CN110358803A - 一种驴胎盘活性多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种驴胎盘活性多肽的制备方法，包括如下步骤：步骤100、选取新鲜驴胎盘组织进行清洗剪碎工序后，置于缓冲液中进行匀浆工序和离心工序，获得上清液；步骤200、向上清液中加入蛋白酶进行酶解反应，获得酶解液；步骤300、将酶解液升温进行酶灭活处理工序，获得驴胎盘活性多肽液；步骤400、将驴胎盘活性多肽液进行冷冻干燥处理，获得驴胎盘活性多肽干粉。本发明主要采用盐离子和有机溶剂的生物缓冲液进行组织匀浆获取上清液，有效的改变蛋白质的溶解性，从而使不易溶于水相中的蛋白质溶解，提高胎盘蛋白的提取丰度以及提取率；与传统工艺相比获得的驴胎盘活性多肽水解度更高，分子量更小，易于实现大规模生产。

Description

一种驴胎盘活性多肽的制备方法

技术领域

本发明实施例涉及驴胎盘应用技术领域，具体涉及一种驴胎盘活性多肽的制备方法。

背景技术

胎盘是母体与胎儿间相互联系的临时性分泌器官，俗称胎衣，中医称之为紫河车，其内含有多种生物活性物质如蛋白质、氨基酸、免疫调节肽、生殖激素、矿物元素、维生素及多种功能因子等。

在《本草纲目》中记载：胎盘味甘、咸，性温，无毒，具有补血、补气、益精、美颜之功效，现代医学研究中发现：胎盘能够提高机体免疫力，调节体内激素水平，在临床上对一些顽固性疾病的治疗也取得了良好效果。

20世纪90年代，胎盘资源开始受到重视，起初人们将注意力集中在人类胎盘的研究上，但是由于人类胎盘的应用受到伦理约束，故随后人们开始对猪、牛、羊等动物胎盘进行了开发和利用，并主要应用于人类健康产业领域，目前我国市场上已有相应的胎盘保健品、化妆品出售。

但对于驴胎盘的研究和应用甚少，而我国一直是驴肉消耗大国，并且近年来阿胶产业规模不断扩大，导致我国驴胎盘资源的浪费，甚至是环境污染。

目前，胎盘活性成分开发的方法主要有：胎盘直接均匀浆提取方法、反复冻融提取方法、超临界CO₂萃取方法和酶解法提取方法等。但是现有技术的这几种方法的主要缺陷有：

(1)获得的胎盘提取物以大分子蛋白质为主，人体吸收效率低；

(2)提取方法简单粗放，蛋白质提取率偏低；

(3)工艺成本较高，不易于工业化生产；

(4)酶解深度不够，胎盘蛋白水解度偏低，胎盘多肽分子量偏高。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种驴胎盘活性多肽的制备方法，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：

一种驴胎盘活性多肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤100、选取新鲜驴胎盘组织进行清洗剪碎工序后，置于缓冲液中进行匀浆工序和离心工序，获得上清液；

步骤200、向所述上清液中加入蛋白酶进行酶解反应，获得酶解液；

步骤300、将所述酶解液升温进行酶灭活处理工序，获得驴胎盘活性多肽液；

步骤400、将所述驴胎盘活性多肽液进行冷冻干燥处理，获得驴胎盘活性多肽干粉。

作为本发明的一种优选方案，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

作为本发明的一种优选方案，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mmol/L-100mmol/L，pH值为6.0-9.0；所述Tris-HCl缓冲液中含氯化钠和乙醇，其中，氯化钠的浓度为100mmol/L-200mmol/L；乙醇的浓度为4g/L-120g/L。

作为本发明的一种优选方案，所述缓冲液与驴胎盘组织的湿重比例为10：1。

作为本发明的一种优选方案，所述匀浆工序的时间为10min-60min，匀浆温度为0℃-8℃。

作为本发明的一种优选方案，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意一种或任意几种组合。

作为本发明的一种优选方案，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的组合蛋白酶，组合蛋白酶的添加量为60U/mL-1000U/mL，反应pH值为6.0-9.0，反应温度为35℃-55℃，反应时间为1.5h-3h。

作为本发明的一种优选方案，所述酶灭活处理工序的温度为95℃-105℃，灭活时间为10min-20min。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤400中冷冻干燥处理的方法包括如下步骤：

步骤401、在方形容器内表面贴上一层离型保护膜，在所述容器中有序排列满多个蜂窝立方体；

步骤402、将驴胎盘活性多肽液倒入所述容器中，并与最上层的蜂窝立方体上表面齐平；

步骤403、将容器置于-15℃～-2℃的环境下冷冻成型，在低温环境下倒出冷冻蜂窝立方体至消毒后的无菌容器中；

步骤404、将装有所述冷冻蜂窝立方体的所述无菌容器置于无菌环境下抽真空将水分升华干燥；

步骤405、取出无菌容器晃动，即可得到干燥的驴胎盘活性多肽粗干粉；

步骤406、根据需求，将驴胎盘活性多肽粗干粉进行二次处理以获取细小均匀的驴胎盘活性多肽粗粉。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤403还包括：将整个所述的冷冻蜂窝立方体切开成单个的冷冻蜂窝立方体，并倾斜放置分布在所述无菌容器中，且所述无菌容器四周壁面为多孔状结构。

本发明的实施方式具有如下优点：

本发明获取上清液的步骤主要采用盐离子和有机溶剂的生物缓冲液进行组织匀浆获取，可以有效的改变蛋白质的溶解性，从而使不易溶于水相中的蛋白质溶解，提高胎盘蛋白的提取丰度以及提取率，进而获得更丰富的胎盘多肽；

本发明的制备工艺不需要像现有的提取方法不需要像现有的提取方法需要较高的工艺环境以及反复的操作，该方法简单易行，生产成本低，与传统工艺相比获得的驴胎盘活性多肽水解度更高，分子量更小，易于实现大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施方式中驴胎盘活性多肽制备方法的流程图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明提供了一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其主要包括如下步骤：

步骤100、选取新鲜驴胎盘组织进行清洗剪碎工序后，置于缓冲液中进行匀浆工序和离心工序，匀浆工序的时间为10min-60min，匀浆温度为0℃-8℃，获得上清液；

其中，缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液；Tris-HCl缓冲液的浓度为10mmol/L-100mmol/L，pH值为6.0-9.0；所述Tris-HCl缓冲液中含氯化钠和乙醇，其中，氯化钠的浓度为100mmol/L-200mmol/L；乙醇的浓度为4g/L-120g/L。

且缓冲液与驴胎盘组织的湿重比例为10：1。

步骤200、向所述上清液中加入蛋白酶进行酶解反应，获得酶解液，蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意一种或任意几种组合；

其中，蛋白酶优选为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的组合蛋白酶，组合蛋白酶的添加量为60U/mL-1000U/mL，反应pH值为6.0-9.0，反应温度为35℃-55℃，反应时间为1.5h-3h。

步骤300、将所述酶解液升温进行酶灭活处理工序，温度为95℃-105℃，灭活时间为10min-20min，获得驴胎盘活性多肽液；

步骤400、将所述驴胎盘活性多肽液进行冷冻干燥处理，获得驴胎盘活性多肽干粉。

实施例1～实施例5：

以下对于方法中驴胎盘蛋白的分离进行具体的实验操作：

将驴胎盘组织去除污物后洗净，用手术剪剪取没有血管的组织，用组织捣碎机10000～15000rpm/min研磨制成肉糜。

将肉糜按照1：10的比例加入到组织匀浆缓冲液中。

然后用均质机在4℃下进行匀浆20min。

匀浆缓冲液配方为：50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150mmol/L NaCl。同时在缓冲液中加入终浓度分别为4％、6％、8％、10％、12％(w/v)的乙醇。离心取上清液即获得驴胎盘蛋白液。

利用Bradford法对各方法提取出来的驴胎盘蛋白质进行定量分析，结果见下表：

实施例	匀浆缓冲液中乙醇含量(w/v)	蛋白液中蛋白质含量mg/mL
			对照	0％	0.215±0.012<sup>*</sup>
实施例1	4％	0.420±0.096
			实施例2	6％	0.662±0.018
实施例3	8％	0.452±0.028
			实施例4	10％	0.420±0.092
实施例5	12％	0.368±0.044

实施例6～实施例35：：

以下对于采用该工艺中优选的双酶酶解法制备驴胎盘活性多肽进行具体的实验：

选取胰蛋白酶和木瓜蛋白酶以6：1的配比方式，并在适宜的酶解温度、时间、酶添加量和pH值下对驴胎盘蛋白液进行酶解反应，并采用甲醛滴定法检测酶解反应的水解度。具体酶解方式见下表：

其中水解度通过甲醛滴定法进行检测，具体如下：

(1)将pH计接通电源，预热30min后，用pH缓冲溶液校准pH计。

(2)吸取10.00mL未水解驴胎盘蛋白溶液于烧杯中，加5滴30％过氧化氢；将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入烧杯内试样中适当位置。

开动电磁搅拌器，先用0.1mol/L氢氧化钠慢慢调节pH达到7.5左右后，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH＝8.10，并且保持1min不变；

然后慢慢加入15mL中性甲醛溶液，1min后用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH＝8.10，记录消耗氢氧化钠标准溶液滴定的体积(V0)。

(3)吸取10.00mL灭酶的水解液于烧杯中，加5滴30％过氧化氢。将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入烧杯内试样中适当位置。

开动电磁搅拌器，先用0.1mol/L氢氧化钠慢慢调节pH达到7.5左右后，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH＝8.10，并且保持1min不变。

然后慢慢加入15mL中性甲醛溶液，1min后用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH＝8.10。

记录消耗氢氧化钠标准溶液滴定的体积(V1)。按下式计算水解度(假定酶解配料的驴胎盘蛋白与水的比例为M:V)：

DH/％＝((V1-V0)×V×C×14.01×6.25)/(1000×M×pro)×100

式中：V1：1mL水解液消耗的NaOH溶液体积(mL)；

V0：1mL空白液消耗的NaOH溶液体积(mL)；

V：配料用水体积(mL)；

C：滴定用NaOH溶液浓度(mol/L)；

14.01：氮的摩尔质量(g/mol)；

6.25：氮换算为蛋白质的系数；

M：配料所加驴胎盘的质量(g)；

Pro：配料所加驴胎盘的蛋白含量(％)。

实施例36：

将驴胎盘组织去除污物后洗净，用手术剪去除血管和筋膜等组织，用组织捣碎机10000～15000rpm/min研磨制成肉糜。

将肉糜按照1：10的比例加入到50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，150mmol/L NaCl，6％(w/v)乙醇的组织匀浆缓冲液中。

然后用均质机在4℃下进行匀浆20min，离心，可获得蛋白质含量为0.662±0.018mg/mL的上清液。

使用稀盐酸调节上述上清液pH值至6.78，加入95U/mL的木瓜蛋白酶和570U/mL的胰蛋白酶，并在47.31℃下反应2.15h后，将酶解液升温至100℃酶灭活15min。

经甲醛滴定法测试可知其水解度为37.67％。经酶灭活的驴胎盘活性多肽液，采用冷冻干燥的方式制成冻干粉保存。

采用高分辨质谱对酶解后的多肽进行分子量分布测试，验证其水解效果，具体分子量分布如下表所示：

由此可见，采用复合酶酶解的方式制备驴胎盘活性多肽，与传统的单酶酶解相比，双酶酶解可以识别更多的蛋白酶酶切位点，增加蛋白质水解深度，获得分子量更小、更丰富的活性多肽。

高分辨质谱检测驴胎盘多肽分子量方法：

(1)液相条件：

色谱仪：Ekisgent M5

分析柱：C18

流动相A：99.9％水+0.1％甲酸

流动相A：99.9％乙腈+0.1％甲酸

流速：5μL/min

液相梯度时间：60min

进样量：4μL。

时间/min	0	0.1	47	50	54	55	60
								流动相B/％	5	8	35	80	80	5	5

(2)质谱条件：

质谱仪：Triple TOP 5600+

一级参数：m/z 300-1250，累计时间，0.25s，电荷数，2-5；

源气参数：GS1,25；GS2,25；气帘气,30；TEM 330；DP,100；CE,10；

二级参数：MS/MS，M/Z 100-1500，累计时间，0.1s，Rolling CE。

分析方法：采用Peakview软件，对不同样品种的离子峰进行提取，获得其分子量和峰面积，统计不同分子量范围内的离子峰面积，进行样品间的相对定量。

样品处理：将酶解后的样品冻干，使用0.1％乙腈溶液复溶，终浓度为1μg/μL，进行质谱上样分析，分析的样品除由响应面法获得的最佳双酶酶解溶液外，同时对比两种单酶在最佳酶解条件下获得的酶解液，蛋白酶与底物比同双酶酶解酶活力数。

综上述实施例，本发明在清洗、剪碎驴胎盘组织后采用含盐离子和有机溶剂的生物缓冲液进行组织匀浆，获取上清液，相对于常规的采用蒸馏水或普通的缓冲液制备的匀浆而言，特定浓度的盐离子和有机溶剂可以有效的改变蛋白质的溶解性，从而使不易溶于水相中的蛋白质溶解，提高胎盘蛋白的提取丰度以及提取率，进而获得更丰富的胎盘多肽。

本发明制备工艺简单易行，生产成本低，与传统工艺相比获得的驴胎盘活性多肽水解度更高，分子量更小，易于实现大规模生产。

在本实施方式中，由于驴胎盘活性多肽液本身具有一定的粘稠性，在常规干燥设备的处理下，干燥时间较长，最主要的是容易残留在干燥设备内，比较难以清洗，也会损失部分产品粉末，而且，整个过程处于常规环境下，受空气长时间接触，毕竟该驴胎盘干燥粉属于药物性食用品，常规干燥方法无法达到标准的要求。

因此，对步骤400中冷冻干燥处理的方法进行进一步改进，具体包括如下步骤：

步骤401、在方形容器内表面贴上一层离型保护膜，在所述容器中有序排列满多个蜂窝立方体；

步骤402、将驴胎盘活性多肽液倒入所述容器中，并与最上层的蜂窝立方体上表面齐平；

步骤403、将容器置于-15℃～-2℃的环境下冷冻成型，在低温环境下倒出冷冻蜂窝立方体，将整个所述的冷冻蜂窝立方体切开成单个的冷冻蜂窝立方体，并倾斜放置分布在消毒后的无菌容器中，且所述无菌容器四周壁面为多孔状结构；

步骤404、将装有所述冷冻蜂窝立方体的所述无菌容器置于无菌环境下抽真空将水分升华干燥；

步骤405、取出无菌容器晃动，即可得到干燥的驴胎盘活性多肽粗干粉；

步骤406、根据需求，将驴胎盘活性多肽粗干粉进行二次处理以获取细小均匀的驴胎盘活性多肽粗粉。

本实施例的冷冻干燥处理方法首先利用冷冻的方式将驴胎盘活性多肽液冷冻成固态，其中包含了水分，冷冻的过程可以避免与空气长时间接触，而且冷冻能够起到一定的灭菌作用。

为了能够更方便的得到粉末，在冷冻时，通过架设蜂窝立方体，使驴胎盘活性多肽液形成于单个的蜂窝立方体内，便于取出和摆放进行下一步工序。

其中，离型保护膜的作用是便于冷冻后的固体与容器之间的分离。

在无菌环境下抽真空升华水分的过程中，由于以蜂窝立方体作为载体，水分升华后，从无菌容器的四周以及上部输出，升华后形成的驴胎盘活性多肽冻干粉部分落入无菌容器底部，部分保持在蜂窝立方体的内部，当完成该工序后，取出无菌容器，晃动即可得到驴胎盘活性多肽冻干粉。

整个过程高效快速，而且对活性多肽没有损耗，能够得到高质高量的驴胎盘活性多肽冻干粉。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤100、选取新鲜驴胎盘组织进行清洗剪碎工序后，置于缓冲液中进行匀浆工序和离心工序，获得上清液；

步骤200、向所述上清液中加入蛋白酶进行酶解反应，获得酶解液；

步骤300、将所述酶解液升温进行酶灭活处理工序，获得驴胎盘活性多肽液；

步骤400、将所述驴胎盘活性多肽液进行冷冻干燥处理，获得驴胎盘活性多肽干粉。

2.根据权利要求1所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

3.根据权利要求2所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mmol/L-100mmol/L，pH值为6.0-9.0；所述Tris-HCl缓冲液中含氯化钠和乙醇，其中，氯化钠的浓度为100mmol/L-200mmol/L；乙醇的浓度为4g/L-120g/L。

4.根据权利要求1所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述缓冲液与驴胎盘组织的湿重比例为10：1。

5.根据权利要求1所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述匀浆工序的时间为10min-60min，匀浆温度为0℃-8℃。

6.根据权利要求1所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意一种或任意几种组合。

7.根据权利要求6所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的组合蛋白酶，组合蛋白酶的添加量为60U/mL-1000U/mL，反应pH值为6.0-9.0，反应温度为35℃-55℃，反应时间为1.5h-3h。

8.根据权利要求1所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述酶灭活处理工序的温度为95℃-105℃，灭活时间为10min-20min。

9.根据权利要求1所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤400中冷冻干燥处理的方法包括如下步骤：

步骤401、在方形容器内表面贴上一层离型保护膜，在所述容器中有序排列满多个蜂窝立方体；

步骤402、将驴胎盘活性多肽液倒入所述容器中，并与最上层的蜂窝立方体上表面齐平；

步骤403、将容器置于-15℃～-2℃的环境下冷冻成型，在低温环境下倒出冷冻蜂窝立方体至消毒后的无菌容器中；

步骤404、将装有所述冷冻蜂窝立方体的所述无菌容器置于无菌环境下抽真空将水分升华干燥；

步骤405、取出无菌容器晃动，即可得到干燥的驴胎盘活性多肽粗干粉；

步骤406、根据需求，将驴胎盘活性多肽粗干粉进行二次处理以获取细小均匀的驴胎盘活性多肽粗粉。

10.根据权利要求9所述的一种驴胎盘活性多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤403还包括：将整个所述的冷冻蜂窝立方体切开成单个的冷冻蜂窝立方体，并倾斜放置分布在所述无菌容器中，且所述无菌容器四周壁面为多孔状结构。