3A4活性的化学药剂和用于抑制细胞色素P450 CYP3A4活性的化学药剂的反应。图3A-D中示出了用0、5、10和20 µM浓度的利福平在细胞培养基中诱导细胞色素p450 CYP3A4 24小时，随后在第22天（图3A）、第 29天（图3B ）、第36天（图3C ）和第43天（图3D ）在体外在共培养物中使用荧光试验测量CYP3A4活性的剂量依赖反应。如图3A-D所示，当将接受0 µM利福平的肝细胞的活性与接受5、10或20 µM的利福平的肝细胞的活性进行比较时，在成年人肝细胞中平均诱导了6.5倍的CYP3A4活性，并且在新生儿肝细胞平均诱导了5.75倍的CYP3A4活性。

图3E-H示出了用0、5、10和20 µM浓度的酮康唑在细胞培养基中抑制细胞色素P450CYP3A4 24小时，随后通过在第22天（图3E ）、第29天（图3F ）、第36天（图3G ）和第43天（图3H ）在体外在共培养物中使用荧光试验测量CYP3A4活性的剂量依赖反应。如图3E-H所示，在将酮康唑（5、10或20 µM）施用至肝细胞后，在成年人肝细胞中有平均10倍的CYP3A4活性的抑制，并且在新生儿肝细胞中有平均5.75倍的CYP3A4活性的抑制。因此，在此共培养物中的肝细胞的长寿命和维持，允许肝细胞对外源性药剂的重复的长期测试。

实施例 6

在此实施例中阐明的是，使用重复试验中的共培养的肝细胞和生长停滞的肝脏基质细胞的组合物来证明培养物中的肝细胞转运功能、寿命以及结果。在此实施例中，将成年人类肝细胞和新生儿肝细胞每种都进行铺板，并在胶原I包被的24-孔平板上与生长停滞的人类肝脏基质细胞共培养，并且将相同的细胞每周重复地试验来证明维持了肝细胞特性（包含到胆小管中的功能转运）。将成年人类肝细胞或新生儿肝细胞与生长停滞的肝脏基质细胞共培养，并且与成年人肝细胞或新生儿肝细胞（作为细胞生存力和寿命的对照）或生长停滞的肝脏基质细胞（作为对照，例如证明基质细胞不代谢CDFDA所以没有CDF的转运）进行比较。在试验的当天，移除细胞培养基并用含有5 µM 5（和6）- 羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（CDFDA）的培养基替换，并且然后放到湿润的培养箱中37℃和6% CO₂ 20分钟。在孵育后，用Hanks平衡盐溶液（HBSS）将细胞洗涤3次，以移除保留在培养基中的CDFDA，并且加入新鲜培养基。

在此实施例中，CDFDA扩散到肝细胞中，在其中它在肝细胞内被水解成荧光5（和6）-羧基-2',7'-二氯荧光素（CDF），并且通过MRP2（胆汁酸转运蛋白）从肝细胞转运到胆小管中。为了使在小管中的CDF可视化，用表面荧光Alexa 488滤光片组在显微镜下检查细胞。以100x放大率拍摄显微照片以检测荧光小管，其表明被代谢的CDFDA被水解成CDF并从肝细胞转运到小管中。如图4所示，在第22、29、36和43天的相位显微照片（A、C、E、G）展示的是成年人肝细胞形态，其特征是外观健康的立方形肝细胞，与称为小管的相邻细胞之间的边界明显紧密相连，表明了在展示出的肝脏中实质细胞的形态中这些肝细胞是极化的。在第22、29、36和43天的荧光显微照片（B、D、F、H）展示（见荧光）的是胆小管的发育，其在荧光显微照片的黑色背景中表现为白色荧光标记。如图5所示，在第22、29、36和43天的相位显微照片（A、C、E、G）展示的是新生儿肝细胞在体外成熟为成熟肝细胞形态，其特征是外观健康的立方形肝细胞，与称为小管的相邻细胞之间的边界明显紧密连接，表明在展示出的肝脏中实质细胞的形态中这些肝细胞是极化的，并且在第22、29、36和43天的荧光显微照片（B、D、F、H）展示（见荧光）的是胆小管的发育，该胆小管在荧光显微照片的黑色背景中表现为白色荧光标记。如图6所示，当成年人肝细胞（A）或新生儿肝细胞（C）单独铺板时，它们失去肝细胞形态并呈现更多的间质形态，表明肝细胞经历了上皮至间质的转变，导致肝细胞极性松散，因此肝细胞功能获得单独培养肝细胞的典型特征的间质细胞的运动性。生长停滞的基质细胞（E）保持健康和群集，这是典型的基质形态学。在成年人肝细胞（B）或新生儿肝细胞（D）中没有出现荧光，证明在到铺板后第10天在单独铺板的肝细胞中没有形成荧光小管，并且如缺乏荧光小管所示，单独铺板的肝脏基质细胞（F）不会代谢CDFDA。

Claims

1.一种用于肝细胞的培养的方法，其包含在体外或离体培养系统中使肝细胞与饲养细胞接触；其中所述饲养细胞和肝细胞分离自相同的种类；其中所述饲养细胞包含生长停滞的基质细胞；其中所述培养系统包含用于细胞接触的基质及细胞培养基；并且其中在足以促进所述培养系统中的细胞的生存力和功能的条件下孵育所述培养系统中的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肝细胞是人类细胞，并且所述饲养细胞包含作为人类细胞的肝脏非实质基质细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中被培养在所述培养系统中的所述肝细胞维持肝细胞功能至少30天。

4.一种体外共培养系统，其包含饲养细胞和肝细胞，所述饲养细胞包含生长停滞的肝脏非实质基质细胞；其中所述饲养细胞和肝细胞是人类来源的；其中所述肝细胞与所述饲养细胞接触；并且其中所述共培养系统进一步包含用于细胞接触的基质及细胞培养基。

5.根据权利要求4所述的共培养系统，进一步包含基质，所述基质进一步包含粘附材料。

6.根据权利要求4所述的共培养系统，进一步包含基质，所述基质进一步包含用于三维培养的结构。

7.一种试剂盒，其包含含有分离的基质细胞的组合物以及含有分离的肝细胞的组合物，其中所述基质细胞和肝细胞分离自相同的哺乳动物种类，并且所述基质细胞包含生长停滞的基质细胞。

8.一种试剂盒，其包含：包含肝细胞和生长停滞的基质细胞的组合物，以及包含肝细胞恢复培养基的组合物，以及包含肝细胞铺板培养基的组合物，以及包含肝细胞维持培养基的组合物。