CN110368411A - 一种白背天葵多酚的提取工艺及其分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白背天葵多酚的提取工艺及其分离纯化方法。白背天葵多酚超临界CO2提取最优工艺为：萃取压力35MPa，萃取时间2 h，萃取温度40℃，CO2流量20 L/h。白背天葵多酚的最优纯化工艺为:D101树脂为最优树脂，上样液浓度为1mg/mL，pH值为3.1，上样液流速为2mL/min，解吸的乙醇体积分数为70%，体积为60mL，流速为2mL/min。在此条件下，白背天葵多酚的含量由粗提物中的14.73%提高到纯化物中的45.21%。体外抗氧化试验表明，白背天葵多酚对DPPH及ABTS自由基的清除率随其浓度的提高而提高。体内抗氧化试验表明，白背天葵多酚提取物能显著提高衰老模型组血清及肝组织中SOD、GSH‑Px、CAT活性并降低MDA含量。

Description

一种白背天葵多酚的提取工艺及其分离纯化方法
技术领域
本发明属于植物有效成分的提取技术领域，具体涉及一种白背天葵多酚的提取工艺及其分离纯化方法。
背景技术
白背天葵为菊科三七草属植物，又名白凤菜、白背三七，福建漳州地区称为“片仔癀草”。在福建、广东、海南等地多有分布。它是一种保健药膳和珍稀蔬菜，有“最佳保健药膳蔬菜”之称。白背天葵营养丰富，味道鲜美，且全草可入药，白背天葵所含的多酚类化合物具有广泛的生物活性，如具有抗炎，抗氧化、抗癌、防治心脑血管疾病等作用。因此，对白背天葵多酚进行提取并分离纯化，对于开发利用白背天葵多酚化合物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白背天葵多酚的提取工艺及其分离纯化方法，旨在为进一步开发利用白背天葵多酚提供依据。。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种白背天葵多酚的提取工艺，其包括以下步骤：
1)取白背天葵茎叶部分烘干后粉碎过筛，得到白背天葵粉末；
2)取300g白背天葵粉末装入萃取釜中，在萃取压力为30-40MPa，萃取时间为1.5-2.5h，萃取温度为35-45℃，CO2流量为15-25L/h，夹带剂为浓度90％乙醇的条件下进行超临界CO2提取,，提取物经真空冷冻干燥机干燥24h，得到白背天葵多酚粗提物。
进一步的，步骤1)所述烘干温度为60-65℃，筛网目数为60目。
作为优选，步骤2)所述萃取压力为35MPa，萃取时间为2h，萃取温度为40℃，CO2流量20L/h。
一种白背天葵多酚的分离纯化方法，其包括以下步骤：
1)选取D101树脂为纯化白背天葵多酚粗提物的树脂，对D101树脂进行预处理；
2)称取12g预处理好的D101树脂，选取16mm×20cm(柱体积约为20mL)的玻璃层析柱进行湿法装柱，以白背天葵多酚提取物为上样液进行吸附，上样液质量浓度为0.5-1.5mg/mL，上样液pH值为3-3.5，上样量为150mL，用恒流泵调节上样液流速为1.5-2.5mL/min；
3)吸附完全后，用体积分数为65-75％的乙醇溶液60mL以流速为1.8-2.2mL/min进行洗脱；
4)洗脱液经浓缩，真空冷冻干燥，得到白背天葵多酚纯化物。纯化结果表明，白背天葵多酚粗提物中多酚的含量为14.73％，经DM101树脂纯化后多酚的含量为45.21％，约为纯化前的3.07倍。
进一步的，步骤1)所述预处理如下：将D101树脂用95％乙醇浸泡24h后，用蒸馏水洗涤至无醇味，再用5％HCl溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用5％NaOH溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，将树脂滤干备用。
作为优选，步骤2)所述上样液质量浓度为1mg/mL，上样液pH值为3.1，上样液流速为2mL/min。
作为优选，步骤3)所述洗脱用乙醇溶液的体积分数为70％，流速为2mL/min。
本发明以萃取压力，萃取时间，萃取温度、CO2流量和夹带剂浓度为单因素，以多酚提取率为指标，采用响应面法对提取工艺条件进行优化；为了进一步分离纯化白背天葵多酚，并探讨其抗氧化活性，通过比较8种大孔树脂对白背天葵多酚的静态吸附和解吸能力，筛选出最适宜分离纯化白背天葵多酚的树脂，并确定其分离纯化的工艺参数。纯化结果表明，白背天葵多酚粗提物中多酚的含量为14.73％，经DM101树脂纯化后多酚的含量为45.21％，约为纯化前的3.07倍。体外抗氧化试验表明，白背天葵多酚对DPPH及ABTS自由基的清除率随其浓度的提高而提高。体内抗氧化试验表明，白背天葵多酚提取物能显著提高衰老模型组血清及肝组织中SOD、GSH-Px、CAT活性并降低MDA含量。
附图说明
图1为实施例1中，萃取压力对白背天葵多酚提取率的影响；
图2为实施例1中，萃取时间对白背天葵多酚提取率的影响；
图3为实施例1中，萃取温度对白背天葵多酚提取率的影响；
图4为实施例1中，CO2流量对白背天葵多酚提取率的影响；
图5为实施例1中，夹带剂浓度对白背天葵多酚提取率的影响；
图6为实施例1中，因素的交互作用对白背天葵多酚提取率的影响；
图7为实施例2中，AB-8、DM130、D-101三种树脂的静态吸附动力学曲线；
图8为实施例2中，DM130树脂的动态吸附渗透曲线；
图9为实施例2中，上样液质量浓度对白背天葵多酚吸附率的影响；
图10为实施例2中，上样液pH值对白背天葵多酚吸附率的影响；
图11为实施例2中，上样液流速对白背天葵多酚吸附率的影响；
图12为实施例2中，因素的交互作用对多酚吸附率的影响；
图13为实施例2中，乙醇体积分数对白背天葵多酚解吸率的影响；
图14为实施例2中，洗脱流速对白背天葵多酚解吸率的影响；
图15为实施例2中，白背天葵多酚对DPPH自由基的清除作用；
图16为实施例2中，白背天葵多酚对ABTS自由基的清除作用。
具体实施方式
实施例1
白背天葵多酚的提取条件的优化
本实施例通过超临界CO2萃取技术对白背天葵的多酚进行提取，并应用响应面分析法对工艺进行优化。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料白背天葵种植于龙岩学院植物房内，取其茎叶部分60℃烘干后粉碎过60目筛备用。50只雄性昆明小鼠购于上海斯莱克实验动物公司，许可证号SCXK(沪)2017-0005，体质量28-30g，饲养温度22±1℃，光周期12h，标准饲料喂养，自由饮水。没食子酸(149-91-7)购于阿拉丁试剂公司；D-半乳糖(D-gal)购于美国Sigma公司；Vc对照品(A-4544)，购自美国Fluka公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷肌甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、总蛋白定量试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。
1.1.2主要仪器UV-1800紫外可见分光光度计(日本SHIMADZU公司)；Bio－TekELX800酶标仪(美国宝特公司)HA121-50-01型超临界CO2萃取仪(江苏南通华安超临界萃取有限公司)。
1.2方法
1.2.1白背天葵多酚的测定多酚的测定参照Conde T等(Conde T,Mussatto SI.Isolation of polyphenols from spent coffee grounds and silverskin by mildhydrothermal pretreatment[J].Preparative Biochemistry,2017,46(4):406-409.)的方法。根据标准曲线，依下述公式计算多酚的提取率：
式中:C为标准曲线中对应多酚的质量浓度(mg/mL)；V为样液的体积(mL)；a为稀释倍数；W为白背天葵的质量(g)。
1.2.2单因素试验分别对超临界萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO2流量和夹带浓度进行单因素试验，以白背天葵多酚的提取率为指标，确定各因素的最佳选择范围。
1.2.3 CO2超临界萃取在单因素的基础上，运用Design Expert 8.0.6软件进行响应面优化试验，选择萃取压力(X1)、萃取温度(X2)、萃取时间(X3)、CO2流量(X4)四因素作为自变量，以白背天葵多酚的提取率为响应值，设计四因素三水平的响应面试验。
1.2.4统计分析每项试验至少重复3次，试验结果以平均数±标准差来表示，单因素方差分析使用SPSS 22.0统计软件包。采用Design Expert 8.0.6软件进行数据分析，Origin 8.0软件画图。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1萃取压力的选择在萃取温度为40℃、萃取时间为1.5h、CO2流量为15L/h和夹带剂浓度为90％乙醇的条件下，以白背天葵多酚提取率为指标，考查当萃取压力为20、25、30、35、40、45MPa时对白背天葵多酚提取率的影响。由图1可知，当萃取压力在20-35MPa之间时，多酚提取率随着压力的升高而升高，至35MPa后提取率稍有下降。其原因可能是压力增大，使得超临界CO2流体的密度增加，从而增加了溶质与溶剂之间的传质效率，使得超临界CO2流体的溶解能力增强，萃取更充分。但当继续增大压力，超临界CO2流体的黏度增加，减小了溶质与溶剂之间的传质效率，多酚溶出困难，提取率下降。此外压力增大也不利于安全，因此本发明选择萃取压力范围为30-40MPa。
2.1.2萃取时间的选择在萃取温度为40℃、萃取压力30MPa、CO2流量为15L/h和夹带剂浓度为90％乙醇的条件下，以白背天葵多酚提取率为指标，考查当萃取时间为1、1.5、2、2.5、3、3.5h时对白背天葵多酚提取率的影响。由图2可知，随着萃取时间的延长，多酚提取率增加，但当大于2h后，提取率增加缓慢。其原因为随着时间的延长，超临界CO2流体与溶质接触越来越充分，提取率增加，但当达到一定时间后，多酚在超临界CO2流体中溶出达到平衡，提取率增加缓慢，且会增加生产成本。因此本发明选择萃取时间范围为1.5-2.5h。
2.1.3萃取温度的选择在萃取时间为1.5h、萃取压力30MPa、CO2流量为15L/h和夹带剂浓度为90％乙醇的条件下，以白背天葵多酚提取率为指标，考查当萃取温度为30、35、40、45、50、55℃时对白背天葵多酚提取率的影响。由图3可知，随着温度的升高，多酚提取率呈现先升高后下降的趋势。其原因为温度升高增加了溶质的扩散系数，使得溶质更易溶出，提取率升高，但同时温度升高又降低了超临界CO2流体的密度，导致其溶解能力降低，提取率下降。因此本发明选择萃取温度范围为35-45℃。
2.1.4 CO2流量的选择在萃取温度40℃、萃取时间为1.5h、萃取压力为30MPa和夹带剂浓度为90％乙醇的条件下，以白背天葵多酚提取率为指标，考查当CO2流量为5、10、15、20、25、30L/h时，对白背天葵多酚提取率的影响。由图4可知，随着CO2流量的增加，多酚提取率呈现先升高后下降的趋势。其原因为增加了CO2流量的，即增加了溶剂与溶质的接触面积，从而促进了超临界CO2流体的溶解能力，提高了提取率，但继续增大流量使得流体与溶质接触不充分，提取率下降，同时也增加了生产成本。因此本发明选择CO2流量范围为15-25L/h。
2.1.5夹带剂浓度的选择在萃取温度40℃、萃取时间为1.5h、萃取压力为30MPa和CO2流量为15L/h的条件下，以白背天葵多酚提取率为指标，考查当夹带剂浓度为75、80、85、90、95、100％时，对白背天葵多酚提取率的影响。由图5可知，随着夹带剂浓度的增加，多酚提取率逐渐增加，当浓度达到100％(无水乙醇)时。提取率达到最大值。其原因可能为夹带剂含水量越大，溶质越易吸水膨胀，从面影响超临界流体的对溶质的渗入，影响提取率。因此本发明选择无水乙醇作为夹带剂。
2.2响应面试验
2.2.1试验设计与结果进行四因素三水平的Box-Benhnken中心组合试验设计，考察萃取压力(X1)，萃取时间(X2)，萃取温度(X3)和CO2流量(X4)对白背天葵多酚提取率(Y)的影响，试验设计及结果见表1。
表1响应面试验设计及结果
对表1数据进行多元回归拟合分析，得到的回归方程为
Y＝5.31+0.052X1+0.12X2+0.023X3+0.082X4-0.041X1X2-0.048X1X3-0.015X1X4+0.0073X2X3+0.070X2X4+0.089X3X4-0.38X1 2-0.39X2 2-0.24X3 2-0.54X4 2
对回归方程进行显著性检验分析，结果如表2所示。结果显示，该模型极显著(P＜0.0001),相关系数R2＝0.9983,校正决定系数RAdj＝0.9965，失拟项不显著(P＝0.1646＞0.05)。说明该回归方程拟合度较好，模型试验误差小，因此，可以用该方程对白背天葵多酚提取率进行准确预测和分析。模型的X1、X2、X4、X2X4、X3X4、X1 2、X2 2、X3 2、X4 2为极显著，X3为显著。通过F值可知，各单因素对白背天葵多酚提取率影响的大小依次为：X2＞X4＞X1＞X3；交互项对提取率影响的大小依次为：X3X4＞X2X4＞X1X3＞X1X2＞X1X4＞X2X3。
表2响应面试验结果的方差分析
注：*p<0.05，差异显著；**p<0.0001，差异极显著。
2.2.2响应面分析由图6可知，萃取温度和CO2流量，萃取时间和CO2流量交互作用最为显著，萃取压力和萃取温度、萃取压力和萃取时间次之，萃取压力和CO2流量、萃取时间和萃取温度不显著，这与模型中F值分析结果相一致。
2.2.3验证试验
通过响应面回归方程，得到白背天葵多酚提取的最佳条件为萃取压力35.25MPa，萃取时间2.10h，萃取温度40.27℃和CO2流量20.29L/h，在此条件下模型预测白背天葵多酚提取率为5.3238％。为方便实际操作，修正后的条件为萃取压力35MPa，萃取时间2h，萃取温度40℃和CO2流量20L/h，此条件下多酚提取率为5.3154％，与理论值接近，RSD为0.45％。证明该回归模型是可靠的。
实施例2
白背天葵多酚的分离纯化条件的优化
实施例1应用响应面分析法确定了超临界CO2萃取白背天葵多酚的最佳提取工艺，在此基础上，本实施例过比较八种不同型号大孔吸附树脂的吸附和解吸能力，筛选出最适宜纯化白背天葵多酚的大孔树脂，并确定吸附与解吸的最佳纯化工艺参数，旨在为进一步开发利用白背天葵多酚提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料白背天葵种植于龙岩学院植物房内。没食子酸标准品、1,1一二苯基一2一三硝基本肼(1,1-diphenyl-2–picrylhydrazyl,DPPH)、2,2一联氮一二(3一乙基一苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]、Vc对照品购自美国Fluka公司；大孔树脂D-101、HPD-300、HP-750、ADS-17、AB-8、DM130、NKA-9、XDA-9均购自天津鸿博美化工科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2主要仪器UV-1800紫外可见分光光度计(日本SHIMADZU公司)；Bio－TekELX800酶标仪(美国宝特公司)；Re一52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
1.2方法
1.2.1白背天葵多酚粗提物的制备
在实施例1的基础上，采用超临界CO2萃取法。白背天葵茎叶部分60℃烘干粉碎后，在萃取压力为35MPa，时间为2h，温度为40℃、CO2流量20L/h的条件下进行超临界CO2提取多酚，经真空冷冻干燥机干燥24h，备用。
1.2.2白背天葵多酚含量的测定
同实施例1。
1.2.3大孔树脂预处理
将大孔树脂D-101、HPD-300、HP-750、ADS-17、AB-8、DM130、NKA-9、XDA-9用95％乙醇浸泡24h后，用蒸馏水洗涤至无醇味。用5％HCl溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，再用5％NaOH溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，将树脂滤干备用。
1.2.4大孔树脂的静态吸附与解吸性能
分别称取上述8种型号的大孔树脂各1g，放入100mL三角瓶中，加入30mL浓度为1.058mg/mL的白背天葵多酚溶液，置于25℃恒温摇床中，100r/min振荡12h，将吸附饱和的大孔树脂用150mL蒸馏水洗涤，抽滤后，用30mL 75％的乙醇解吸附12h。按下式计算各树脂的吸附率与解吸率。
吸附率＝(C0-C1)/C0
解吸率＝C2/(C0-C1)
C0为吸附前多酚的质量浓度(mg/mL)；C1为吸附后多酚的质量浓度(mg/mL)；C2为解吸后多酚的质量浓度(mg/mL)。
1.2.5大孔树脂的静态吸附动力学曲线
选取上述树脂中吸附和解吸效果最好的3种树脂，按上述操作，进行恒温振荡吸附，分别于0.5、1、2、4、8、16h吸取上清液测定吸光度，计算吸附率并绘制大孔树脂的静态吸附曲线。
1.2.6多酚树脂吸附单因素试验
选取16mm×20cm(柱体积约为20mL)的玻璃层析柱湿法装柱，分别对上样液质量浓度、上样量、上样液pH值、上样液流速进行单因素试验，确定各因素的最佳选择范围。
1.2.7响应面优化
在单因素的基础上，运用Design Expert 8.0.6软件进行响应面优化试验，选择上样液质量浓度(X1)、上样液pH值(X2)、上样液流速(X3)三因素作为自变量，以多酚吸附率为响应值，设计三因素三水平的响应面试验。
1.2.8统计分析每项试验至少重复3次，试验结果以平均数±标准差来表示，单因素方差分析使用SPSS 22.0统计软件包。采用Design Expert 8.0.6软件进行数据分析，Origin 8.0软件画图。
2结果与分析
2.1树脂的筛选
2.1.1大孔树脂的静态吸附与解吸
为了选择合适的白背天葵多酚纯化树脂，本文在综合前人纯化多酚的基础上分别选择了极性树脂2种、中极性树脂2种、弱极性树脂2种和极性树脂3种。由表3可知，AB-8、DM130、D-101三种树脂的吸附效果较好，其中DM130的吸附率最高为87.42±0.58％。而解吸效果较好的三种树脂分别是XDA-9、AB-8、DM130，其中AB-8的解吸率最高为86.34±0.81％。综合考虑吸附率和解吸率这2个指标，我们选择AB-8、DM130、D-101这三种树脂做静态吸附动力学曲线来进一步筛选。
表3 8种大孔树脂的吸附与解吸效果比较
2.1.2大孔树脂静态吸附动力学曲线
由图7可见，三种树脂对白背天葵多酚的吸附均为快速平衡型。DM130和AB-8树脂在2h达到吸附平衡，D101树脂在4h达到吸附平衡，平衡后三种树脂的吸附动力学曲线均随着时间的延长逐渐趋于平缓。DM130树脂对白背天葵黄酮的最大吸附率大于AB-8和D101树脂的最大吸附率。从节约时间和吸附效果考虑，DM130树脂更适合富集纯化白背天葵黄酮类化合物，因此，后续试验采用DM130树脂作为纯化树脂。
2.2大孔树脂吸附单因素试验
2.2.1上样液体积的确定
设定上样液浓度为1mg/mL、pH值为5、流速为1.0mL/min，分段收集流出液，每10mL收集1管，测定白背天葵多酚浓度，并绘制动态吸附渗透曲线。如图8所示，开始阶段，多酚浓度很低，说明多酚几乎被大孔树脂全部吸附，无渗透，但当流出液体积大于70mL时，大孔树脂吸附有泄漏，说明多酚吸附量已基本达到饱和，当流出液体积为130mL时，流出液多酚浓度约是上样液浓度的10％时，此时已达到树脂的渗透点，故选择上样液体积为150mL。
2.2.2上样液质量浓度对白背天葵多酚吸附的影响
设定上样液pH值为5、流速为1.0mL/min、体积为150mL，考查当上样液质量浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3mg/mL时DM130树脂对白背天葵多酚吸附率的影响。由图9可知，随着上样液质量浓度的提高，吸附率呈现先增加后下降的趋势，浓度低时吸附率低，可能是由于树脂的表面与多酚分子的接触面积小，树脂未达到饱和吸附，而当浓度增加到一定值后吸附率下降可能是由于多酚分子含有的羰基和羟基通过氢键而聚合成大分子，不容易被树脂吸附基团所吸附[12]。因此本发明选择上样液质量浓度范围为0.5-1.5mg/mL。
2.2.3上样液pH值对白背天葵多酚吸附的影响
设定上样液质量浓度为1mg/mL、流速为1.0mL/min、体积为150mL，考查当上样液pH值分别为1、2、3、4、5、6时DM130树脂对白背天葵多酚吸附率的影响。由图10可知，随着pH值的增加，多酚吸附率先增加后下降，当pH值为3时，吸附率达到最大，其原因可能为当溶液pH值较小时，多酚类化合物的溶解度在酸性条件下降低，呈现分子形式，可通过范德华力被树脂吸附，但当pH值过小时，因溶液酸性过强而导致多酚类化合物发生沉淀，所以吸附率不高，当pH值过高时，多酚类化合物中的酚羟基容易失去H+，削弱了与溶液中水分子的相互作用力，从而不易被树脂吸附]。另外，当pH值过高时，大孔树脂容易结块，不利于多酚的吸附。因此本发明选择上样液pH值范围为2-4。
2.2.4上样液流速对白背天葵多酚吸附的影响
设定上样液质量浓度为1mg/mL、pH值为5、体积为150mL，考查当上样液流速分别为1、2、3、4、5、6mL/min时DM130树脂对白背天葵多酚吸附率的影响。由图11可知，随着上样液流速的增加，多酚吸附率逐渐下降，其原因可能为流速小时，白背天葵多酚类化合物可与树脂充分接触使得吸附率较高。因此本发明选择上样液流速范围为1-3mL/min。
2.3响应面试验
2.3.1试验设计与结果进行三因素三水平的Box-Benhnken中心组合试验设计，考察上样液质量浓度(A)、上样液pH值(B)、上样液流速(C)对白背天葵多酚吸附率(R)的影响，试验设计及结果见表2。
表2响应面试验设计及结果
对表2数据进行多元回归拟合分析，得到的回归方程为
R＝90.13+1.22A+0.76B+0.099C-0.70AB+0.025AC+0.20BC-4.33A2-2.90B2-1.02C2
对回归方程进行显著性检验分析，结果(表4)显示，该模型极显著(P＜0.0001),相关系数R2＝0.9950,校正决定系数R2 Adj＝0.9886，其失拟项不显著(P＝0.1575＞0.05)，说明回归方程拟合度较好，模型试验误差小，可以用该方程对白背天葵多酚吸附率进行准确预测和分析。模型的A、A2、B2为极显著，B、AB、C2为显著。由F值可知，各单因素对白背天葵多酚吸附率影响的大小顺序为：A＞B＞C；交互项对吸附率影响的大小顺序为：AB＞BC＞AC。
表4响应面试验结果的方差分析
注：*p<0.05，差异显著；**p<0.0001，差异极显著。
2.3.2响应面分析由图12可知，上样液浓度和上样液pH值交互作用最为显著，上样液浓度和上样液流速、上样液pH值和上样液流速作用均不显著，这与模型中F值分析结果相一致。
2.3.3验证试验
通过响应面回归方程，得到大孔树脂吸附白背天葵多酚的最佳条件为上样液浓度为1.07mg/mL，上样液pH值为3.12、上样液流速2.06mL/min，在此条件下模型预测白背天葵多酚吸附率为90.49％。为方便实际操作，修正后的条件为上样液浓度为1mg/mL，上样液pH值为3.1、上样液流速2mL/min，此条件下多酚吸附率为90.38％，与理论值接近，RSD为0.37％。证明该回归模型是可靠的。
2.4大孔树脂解吸单因素试验
2.4.1乙醇体积分数对白背天葵多酚解吸的影响
设定乙醇洗脱流速为1mL/min，体积为60mL，考查当乙醇体积分数分别为50、60、70、80、90、100％时对白背天葵多酚解吸率的影响。由图13可以看出，随着乙醇体积分数的增加，解吸率先增加后减少，当体积分数为70％时，解吸率达到最大为88.21％。因此选择70％的乙醇为解吸浓度。
2.4.2洗脱流速对白背天葵多酚解吸的影响
设定乙醇体积分数为70％，体积为60mL，考查当流速分别为1、2、3、4、5、6mL/min时对白背天葵多酚解吸率的影响。由图14可以看出，随着流速的增加，解吸率逐渐减少，但太低的流速不利于工业化生产，因此，本发明选择乙醇洗脱流速为2mL/min。
2.5白背天葵多酚的纯化结果
按上述最佳工艺条件对白背天葵多酚粗提物进行上样、吸附和洗脱，测定多酚的含量，再经浓缩，真空冷冻干燥。纯化结果表明，白背天葵多酚粗提物中多酚的含量为14.73％，经DM101树脂纯化后多酚的含量为45.21％，约为纯化前的3.07倍。
实施例3
白背天葵多酚体外抗氧化指标测定
白背天葵多酚清除DPPH及ABTS自由基的测定，以抗坏血酸为对照。
1白背天葵多酚对DPPH·自由基的清除作用
如图15显示，随着白背天葵多酚和VC浓度的增加，DPPH·自由基清除率呈现上升趋势，VC的清除能力强于白背天葵多酚粗提物和纯化物，清除率大小顺序为VC>纯化物>粗提物。当浓度达到200μg/mL时，白背天葵多酚粗提物和纯化物对DPPH·自由基的清除率分别为72.19％和88.49％。
2白背天葵多对ABTS自由基的清除作用
对ABTS自由基的清除效果见图16，与清除DPPH自由基相似，其清除ABTS自由基的作用也随着浓度的增加而增加，当浓度达到200μg/mL时，白背天葵多酚粗提物和纯化物对ABTS自由基的清除率分别为81.22％和92.36％。
实施例4
白背天葵多酚体内抗氧化指标测定
试验小鼠随机分为5组，每组10只，即空白组、衰老模型组、多酚提取物高、中、低剂量组。提取物组每日给药剂量分别为150、300、600mg/kg的多酚提取物，空白组与模型组灌胃等量生理盐水；衰老组与提取物各组每日皮下注射0.2mg/g的D-半乳糖(10μL/g)，空白组则每日皮下注射等量的生理盐水。连续给药30d，于试验给药末次，禁食15h，摘眼球采血，后处死小鼠取出肝脏匀浆。按各试剂盒说明书操作，测血清及肝组织中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。
如表5及表6所示，模型组小鼠血清的SOD、CAT活性及小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量与空白组相比具有极显著性差异，模型组小鼠血清的GSH-Px活性及MDA含量与空白组相比具有显著性差异，说明小鼠造模成功。当灌胃低剂量的白背天葵多酚时，小鼠血清的SOD活性与空白组比具有极显著性差异，GSH-Px活性及MDA含量与对照比具有显著性差异，但CAT活性无显著性差异；当灌胃高剂量的白背天葵多酚时，小鼠血清的SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量与空白组比均具有极显著性差异(表5)；同样，当灌胃高剂量的白背天葵多酚时，小鼠肝组织的SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量与空白组比也者具有极显著性差异(表6)。表明白背天葵多酚提取物具有显著提高体内抗氧化酶活性的作用。
表5白背天葵多酚对小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT及MDA的影响
注：*P<0.05,**P<0.01与对照组比较.#P<0.05,##P<0.01与模型组比较.
表6白背天葵多酚对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、CAT及MDA的影响
注：*P<0.05,**P<0.01与对照组比较.#P<0.05,##P<0.01与模型组比较.
实施例5
一种白背天葵多酚的提取工艺，包括以下步骤：
1)取白背天葵茎叶部分60℃烘干后粉碎过60目筛，得到白背天葵粉末；
2)取300g白背天葵粉末装入萃取釜中，在萃取压力为35MPa，萃取时间为2h，萃取温度为40℃，CO2流量为20L/h，夹带剂为浓度90％乙醇的条件下进行超临界CO2提取,，提取物经真空冷冻干燥机干燥24h，得到白背天葵多酚粗提物。
实施例6
一种白背天葵多酚的分离纯化方法，其包括以下步骤：
1)选取D101树脂为纯化白背天葵多酚粗提物的树脂，对D101树脂进行如下预处理：将D101树脂用95％乙醇浸泡24h后，用蒸馏水洗涤至无醇味，再用5％HCl溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用5％NaOH溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，将树脂滤干备用；
2)称取12g预处理好的D101树脂，选取16mm×20cm(柱体积约为20mL)的玻璃层析柱进行湿法装柱，以白背天葵多酚提取物为上样液进行吸附，上样液质量浓度为1mg/mL，上样液pH值为3.1，上样量为150mL，用恒流泵调节上样液流速为2mL/min；
3)吸附完全后，用体积分数为70％的乙醇溶液60mL以流速为2mL/min进行洗脱；
4)洗脱液经浓缩，真空冷冻干燥，得到白背天葵多酚纯化物。纯化结果表明，白背天葵多酚粗提物中多酚的含量为14.73％，经DM101树脂纯化后多酚的含量为45.21％，约为纯化前的3.07倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种白背天葵多酚的提取工艺，其特征在于：其包括以下步骤：
1）取白背天葵茎叶部分烘干后粉碎过筛，得到白背天葵粉末；
2）取白背天葵粉末装入萃取釜中，在萃取压力为30-40MPa，萃取时间为1.5-2.5 h，萃取温度为35-45℃，CO2流量为15-25L/h，夹带剂为浓度90%乙醇的条件下进行超临界CO2提取,，提取物经真空冷冻干燥机干燥24 h，得到白背天葵多酚粗提物。
2.根据权利要求1所述的一种白背天葵多酚的提取工艺，其特征在于：步骤1）所述烘干温度为60-65℃，筛网目数为60目。
3.根据权利要求1所述的一种白背天葵多酚的提取工艺，其特征在于：步骤2）所述萃取压力为35MPa，萃取时间为2 h，萃取温度为40℃，CO2流量20 L/h。
4.一种白背天葵多酚的分离纯化方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）选取D101树脂为纯化白背天葵多酚粗提物的树脂，对D101树脂进行预处理；
2）称取12 g 预处理好的D101树脂，选取16 mm×20 cm 的玻璃层析柱进行湿法装柱，以白背天葵多酚提取物为上样液进行吸附，上样液质量浓度为 0.5-1.5mg /mL，上样液pH值为3-3.5，上样量为150 mL，用恒流泵调节上样液流速为1.5-2.5 mL /min；
3）吸附完全后，用体积分数为65-75%的乙醇溶液60 mL以流速为1.8-2.2 mL /min进行洗脱；
4）洗脱液经浓缩，真空冷冻干燥，得到白背天葵多酚纯化物。
5.根据权利要求4所述的一种白背天葵多酚的分离纯化方法，其特征在于：步骤1）所述预处理如下：将D101树脂用95%乙醇浸泡24 h后，用蒸馏水洗涤至无醇味，再用5% HCl溶液浸泡12 h，蒸馏水洗至中性，最后用5% NaOH溶液浸泡12 h，蒸馏水洗至中性，将树脂滤干备用。
6.根据权利要求4所述的一种白背天葵多酚的分离纯化方法，其特征在于：步骤2）所述上样液质量浓度为 1 mg /mL，上样液pH值为3.1，上样液流速为2 mL /min。
7.根据权利要求4所述的一种白背天葵多酚的分离纯化方法，其特征在于：步骤3）所述洗脱用乙醇溶液的体积分数为70%，流速为2 mL /min。
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