CN110373465A - 一种结直肠癌标记物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种标记物组合及其在制备结直肠癌诊断试剂中的应用和一种结直肠肿瘤的诊断试剂/试剂盒。本发明将血清中的标记物PON1和CEA进行组合，发现其与结直肠癌具有极高的关联度，其灵敏度可以达到92.5～95％，特异性甚至高达100％；对于早期结直肠癌的诊断也具有较高的灵敏度和特异性，其灵敏度可以达到92.3％～94.9％，特异性也可以达到100％，这在临床上是非常难得的，可用于结直肠癌的早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高患者的生存率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种结直肠癌标记物组合及其应用和一种结直肠肿瘤的诊断试剂/试剂盒。
背景技术
全球癌症统计数据预测2018年新发癌症病例1810万，死亡病例960万。结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，我国结直肠癌发病率和死亡率在全部恶性肿瘤中均居第3位，且发病率仍在上升。研究显示对有结直肠癌危险因素的个体进行筛查可以早期诊断癌症，降低死亡率，甚至可以通过发现和切除腺瘤来降低结直肠癌的发病率。美国早在20世纪80年代就开始推广结直肠癌的早期筛查，目前美国结直肠癌患者的5年生存率达到了90％，这说明了开展结直肠癌筛查对于降低发病率和死亡率具有重要的影响。
中国对于结直肠癌的筛查采用二步筛查法，即先初筛确定高危人群，再对高危人群进行诊断性筛查。目前常用于高危人群的筛检方法有粪便潜血检测(FOBT)、病史症状高危因素问卷等，但这些方法的灵敏度较低。结肠镜检查依然是诊断结直肠癌的金标准，优点在于准确、可取活检进行病理学检查。但其存在一系列的缺点，如检查过程中需要注入气体，会使肠内压力增大，易引起穿孔。再次，病人在检查过程中费力，费时，有一定的痛苦。并且检查费用高，较难大规模推广。而粪便潜血等方法不够灵敏和特异，粪便基因检测甲基化的方法价格较高尚未普及，CRC患者确诊时大多已经处于晚期，生存率较低。
目前有多种报道标志物的联合使用对癌症进行筛查，例如Wang等报道标志物组织多肽特异性抗原(Tissue Polypeptide Specific Antigen,TPS)联合CEA，CA199，CA125和CA153来诊断转移性乳腺癌，TPS单独预测的灵敏度为50.0％，联合后灵敏度依然未达到80.0％(W.Wang et al.,The diagnostic value of serum tumor markers CEA,CA199,CA125,CA153,and TPS in metastatic breast cancer.Clinica chimica acta；international journal of clinical chemistry 470,51-55(2017)。另外，Zhang等报道循环CD14+CD204+M2样-单核细胞和血浆透明质酸(hyaluronan,HA)联合CEA、CA153来诊断乳腺癌，M2样-单核细胞单独预测乳腺癌的灵敏度为71.6％，联合后灵敏度为81.5％没有显著提高(B.Zhang et al.,Combination of plasma HA and circulating M2-likemonocytes may serve as a diagnostic marker for breast cancer.Journal ofCancer；8,3522-30(2017)。再例如，Fu等报道血小板分布宽度、纤维蛋白原联合CA153来诊断乳腺癌，联合后虽然特异性从67.4提高到82.9％，但灵敏度从94.5％下降到82.5％(S.Fuet al.,Cancer antigen 15-3,platelet distribution width,and fibrinogen incombination to distinguish breast cancer from benign breast disease in non-conclusive mammography patients.Oncotarget；8,67829-36(2017)。Kuo等报道标志物phospholipid scramblase 1(PLSCR1)联合CEA来诊断结直肠癌，联合后灵敏度从80％提高到85％，没有显著提升(Y.Kuo et al.,Identification of phospholipid scramblase1as a biomarker and determination of its prognostic value for colorectalcancer.Molecular medicine；17,41-47(2011)。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种在检测敏感性高、特异性强的结直肠肿瘤诊断的标记物组合。
本发明的进一步的目的在于提供一种检测敏感性高、特异性强结直肠肿瘤的诊断试剂/试剂盒。
本发明还有一个目的在于提供一种结直肠肿瘤的诊断系统。
一方面，本发明首次提供一种分子标记物组合，该分子标记物组合在血清中的检出量与结直肠肿瘤具有极高的对应关系。其检测结果的敏感性和特异性甚至可以分别达到92.5％以上和100％。
本发明提供的这种特殊的分子标记物组合包括标记物PON1和CEA的组合。
对氧磷酶1(Paraoxonase1，PON1)是可以催化水解磷酸酯键的芳香酯酶，主要由肝脏合成，释放入血。在血液中以HDL为载体，通过与ApoAI紧密结合而发挥作用。脂代谢指标在诊断、选择治疗方案和预后判断中都是重要的参考依据。此酶可以抑制LDL过氧化，同时可以将LDL过氧化产物分解成无毒小分子，从而减弱巨噬细胞中的氧化应激。血浆中PON1的表达水平可能与结直肠癌的发生相关，PON1低表达时LDL过氧化产物增加，产生过剩的ROS，引起与抗氧化防护系统间的失衡，可能导致结直肠癌的发生。癌细胞的代谢与正常细胞有很大差异，这使得血浆中与代谢相关的酶和产物等在肿瘤诊断及开发应用上具有广阔的前景。
本发明其中一个实施例中，所述的结直肠肿瘤诊断标记物组合，还包括标记物CA199和CA125中的一种或两种。
另一方面，本发明提供了所述的结直肠肿瘤诊断标记物组合的检测试剂在制备结直肠肿瘤诊断试剂或者试剂盒中的应用。
某些实施例中，所述检测试剂为检测所述标记物的基因表达量。
某些实施例中，所述检测试剂为检测所述标记物的mRNA表达量。
一些实施例中，所述检测试剂为检测所述标记物蛋白的表达量。
一些实施例中，所述检测试剂为荧光定量PCR染料、荧光定量PCR引物、荧光定量PCR探针、抗体、抗体功能性片段和偶联抗体中的一种或多种。
一些实施例中，所述的试剂盒选自qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒中的一种或多种。
某些实施例中，所述的试剂盒选自ELISA试剂盒。
其中一个实施例中，所述诊断试剂/试剂盒包含标记物组合PON1和CEA的检测试剂。
某些实施例中，所述诊断试剂/试剂盒还包含标记物CA199和CA125中的一种或两种的检测试剂。
其中一个实施例，所述检测试剂为检测所述标记物的基因表达量。
其中一个实施例，所述检测试剂为检测所述标记物的mRNA表达量。
其中一个实施例，所述检测试剂为检测所述标记物蛋白的表达量。
其中一个实施例中，所述检测试剂为荧光定量PCR染料、荧光定量PCR引物、荧光定量PCR探针、抗体、抗体功能性片段和偶联抗体中的一种或多种。
某些实施例中，所述的试剂盒选自qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒中的一种或多种。
其中一个实施例中，所述的试剂盒选自ELISA试剂盒。
还有一方面，本发明提供了一种结直肠肿瘤的诊断系统，所述的诊断系统含有：检测构件：所述的检测构件用以检测标记物组合中各标记物的表达量；结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的标记物组合中各标记物的表达量的结果，输出肿瘤患者疾病结果；所述的标记物组合为标记物PON1和CEA的组合。
一些实施例中，所述的标记物的表达量为基因表达量、mRNA表达量和或蛋白表达量中的一种或多种。
一些实施例中，所述标记物的表达量为蛋白表达量。
作为一种可以选择的实施方式，所述的结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入所述标记物的表达量；分析模块用于根据所述标记物的表达量，分析出肿瘤患者疾病风险结果的可能性；输出模块用于输出分析模块的分析结果。
作为一个可以选择的实施方式，所述的检测构件含有qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、免疫印迹检测装置、流式细胞仪、免疫组化检测装置、ELISA检测装置、电化学发光检测装置中的一种或几种。
作为一种可以选择的实施方式，所述的检测构件为ELISA检测装置。
其中一些实施例中，所述标记物组合中的标记物PON1和CEA表达量的阈值分别为1647.854-1740.402ng/mL和1.84-3ng/mL。
作为一种优选的实施方式，所述标记物组合中的标记物PON1和CEA表达量的阈值分别为1684.524-1723.824ng/mL和1.875-2.03ng/mL。
作为进一步优选的实施方式，所述标记物组合中的标记物PON1和CEA表达量的阈值分别为1689.286-1710.174ng/mL和1.91-1.945ng/mL。
某些实施例中，所述的标记物组合还包括标记物CA199和CA125中的一种或两种。
作为一种可以选择的实施方式，所述标记物组合中的标记物CA199和CA125表达量的阈值分别为15.115-20.54U/mL和10.15-16.4U/mL。
作为一种优选的实施方式，所述标记物组合中的标记物CA199和CA125表达量的阈值分别为18.42-19.7U/mL和10.25-15.95U/mL。
作为一种更为优选的实施方式，所述标记物组合中的标记物CA199和CA125表达量的阈值分别为18.8-19.42U/mL和13.65-15U/mL。
其中一个实施例中，所述的结果判断构件中，当所述标记物组合中任一标记物的表达量高于阈值时，则判断结直肠肿瘤患病为阳性；当所述标记物组合中所有标记物的表达量低于阈值时，则判断结直肠肿瘤患病阴性。
本发明的检测试剂或试剂盒，仅需一次取样，检测出血液中所述标记物组合的各标记物的含量，对于检测结果按照所述方法进行归类：对于普遍的结直肠肿瘤，当检测到所述标记物组合中任一标记物的表达量高于阈值时，则判断结直肠肿瘤患病为阳性，此时的检测灵敏度可以达到92.5～95％；当检测到所述标记物组合中所有标记物的表达量低于阈值时，则判断结直肠肿瘤患病阴性，此时的检测特异性为100％。从而利用本发明的检测试剂或试剂盒，仅需一次取样，能够使得接受身体检查的患者或者健康人的检测结果具有极高准确度，不会出现漏诊或者误诊，无需等待待检结果，再进行确诊。
目前，无论是组织样本还是粪便样本，抑或是本发明中的血清样本，其灵敏度不同的标记物其高低不等，但普遍都偏低。特异性低，则健康人误诊为病患者的概率高，而这将给这些健康者增加极大的心理负担和压力；灵敏度低，则会导致患者漏诊的概率高，这也不利于结直肠癌的及时发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高患者的生存率，降低死亡率。
而本发明首次发现的标记物组合的检测试剂形成的结直肠肿瘤的诊断试剂或试剂盒刚好能够解决所述问题。
即本发明的结直肠肿瘤诊断试剂或者试剂盒同时具有极高的灵敏度和特异性；这在临床上是非常难得的，例如现有技术中，以SEPT9基因甲基化检测筛查结直肠癌，灵敏度为69％，特异性为86％；以粪便SDC2基因甲基化检测可以筛查出81.1％的结直肠癌患者，但价格昂贵。本发明的结直肠肿瘤诊断试剂或者试剂盒因具有极高的灵敏度和特异性，可用于结直肠癌的早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高患者的生存率，降低死亡率，减轻我国的医疗负担具有重大的意义。
某些实施例中，所述诊断所针对的样品为组织、体液或排泄物。
其中一个实施例中，所述组织为肠组织。
某些实施例中，所述体液为血液、细胞外液、组织液、淋巴液、脑脊液或房水。
作为一种优选的实施方式，所述体液为血液。
作为一种更为优选的实施方式，所述体液为血浆。
某些实施例中，所述排泄物为痰、唾液、尿液或粪便。
本发明中，所述的结直肠肿瘤为I、II、III、IV期结直肠癌。
作为一种优选的实施方式，所述结直肠癌为I-II期结直肠癌，即早期结直肠癌。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有以下有益效果：
1、血液学标志物检测有着取样方便、无创的优势，为结直肠癌筛查、诊断、监测和预后判断提供了更快捷的途径。
2、本发明将血清中的标记物PON1和CEA进行组合，发现其与结直肠癌具有极高的关联度，其灵敏度可以达到92.5～95％，特异性甚至高达100％；对于早期结直肠癌的诊断也具有较高的灵敏度和特异性，其灵敏度甚至可以达到92.3％～94.9％，即本发明的结直肠肿瘤诊断试剂或者试剂盒具有极高的灵敏度和特异性；这在临床上是非常难得的，可用于结直肠癌的早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高患者的生存率，降低死亡率，减轻我国的医疗负担具有重大的意义。
附图说明
图1为协同模型中CEA联合PON1的预测CRC的ROC曲线。
图2为协同模型中CEA、CA199、PON1联合预测CRC的ROC曲线。
图3为协同模型中CEA、CA125、PON1联合预测CRC的ROC曲线。
图4为协同模型中PON1联合CEA、CA125、CA199三种肿瘤标志物预测CRC的ROC曲线。
图5为合成模型中CEA联合PON1预测CRC的ROC曲线。
图6为合成模型中CEA、CA199、PON1联合预测CRC的ROC曲线。
图7为合成模型中CEA、CA125、PON1联合预测CRC的ROC曲线。
图8为合成模型中PON1联合CEA、CA125、CA199三种肿瘤标志物预测CRC的ROC曲线。
图9为协同模型中组合PON1/CEA、PON1/CEA/CA199、PON1/CEA/CA125、PON1/CEA/CA125/CA199分别预测早期CRC的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
TP(True Positive)真阳性：预测为阳性，实际也为阳性。
FP(False Positive)假阳性：预测为阳性，实际为阴性。
FN(False Negative)假阴性：预测为阴性，实际为阳性。
TN(True Negative)真阴性：预测为阴性，实际也为阴性。
本发明中，灵敏度同敏感度。
术语“诊断试剂/试剂盒”可以为诊断试剂，也可以为诊断试剂盒。
结直肠癌：Colorectal cancer，CRC。
标记物组合中标记物表达量的阈值：本发明用的标记物组合中标记物的表达量阈值来界定结直肠肿瘤患病与否，即高于既定的阈值，则结直肠肿瘤阳性；低于既定的阈值则结直肠肿瘤阴性。而本发明中出现的阈值，是对应于上述一个实施例中的约登指数而确定的。
协同模型(A/B)：代表“A或B”，其灵敏度表示标志物A或B任何一项标志物检测结果数值高于cutoff值的患者数占全部患者数的百分比；其特异性表示标志物A或B任何一项标志物检测结果低于cutoff值的健康者的数目占全部健康者数目的百分比。
合成模型(A-B)：代表“A和B”，其灵敏度表示标志物A和B检测结果数值同时高于cutoff值的患者数占全部患者数的百分比；其特异性表示标志物A和B检测结果数值同时低于cutoff值的健康者的数目占全部健康者数目的百分比。
约登指数＝灵敏度+特异性-1。
本发明实施例3-7中的临床样本为实施例1中所述的样本。
数据分析
使用R语言对数据进行统计分析。所有数据均不服从正态分布，选择中位数和四分位数表示。用Spearman相关性检验检测各指标在患者和健康对照人群中是否具有显著的统计学差异。组间肿瘤标志物表达差异分析选择Mann-Whitney U检验。为了研究不同肿瘤标志物和PON1的诊断效能，分别绘制ROC曲线来评价其预测能力。
另外，选择约登指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，即最佳概率划分阈值通过约登指数最大的一点确定。根据确定的概率划分阈值，可以计算得出每种联合检测方案在训练组和验证组的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值等。
通过二元Logistic回归分析得到指标联合检测的ROC曲线，对比曲线下面积得到最佳联合检测方案。p<0.05时具有统计学差异。
关于灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值的计算方法如表3所示:
表1灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值的计算方法
标志物的灵敏度计算方法为：检测结果数值高于cutoff值的患者数占全部患者数的百分比。
标志物的特异性计算方法为：检测结果低于cutoff值的健康者的数目占全部健康者数目的百分比。
实施例1样本来源与分析
收集从2018年9月到2018年12月在中山大学附属第六医院诊断为结直肠癌的患者120例(I、II、III、IV期)，均有明确的影像学及病理学检查确诊，全部病理结果由组织活检取得。患者无严重的脏器疾病，且未进行化疗、放疗及手术治疗。从同期健康体检人群中收集90例作为对照，健康对照纳入标准为血常规和生化全套检测结果均无明显异常，无乙肝等传染性疾病。基本信息如表2所示。所有血液样本使用EDTA抗凝管采集，在室温下6小时内完成血浆分离，3000转/分钟离心2分钟，转移血浆于1.7mL EP管中后立即放置于-80℃冰箱内保存备用。
各个肿瘤标志物均在患者治疗前检测，使用化学发光酶免疫分析(CLEIA)的方法测定，所有实验在中山大学附属第六医院检验科完成。
表2结直肠癌患者基本信息
实施例2肿瘤标志物含量测定方法
本发明中PON1的含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，选用商品化试剂盒RayBiotech Human PON1ELISA Kit、Biotek Elx800酶标仪450nm、Biotek Elx50洗板机、移液器、小离心管、去离子水、Sigmaplot分析软件等。CEA、CA125、CA199的含量采用化学发光酶免疫法(CLEIA)于雅培I2000完成检测。
(1)将试剂盒以及样品平衡至室温(18-25℃)；
(2)稀释液使用去离子水稀释5倍备用；
(3)血浆样本稀释40倍备用；
(4)标准品准备:离心标准品小管，然后加入400μL 1×稀释液到标准品小管中，混合均匀后即为50ng/mL的标准品贮存液；吸取40μL标准品贮存液加入含有960μL1×稀释液的离心管内，混匀，标记为STD1；准备8个1.5mL小离心管，分别加入400μL 1×稀释液缓冲液，之后依次标记为STD2、STD3、STD4、STD5、STD6、STD7、STD8、STD9；然后用2000pg/mL的STD1梯度稀释标准品，取200μL 2000pg/mL的STD1加入STD2小管中，混匀后取该管中200μL溶液加入到STD3小管中后混匀，依次配制好STD8，STD9是400μL 1×稀释液即标准品0pg/mL；
(5)洗液稀释：用去离子水将浓缩洗液稀释20倍备用；
(6)离心检测抗体小管，加入100μL 1×稀释液充分溶解，用移液器上下轻轻吹打，然后用1×稀释液稀释80倍后使用；
(7)离心HRP-链霉亲和素，然后用1×稀释液稀释300倍后使用；
(8)已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，在对应的孔加入100μL配制好的标准品及样品，用封板膜封住整块板条，4℃孵育过夜；
(9)将配制好的1×洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条4次，每孔加入300μL洗液；
(10)洗板干净后，每孔加入100μL配制好的检测抗体(生物素标记抗体)，室温孵育1h；
(11)清洗步骤同9；
(12)每孔加入100μL配制好的HRP-链霉亲和素室温孵育45min；
(13)清洗步骤同9；
(14)加入100μL TMB显色液至每孔中，室温避光孵育30min；
(15)加入50μL终止液至每孔，立即在酶标仪450nm读数；
(16)用Sigmaplot 12.0软件计算浓度值。
实施例3肿瘤标志物对结直肠癌的诊断效能测试结果
1、以CEA，CA125，CA199以及PON1为肿瘤标志物，以实施例2的测量方法检测实施例1中样本所得出对应的约登指数和cutoff值见表3。
表3 CEA、CA125、CA199、PON1对应的约登指数最大值和cutoff值
2、指标联合预测CRC的诊断效能
CEA，CA125，CA199，PON1各种联合方案检测实施例1中样本的结直肠癌诊断效能比较。其中，所述数据是针对实施例1中的120个结直肠癌患者和90个健康对照计算得出。
ROC曲线通过Logistic回归得出，其中，自变量为对应的指标，因变量为患癌情况，通过拟合出的回归曲线可以计算出每个个体患癌与否的概率，确定不同的概率划分阈值即可得到预测结果。
最佳概率划分阈值通过约登指数最大的一点确定。根据确定的概率划分阈值，可以计算得出每种联合检测方案在训练组和验证组的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值等。
(1)指标以协同模型(A/B)联合预测CRC的诊断效能
灵敏度计算方法为：任何一项标志物检测结果数值高于cutoff值的患者数占全部患者数的百分比；
特异性计算方法为：任何一项标志物检测结果低于cutoff值的健康者的数目占全部健康者数目的百分比。
ROC曲线见图1、图2、图3、图4，结果见表4。
表4指标以协同模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 | 阳性预测值 | 阴性预测值 |
| PON1/CEA | 0.925 | 0.394 | 0.847 | 0.591 |
| PON1/CEA/CA199 | 0.942 | 0.355 | 0.850 | 0.611 |
| PON1/CEA/CA125 | 0.933 | 0.333 | 0.848 | 0.556 |
| PON1/CEA/CA125/CA199 | 0.950 | 0.333 | 0.919 | 0.769 |
从表4中的实验结果可知，含PON1与CEA协同模型联合预测CRC，其灵敏度可以高达92.5％。
(2)指标以合成模型(A-B)联合预测CRC的诊断效能
1)灵敏度计算方法为：各项标志物检测数值同时高于cutoff值的患者数占全部患者数的百分比；
2)特异性计算方法为：各项标志物检测数值同时低于cutoff值的健康者的数目占全部健康者数目的百分比。
ROC曲线见图5、图6、图7、图8，结果见表5。
表5指标以合成模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 | 阳性预测值 | 阴性预测值 |
| PON1-CEA | 0.600 | 1.000 | 1.000 | 0.652 |
| PON1-CEA-CA199 | 0.167 | 1.000 | 1.000 | 0.474 |
| PON1-CEA-CA125 | 0.200 | 1.000 | 1.000 | 0.484 |
| PON1-CEA-CA125-CA199 | 0.075 | 1.000 | 1.000 | 0.448 |
从表5的实验结果可知，含PON1与CEA的合成模型联合预测CRC，其特异性可以高达100％。
实施例4肿瘤标志物对结直肠癌的诊断效能测试结果
选取的各个指标的cutoff值，如表6所示；除了选取的cutoff值不同，其他的都与与实施例3相同，相应的检测的结果如表7、8所示。
表6 CEA、CA125、CA199、PON1的cutoff值
表7指标协同模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 |
| PON1/CEA | 0.917 | 0.364 |
| PON1/CEA/CA199 | 0.933 | 0.452 |
| PON1/CEA/CA125 | 0.925 | 0.633 |
| PON1/CEA/CA125/CA199 | 0.942 | 0.433 |
表8指标以合成模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 |
| PON1-CEA | 0.592 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA199 | 0.158 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA125 | 0.192 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA125-CA199 | 0.600 | 0.967 |
实施例5肿瘤标志物对结直肠癌的诊断效能测试结果
选取的各个指标的cutoff值，如表9所示；除了选取的cutoff值不同，其他的都与与实施例3相同，相应的检测的结果如表10、11所示。
表9 CEA、CA125、CA199、PON1的cutoff值
表10指标协同模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 |
| PON1/CEA | 0.908 | 0.545 |
| PON1/CEA/CA199 | 0.925 | 0.516 |
| PON1/CEA/CA125 | 0.917 | 0.633 |
| PON1/CEA/CA125/CA199 | 0.933 | 0.533 |
表11指标以合成模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 |
| PON1-CEA | 0.583 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA199 | 0.150 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA125 | 0.183 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA125-CA199 | 0.708 | 0.900 |
实施例6肿瘤标志物对结直肠癌的诊断效能测试结果
选取的各个指标的cutoff值，如表12所示；除了选取的cutoff值不同，其他的都与与实施例3相同，相应的检测的结果如表13、14所示。
表12 CEA、CA125、CA199、PON1的cutoff值
表13指标协同模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 |
| PON1/CEA | 0.908 | 0.545 |
| PON1/CEA/CA199 | 0.917 | 0.516 |
| PON1/CEA/CA125 | 0.908 | 0.633 |
| PON1/CEA/CA125/CA199 | 0.925 | 0.567 |
表14指标以合成模型联合预测CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 |
| PON1-CEA | 0.575 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA199 | 0.683 | 0.968 |
| PON1-CEA-CA125 | 0.175 | 1.000 |
| PON1-CEA-CA125-CA199 | 0.708 | 0.867 |
实施例7肿瘤标志物对早期结直肠癌的诊断效能测试结果
从实施例1的样本中选取早期结直肠癌样本，其采用实施例3中的测试方式，测试肿瘤标志物对早期结直肠癌的诊断效能。检测的结果如表15所示。
表15指标协同模型联合预测早期CRC的诊断效能
| 检测指标 | 灵敏度 | 特异性 | 阳性预测值 | 阴性预测值 |
| PON1/CEA | 0.923 | 0.394 | 0.643 | 0.813 |
| PON1/CEA/CA199 | 0.949 | 0.355 | 0.649 | 0.846 |
| PON1/CEA/CA125 | 0.923 | 0.333 | 0.783 | 0.870 |
| PON1/CEA/CA125/CA199 | 0.949 | 0.333 | 0.649 | 0.833 |
ROC曲线见图9，结果见表15，从实验结果可知，含PON1与CEA协同模型联合预测CRC，其灵敏度可以高达100％。
Claims (10)
1.一种结直肠肿瘤诊断的标记物组合，其特征在于，所述标记物为PON1和CEA。
2.如权利要求1所述的结直肠肿瘤诊断标记物组合，其特征在于，还包括标记物CA199和CA125中的一种或两种。
3.权利要求1或2所述的结直肠肿瘤诊断标记物组合的检测试剂在制备结直肠肿瘤诊断试剂或者试剂盒中的应用；
优选地，所述检测试剂为检测所述标记物的基因表达量；
或优选地，所述检测试剂为检测所述标记物的mRNA表达量；
或优选地，所述检测试剂为检测所述标记物蛋白的表达量；
或优选地，所述检测试剂为荧光定量PCR染料、荧光定量PCR引物、荧光定量PCR探针、抗体、抗体功能性片段和偶联抗体中的一种或多种；
或优选地，所述的试剂盒选自qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒中的一种或多种；
更优选地，所述的试剂盒选自ELISA试剂盒。
4.一种结直肠肿瘤的诊断试剂/试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂/试剂盒包含标记物PON1和CEA的检测试剂；
优选地，所述诊断试剂/试剂盒还包含标记物CA199和CA125中的一种或两种的检测试剂；
或优选地，所述检测试剂为检测所述标记物的基因表达量；
或优选地，所述检测试剂为检测所述标记物的mRNA表达量；
或优选地，所述检测试剂为检测所述标记物蛋白的表达量。
5.如权利要求4所述的诊断试剂/试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为荧光定量PCR染料、荧光定量PCR引物、荧光定量PCR探针、抗体、抗体功能性片段和偶联抗体中的一种或多种。
6.如权利要求4或5所述的诊断试剂/试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒选自qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒中的一种或多种；
优选地，所述的试剂盒选自ELISA试剂盒。
7.一种结直肠肿瘤的诊断系统，其特征在于，所述的诊断系统含有：
检测构件：所述的检测构件用以检测标记物组合中各标记物的表达量；
结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的标记物组合中各标记物的表达量的结果，输出肿瘤患者疾病结果；
所述的标记物组合为标记物PON1和CEA的组合；
优选地，所述的标记物的表达量为基因表达量、mRNA表达量和或蛋白表达量中的一种或多种；
优选地，所述标记物的表达量为蛋白表达量；
或优选地，所述的结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入所述标记物的表达量；分析模块用于根据所述标记物的表达量，分析出肿瘤患者疾病风险结果的可能性；输出模块用于输出分析模块的分析结果；
或优选地，所述的检测构件含有qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、免疫印迹检测装置、流式细胞仪、免疫组化检测装置、ELISA检测装置、电化学发光检测装置中的一种或几种；
更优选地，所述的检测构件含有ELISA试剂盒；
或优选地，所述标记物组合中的标记物PON1和CEA表达量的阈值分别为1647.854-1740.402ng/mL和1.84-3ng/mL；
进一步优选地，所述标记物组合中的标记物PON1和CEA表达量的阈值分别为1684.524-1723.824ng/mL和1.875-2.03ng/mL；
更为优选地，所述标记物组合中的标记物PON1和CEA表达量的阈值分别为1689.286-1710.174ng/mL和1.91-1.945ng/mL；
或优选地，所述的标记物组合还包括标记物CA199和CA125中的一种或两种；
更为优选地，所述标记物组合中的标记物CA199和CA125表达量的阈值分别为15.115-20.54 U/mL和10.15-16.4 U/mL；
更进一步优选地，所述标记物组合中的标记物CA199和CA125表达量的阈值分别为18.42-19.7 U/mL和10.25-15.95 U/mL；
最为优选地，所述标记物组合中的标记物CA199和CA125表达量的阈值分别为18.8-19.42 U/mL和13.65-15 U/mL。
8.如权利要求7所述的诊断系统，其特征在于，所述的结果判断构件中，当所述标记物组合中任一标记物的表达量高于阈值时，则判断结直肠肿瘤患病为阳性；当所述标记物组合中所有标记物的表达量低于阈值时，则判断结直肠肿瘤患病阴性。
9.如权利要求3所述的应用或权利要求4或5任一所述的诊断试剂/试剂盒或权利要求7或8任一所述的诊断系统，其特征在于，所述诊断所针对的样品为组织、体液或排泄物；
更为优选地，所述组织为肠组织；
或更为优选地，所述体液为血液、细胞外液、组织液、淋巴液、脑脊液或房水；
更进一步优选地，所述体液为血液；
最为优选地，所述体液为血浆；
或更为优选地，所述排泄物为痰、唾液、尿液或粪便。
10.如权利要求1-2任一所述的标记物组合或权利要求3所述的应用或权利要求4所述的诊断试剂/试剂盒或权利要求7或8任一所述的结直肠肿瘤诊断系统，其特征在于，所述的结直肠肿瘤为I、II、III、IV期结直肠癌、癌前腺瘤；
优选地，所述结直肠肿瘤为I-II期结直肠癌。
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