CN110358076A - 淫羊藿苷元衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及淫羊藿苷元衍生物，式W‑1B‑mPEG，及其药理学上容许的盐，以及其在制备治疗哮喘，骨髓抑制方面药物的用途。

Description

淫羊藿苷元衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及淫羊藿苷元衍生物及其药理学上可接受的盐以及其制备方法和应用。
背景技术
淫羊藿苷元(icaritin,ICT)为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体成分，其结构式如下：
淫羊藿苷元可以从淫羊藿药材或淫羊藿苷的体内代谢物中分离得到(孙朋悦，徐颖，文晔等，朝鲜淫羊藿的化学成分，中国植物化学杂志，1998，8(2)：122-125；刘铁汉，王毅，吴立军等，淫羊藿苷的肠菌代谢研究I.肠内细菌对淫羊藿苷的代谢转化，2000，31(11)：834-837)，或将淫羊藿苷经酶解分离得到(叶海涌，刘健，楼宜嘉，淫羊藿苷衍生物的制备及其雌激素样作用研究，浙江大学学报，2005，34(2)：131-136)。
有文献报道淫羊藿苷元具有抗Aβ肽致大鼠原代培养神经细胞凋亡的作用(张翔南，王欢欢，王志强等，淫羊藿苷元抗Aβ肽致大鼠原代培养神经细胞凋亡的作用，浙江大学学报，2007，36(3)：224-226)。中国专利CN101836976A公开了淫羊藿苷元具有抗肿瘤血管生成的作用。中国专利CN101428015A公开了淫羊藿苷元具有抗内毒素血症的作用。中国专利CN101284000A公开了淫羊藿苷元具有防治肥胖症或脂肪肝的作用。中国专利CN1869204A公开了淫羊藿苷元在诱导干细胞体外定向分化方面的用途。
淫羊藿苷元具有广泛的药理活性，但其溶解性差，在二氯甲烷和乙酸乙酯中略溶，在甲醇、无水乙醇和水中几乎不溶，在不同pH缓冲液中几乎不溶或不溶。淫羊藿苷元口服生物利用度低。
发明内容
本发明提供一种淫羊藿苷元衍生物，结构如式W-1B-mPEG所示：
或式W-1B-mPEG化合物的药学上可接受的盐；
其中，所述m，n独立地选自0-6的整数；
所述mPEG的分子量选自400-20000；优选1000-10000；
在一些具体实施例中，mPEG选自mPEG 400、mPEG600、mPEG1000、mPEG2000、mPEG3000、mPEG4000、mPEG6000、mPEG10000或mPEG20000。
进一步地，所述m，n独立地选自0-4的整数。
在一些具体实施例中，式W-1B-mPEG化合物具体为化合物式W-1B-mPEG-02：
上述式W-1B-mPEG化合物可以但不限于按如下的方案进行合成，步骤如下：
1)Boc-ICT与卤代醇反应得1；
2)化合物1与Boc2O反应得化合物2；
3)化合物2脱保护得化合物3
4)mPEG与反应得4；
所述m选自0-6的整数；
5)化合物3与化合物4在缩合剂存在下反应生成化合物5：
6)化合物5脱保护得化合物W-1B-mPEG；
其中，所述缩合过程可以用到缩合剂；缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/4-二甲氨基吡啶(EDCI/DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三唑/N,N-二异丙基乙胺(EDCI/HOBT/DIPEA)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/N,N-二异丙基乙胺(HATU/DIPEA)、二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)中的至少一种；
所述缩合剂用量为0.1-25当量；
所述缩合反应时的反应温度为0-70℃。
在一些反应中，需要提供碱性条件，所述碱选自三乙胺、吡啶、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钾、硫酸钠中的至少一种；用量为0.05-10当量；
在一些反应中，反应在溶剂中进行，所述溶剂选自但不限于二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、丙酮、乙腈或甲苯。
本发明还提供一种药物组合物，其中含有治疗有效量的本发明所述的淫羊藿苷元衍生物或其药理学上可接受的盐。具体地说，盐是药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的”包括物质或组合物必须是适合化学或毒理学，与组成制剂的其他组分和用于治疗的哺乳动物有关。本发明的化合物的盐还包括用于制备或纯化化合物(式W-1B-mPEG)及其中间体(如中间体2、4)或化合物分离的对映异构体(如中间体2)的盐，但不一定是药学上可接受的盐。
如果本发明的化合物是碱性的，则想得到的盐可以通过文献上提供的任何合适的方法制备得到，例如，使用无机酸、如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等等。或者使用有机酸，如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、苹果酸、2-羟基丙酸、枸橼酸、草酸、羟乙酸和水杨酸；吡喃糖酸，如葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸；α-羟酸，如柠檬酸和酒石酸；氨基酸，如天门冬氨酸和谷氨酸；芳香族酸，如苯甲酸和肉桂酸；磺酸，如对甲苯磺酸，苯磺酸，甲磺酸，乙磺酸，三氟甲磺酸等等或它们的组合。
如果本发明的化合物是酸性的，则想得到的盐可以通过合适的方法制备得到，如，使用无机碱或有机碱，如氨(伯氨、仲氨、叔氨)、碱金属氢氧化物、铵、N+(R14)4的盐和碱土金属氢氧化物，等等。合适的盐包括，但并不限于，从氨基酸得到的有机盐，如甘氨酸和精氨酸，氨，如伯氨、仲氨和叔氨，N+(R14)4的盐，如R14是H、C1-4烷基、C6-10芳基、C6-10芳基C1-4烷基等，和环状氨，如哌啶，吗啉和哌嗪等，和从钠，钙，钾，镁，锰，铁，铜，锌，铝和锂得到无机盐。也包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,descr1B-mPEGepharmaceuticallyacceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19,1977.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，苹果酸盐，2-羟基丙酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1-4烷基)4的盐。
药物组合物。该药物组合物可以制成固体口服制剂、液体口服制剂、注射剂等剂型。例如，药物组合物可以以片剂、胶囊、丸剂、粉末、缓释剂、溶液、悬浮液的形式口服给药；药物组合物也可以以无菌液、悬浮液或乳液的形式肠胃外注射给药；药物组合物也可以以软膏或霜膏的形式局部给药；药物组合物也可以以栓剂的形式直肠给药。药物组合物可以做成单位剂型，其适于精确剂量的单一给药。所述固体及液体口服制剂包括：片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂、注射剂。非肠道给药制剂可以制成注射液、冻干粉针等剂型，局部给药可以制成如霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。但并不限于此。所用的口服制剂可以含有例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。
可采用乳糖或淀粉作为所述固体口服制剂的载体；使用明胶、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉浆等作为粘合剂；使用淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲淀粉钠、低取代羟丙甲纤维素、交联聚维酮、微晶纤维素作为崩解剂；使用滑石粉、微粉硅胶、硬脂酸甘油酯、硬脂酸钙或镁作为抗粘合剂和润滑剂。用于片剂制剂的适宜的可药用赋形剂包括例如，惰性稀释剂例如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙；制粒和崩解剂例如玉米淀粉和藻酸；粘合剂例如淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧剂，例如抗坏血酸。片剂制剂可以是未包衣的，也可以采用包衣以改变其崩解作用以及活性成分在胃肠道内的后续吸收作用，或改进其稳定性和/或外观，在任意情况中，均可使用该领域熟知的常规包衣剂和方法。
所述固体口服制剂的制备方法包括以下步骤：将活性成分与载体以及选择性地与一份崩解添加剂组成混合物，然后使该混合物与粘合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行湿法或干法制粒，随后加入其它的崩解剂、润滑剂和抗粘剂制成适当的制剂。
本发明药物组合物也可以采用水包油的乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如液体石蜡或者它们的混合物。适当的乳化剂可以是例如，天然树胶例如阿拉伯胶或西黄芪胶，天然磷脂例如大豆卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇一油酸酯)，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，本发明的系列化合物还可以通过非肠道形式给药。优选的非肠道给药形式为注射剂给药。糖浆剂和酏剂可与甜味剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿司帕坦或蔗糖)配制，并且也可含有缓和剂、防腐剂、矫味剂和/或着色剂。
所述药物组合物还可以是注射用无菌水性或油性混悬剂的形式，其可以按照已知方法利用一种或多种适宜的分散或湿润剂和助悬剂来配制，这些试剂如上所述。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的注射用无菌水性或油性混悬剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以根据被治疗宿主和具体给药途径的不同，来确定与一种或多种赋形剂混合以制备单一剂量形式活性成分的量。例如，用于对人口服给药的制剂一般含有例如0.5mg-2g的活性剂以及适当的和常规量的赋形剂(约占组合物总重的5-98％)。单位制剂中一般约含有1mg-500mg的活性成分。
本发明中的mPEG+数字的形式，其意义均为该数字分子量的mPEG，如mPEG1000，即分子量为1000的mPEG。本发明所述的分子量均为重均分子量。
本发明的又一个目的在于提供一种药物组合物，其中含本发明所述的淫羊藿苷元衍生物或其药理学上可接受的盐。
本发明的又一个目的在于提供淫羊藿苷元衍生物及其药理学上可接受的盐在制备治疗哮喘或骨髓抑制方面药物的用途。
本发明淫羊藿苷元衍生物对于哮喘的治疗效果显著优于淫羊藿苷元。本发明淫羊藿苷元衍生物对于放疗或化疗引起的骨髓抑制的治疗效果显著优于淫羊藿苷元。本发明淫羊藿苷元衍生物的生物利用度明显优于淫羊藿苷元，这表明本发明中的化合物在成药性方面具有明显的技术优势。
本发明淫羊藿苷元衍生物对于哮喘的治疗效果显著优于式Ⅰ化合物。本发明淫羊藿苷元衍生物对于放疗或化疗引起的骨髓抑制的治疗效果显著优于式Ⅰ化合物。本发明淫羊藿苷元衍生物的生物利用度明显优于式Ⅰ化合物，这表明本发明中的化合物在成药性方面具有明显的技术优势。更为重要的是，长毒实验研究发现式Ⅰ化合物具有一定的肝肾毒性、导致雌性大鼠乳腺增生等副作用，而本发明化合物无明显毒性，相较于式Ⅰ化合物，其临床使用安全性高。
式Ⅰ化合物为文献(Dell'Agli M,Galli G V,Dal C E,et al.Potent inhibitionof human phosphodiesterase-5by icariin derivatives.[J].Journal of NaturalProducts,2008,71(9):1513-1517.)中的化合物5。式Ⅰ化合物结构式如下:
具体实施方式
以下通过具体的实施方式的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。但不应将实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明的上诉思想的情况下，本领域技术人员根据本领域普通技术知识和常规手段作出的各种替换手段或变更，均包含在本发明之内。
实施例1
称取原料Boc保护的淫羊藿苷元(Boc-ICT)500mg(1.1mmol)置于100ml茄形瓶中，加入20ml丙酮作为溶剂，加入碳酸钾188mg(1.4mmol)和2-溴乙醇0.1ml(1.4mmol)，回流直至反应完全，减压蒸馏旋干溶剂，乙酸乙酯溶解，柱层析纯化得固体产物1。
固体产物1的MS：512.6。
实施例2
将固体产物1 500mg(1.4mmol)溶于15ml二氯甲烷中，加入BOC2O-265mg(1.4mmol)，碳化二亚胺(EDCI)240mg(1.5mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)25mg(0.2mmol)，室温搅拌1h，待反应完全，减压蒸馏旋干溶剂，乙酸乙酯溶解，柱层析纯化得固体产物2,收率85％。
固体产物2的MS：597.0。
1H NMR(300MHz,CDCl3):12.03(s,1H),8.90(s,6H),7.97(d,J＝8.7Hz,2H),7.2(d,J＝9.0Hz,2H),6.94(s,1H),3.97(s,3H),3.68(s,2H),3.47(s,1H),2.83(s,1H),1.63(s,12H).ESI-MS(m/z):511[M+H]+.
实施例3
将2 0.8mmol产品置于100ml茄形瓶中，加入50ml二氯甲烷作为溶剂，保温-10℃，加入三氟乙酸3ml，反应完全后，柱层析分离，得固体产物3 340mg，收率91％。固体产物3的MS：496.7。
实施例4
称取mPEG2000 2g(1mmol，在实施例7-14中换成mPEG400、mPEG600、mPEG1000、mPEG2000、mPEG3000、mPEG4000、mPEG6000、mPEG10000或mPEG20000，相应地改变质量与溶剂体积)置于100ml茄形瓶中，加入15ml三氯甲烷作为溶剂，加入丁二酸酐1g(10mmol)和吡啶4ml，于70℃反应。待反应完全后，旋干溶剂，加入饱和碳酸氢钠溶液，加入盐酸调节pH至酸性，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，干燥，旋干，乙醚重结晶，得白色固体中间体41.6g，收率73％。固体产物4的MS：292.5。
实施例5
称取固体产物3 90mg(0.36mmol)和固体产物4 220mg(0.1mmol)置于100ml茄形瓶中，加入20ml干燥二氯甲烷作为溶剂，室温搅拌下加入DCC 41mg(0.2mmol)和DMAP 25mg(0.2mmol)，室温搅拌反应。反应完全后，过滤，水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，柱层析分离(二氯甲烷：丙酮＝40:1-10:1梯度洗脱)，得黄色固体5 210mg，收率78％。
实施例6化合物W-1B-mPEG-02的合成。
将5 0.8mmol产品置于100ml茄形瓶中，加入15ml二氯甲烷作为溶剂，冰浴中冷却，加入三氟乙酸5ml，反应完全后，柱层析分离，得固体产物W-1B-mPEG-02，具体为W-1B-mPEG-02-2000340mg，收率91％。
固体产物W-1B-mPEG-02的MS：2525.3。
实施例7-14
将实施例2中的mPEG分别采用mPEG400、mPEG600、mPEG1000、mPEG3000、mPEG4000、mPEG6000、mPEG10000或mPEG20000。重复其它步骤，分别得产物，见表1：
表1 实施例7-14及其产物
实施例15本发明化合物对肿瘤小鼠化疗引起的骨髓抑制的影响
1.模型制备及分组给药：选取Balb/C小鼠84只，称重，随机分成7组，分别为正常组、空白对照组、淫羊藿苷元组、式Ⅰ组、本发明化合物各给药组，每组12只。小鼠每天腹腔注射50mg/kg环磷酰胺，连续一周可使血小板数量显著降低。造模开始前一周各治疗组分别给予下述治疗药物：
正常组：给予等体积的羧甲基纤维素钠；
空白对照组：给予等体积的羧甲基纤维素钠；
淫羊藿苷元组：灌胃给予5mg/kg淫羊藿苷元；
式Ⅰ组：灌胃给予5mg/kg式Ⅰ化合物；
W-1B-mPEG-02-600组：灌胃给予0.5mg/kg化合物W-1B-mPEG-02-600；
W-1B-mPEG-02-3000组：灌胃给予0.5mg/kg化合物W-1B-mPEG-02-3000；
W-1B-mPEG-02-10000组：灌胃给予0.5mg/kg化合物W-1B-mPEG-02-10000；
各治疗组每天给药一次，正常饲喂。连续给药3周后，麻醉小鼠，取血，检测白细胞和血小板数量，考察本发明化合物对白细胞和血小板的影响。
2.实验结果
通过本实施例本发明各化合物对环磷酰胺致小鼠白细胞和血小板的影响(表2)发现，本发明各化合物具有预想不到的缓解化疗产生的骨髓抑制的效果。
与模型对照组相比，本发明各化合物组的白细胞总数和血小板总数均有增高，并有极显著性差异。
与淫羊藿苷元组相比，本发明各化合物组的白细胞总数和血小板总数增高，有显著性差异。
与式Ⅰ组相比，本发明各化合物组的白细胞总数和血小板总数增高，有显著性差异。
表2 各化合物对环磷酰胺所致白细胞和血小板减少的影响
与空白对照组比较，$p<0.05，$$p<0.01；
与淫羊藿苷元组比较，#p<0.05，##p<0.01；
与式Ⅰ组比，&p<0.05，&&p<0.01。
实施例16本发明化合物对60Co放射小鼠血细胞数量的影响
1.模型制备及分组给药：选取昆明小鼠100只。除正常组(10只)外，都其他各组小鼠进行4Gy照射60Co放射，采用一次性全身照射，吸收剂量为4Gy，吸收剂量率为0.88Gy/min。于辐射后的第3、7、10d分别眶静脉取血检测全血细胞数。将连续两次全血细胞测定中白细胞数量低于3.0×109/L或者血小板数量少于500×109/L的小鼠剔出，剩余小鼠即为实验用小鼠。
将照射后符合实验要求的小鼠随机分为以下模型组、淫羊藿苷元组、式Ⅰ组、W-1B-mPEG-02-600组、W-1B-mPEG-02-3000组、W-1B-mPEG-02-10000组，每组10组，雌雄各半。各组分别按如下方式处理或给药。
正常组：给予等体积的羧甲基纤维素钠；
空白对照组：给予等体积的羧甲基纤维素钠；
淫羊藿苷元组：腹腔注射1mg/kg淫羊藿苷元；
式Ⅰ组：腹腔注射1mg/kg式Ⅰ化合物；
W-1B-mPEG-02-600组：腹腔注射0.1mg/kg化合物W-1B-mPEG-02-600；
W-1B-mPEG-02-3000组：腹腔注射0.1mg/kg化合物W-1B-mPEG-02-3000；
W-1B-mPEG-02-10000组：腹腔注射0.1mg/kg化合物W-1B-mPEG-02-10000；
各治疗组每天给药一次，正常饲喂。连续给药10天后，麻醉小鼠，取血，检测白细胞和血小板数量，考察本发明化合物对白细胞和血小板的影响。
2.实验结果
通过本实施例本发明各化合物对接受60Co放射小鼠白细胞和血小板的影响(表3)发现，本发明各化合物具有预想不到的缓解放疗产生的骨髓抑制的效果。
与模型对照组相比，本发明各化合物组的白细胞总数和血小板总数均有增高，并有显著性差异。
与淫羊藿苷元组相比，本发明各化合物组的白细胞总数和血小板总数增高，有显著性差异。
与式Ⅰ组相比，本发明各化合物组的白细胞总数和血小板总数增高，有显著性差异。
表3 各化合物对60Co放射小鼠血细胞数量的影响
与空白对照组比较，$p<0.05，$$p<0.01；
与淫羊藿苷元组比较，#p<0.05，##p<0.01；
与式Ⅰ组比，&p<0.05，&&p<0.01。
实施例17本发明化合物对气道平滑肌的抑制作用
气道重塑是支气管哮喘的重要病理特征，气道平滑肌细胞(ASMC)是引起气道重塑的主要效应细胞。重症哮喘患者与正常人相比，ASM C量明显增多，这一现象主要是由平滑肌细胞增生引起的。
1.1材料
150～200g SD大鼠；D M EM培养基(Gibico公司)；胎牛血清(杭州四季青有限公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)。
1.2实验方法
1.2.1大鼠A SM C的培养
按相关文献的方法：在无菌条件下，纵形剖开气管，小心剥离外膜并轻轻刮除内膜，用眼科剪将气管段小心剪成lmm×1mm×1mm的小组织块，贴于5cm×5cm的培养瓶底面，等距排列，加入含25％胎牛血清的D M EM(高糖)培养基2mL，不使培养液接触组织块。将培养瓶底面向上，于37℃和5％二氧化碳的孵箱中绝对静置约3h，使组织块接近干涸，轻轻翻转培养瓶，使培养液刚好没过组织块表面，半开放式绝对静置培养3d后将培养液添至5mL，6d后全换液，此后3d换液1次。约7d长满后传代培养，实验选用第4～5代细胞。培养的大鼠ASM C经形态学方法鉴定。
1.2.2CCK-8法检测大鼠ASMC的增殖
取培养的第4代大鼠ASMC，制成单细胞悬液，按1×104个/孔接种于96孔培养板，37℃和5％二氧化碳的条件下培养24h，待细胞生长呈融合状时，加入含0.1％胎牛血清的培养液(使细胞生长停滞于G 0期)继续培养24h。
换用含1％胎牛血清的培养液，随机分为：
对照组，每孔只加入DMEM；
淫羊藿苷元组，淫羊藿苷元浓度为1×10-6mol/L；
式Ⅰ组：式Ⅰ化合物浓度为1×10-6mol/L；
W-1B-mPEG-02-600组：化合物W-1B-mPEG-02-600浓度为1×10-6mol/L；
W-1B-mPEG-02-3000组：化合物W-1B-mPEG-02-3000浓度为1×10-6mol/L；
W-1B-mPEG-02-10000组：化合物W-1B-mPEG-02-10000浓度为1×10-6mol/L；
每组设置5个复孔，同时每组均设置空白组(不含细胞，但DMEM浓度与相应组保持一致)。予37℃和5％二氧化碳的条件下培养48h后，每孔加入CCK-8试剂10μL，继续培养4h，在波长450nm处，检测各孔OD值。根据公式计算各组细胞的生长抑制率：细胞生长抑制率＝1-[(各给药组OD值-相应空白组OD值)/(对照组OD值-相应空白组OD值)]×100％。2结果
2.1 ASMC的鉴定
用倒置相差显微镜观察，发现ASMC未汇合前呈梭形，细胞汇合后部分区域细胞呈束状排列，呈典型的“峰谷”状。
2.2 对ASMC增殖的影响
本发明各化合物作用于ASMC 48h后，与淫羊藿苷元组相比，本发明各化合物组细胞的OD值明显降低，差异有显著性。
与淫羊藿苷元组细胞相比，本发明化合物各组细胞的抑制率均有明显升高，差异有显著性。
与式Ⅰ组细胞相比，本发明化合物各组细胞的抑制率均有明显升高，差异有显著性。(见表4和5)
表4 各化合物作用于ASMC 48h的OD值
与正常对照组比较，$p<0.05，$$p<0.01；
与淫羊藿苷元组比较，#p<0.05，##p<0.01；
与式Ⅰ组比，&p<0.05，&&p<0.01。
表5 各化合物作用于ASMC 48h的抑制率
与淫羊藿苷元组比较，$p<0.05，$$p<0.01；
与式Ⅰ组比，&p<0.05，&&p<0.01。
实施例18本发明化合物生物利用度的测定
1.动物分组及给药
60只Wistar大鼠(270±30)g，雌雄各半，由山东新时代药业有限公司实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(鲁)20060019。在温度20～22℃，相对湿度45％～65％，光照/黑暗12h/12h条件下饲养，自由饮食、饮水。
本发明化合物灌胃给药组：将已禁食12小时自由饮水的健康Wistar大鼠30只，雌雄各半，分为5组，淫羊藿苷元组(灌胃给予淫羊藿苷元)，式Ⅰ组(灌胃给予式Ⅰ化合物)，W-1B-mPEG-02-600组(灌胃给予化合物W-1B-mPEG-02-600)，W-1B-mPEG-02-3000组(灌胃给予化合物W-1B-mPEG-02-3000)，W-1B-mPEG-02-10000组(灌胃给予化合物W-1B-mPEG-02-10000)。各组单次灌胃给药，给药剂量为3mg/kg。给药前12h禁食，自由饮水。分别于给药前(0h)、给药后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24h眼眶后静脉丛取血300μL左右，肝素抗凝，4℃12000rpm条件下离心5min，分离血浆，保存于-20℃低温冰箱中。实验期间自由饮水，灌胃后2h进食。
本发明化合物静脉给药组：将已禁食12小时自由饮水的健康Wistar大鼠30只，雌雄各半，分为5组，淫羊藿苷元组(注射给予淫羊藿苷元)，式Ⅰ组(注射给予式Ⅰ化合物)，W-1B-mPEG-02-600组(注射给予化合物W-1B-mPEG-02-600)，W-1B-mPEG-02-3000组(注射给予化合物W-1B-mPEG-02-3000)，W-1B-mPEG-02-10000组(注射给予化合物W-1B-mPEG-02-10000)。各组尾静脉注射给药，给药剂量为3mg/kg。分别于给药前(0h)、给药后0.033、0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24h眼眶后静脉丛取血300μL左右，肝素抗凝，4℃12000rpm条件下离心5min，分离血浆，保存于-20℃低温冰箱中。实验期间自由进食与饮水。
2.血浆样品测定
将所有经处理过的血浆样品，进行UPLC-MS/MS定量分析，测定血浆药物浓度。
3.生物利用度的计算
将测定的血药浓度－时间数据用DAS软件(Drug and Statistics，中国数学药理学会，孙瑞元等编制)计算药动学参数。根据公式计算各化合物的绝对生物利用度，t为最后可实测药物浓度的采样时间。
4.各化合物的绝对生物利用度
表6 各化合物的生物利用度
由上表可以看出，本发明中的各化合物的生物利用度均明显高于淫羊藿苷元、式Ⅰ化合物，这表明在成药性方面本发明中的化合物具有明显的技术优势。
实施例19本发明化合物W-1B-mPEG-02-600、W-1B-mPEG-02-3000、W-1B-mPEG-02-10000及式Ⅰ化合物大鼠重复注射给药毒性试验研究
SD大鼠分为五组：正常对照组，式Ⅰ化合物组(静脉注射式Ⅰ化合物100mg/kg/d)，W-1B-mPEG-02-600组(静脉注射W-1B-mPEG-02-600100mg/kg/d)，W-1B-mPEG-02-3000组(静脉注射W-1B-mPEG-02-3000100mg/kg/d)，W-1B-mPEG-02-10000组(静脉注射W-1B-mPEG-02-10000100mg/kg/d)。
各组动物连续给药28天，每天给药一次，停药恢复4周。给药期结束时，腹主静脉采集血样，进行血液学、凝血时间、血液生化学及电解质等指标的检测，之后进行系统解剖，大致观察各脏器组织形态，对脑、脾脏、胸腺、心脏、肾脏(双侧)、肝脏、肾上腺(双侧)、乳腺(雌性大鼠)、前列腺(雄性大鼠)进行称重并计算脏器系数。
实验发现，式Ⅰ化合物组大鼠肌酐酸、碱性磷酸酶和谷丙氨酸转移酶水平升高。病理组织学检查可见不同程度的肾小管损伤，出现明显的肾毒性损伤。雌性大鼠乳腺增生。式Ⅰ化合物表现出一定的毒副作用。
本试验条件下，未发现与W-1B-mPEG-02-600毒性相关的异常改变，W-1B-mPEG-02-600注射给药无明显毒性，临床使用安全性较高。
本试验条件下，未发现与W-1B-mPEG-02-3000毒性相关的异常改变，W-1B-mPEG-02-3000注射给药无明显毒性，临床使用安全性较高。
本试验条件下，未发现与W-1B-mPEG-02-10000毒性相关的异常改变，W-1B-mPEG-02-10000注射给药无明显毒性，临床使用安全性较高。

Claims (10)

1.一种淫羊藿苷元衍生物，结构如式W-1B-mPEG所示：
或式W-1B-mPEG化合物的药学上可接受的盐；
其中，所述m，n独立地选自0-6的整数；所述mPEG的分子量选自400-20000。
2.如权利要求1所述的淫羊藿苷元衍生物，其特征在于，所述m、n独立地选自0-4的整数。
3.如权利要求1所述的淫羊藿苷元衍生物，其特征在于，所述mPEG的分子量选自1000-10000。
4.如权利要求1所述的淫羊藿苷元衍生物，其特征在于，所述mPEG的分子量选自mPEG400、mPEG600、mPEG1000、mPEG2000、mPEG3000、mPEG4000、mPEG6000、mPEG10000或mPEG20000。
5.如权利要求1所述的淫羊藿苷元衍生物，其特征在于，式W-1B-mPEG化合物具体为化合物式W-1B-mPEG-02：
6.如权利要求1所述的淫羊藿苷元衍生物，其特征在于，式W-1B-mPEG化合物具体为：
7.如权利要求1所述的淫羊藿苷元衍生物，其特征在于，式W-1B-mPEG化合物的合成步骤如下：
1)Boc-ICT与卤代醇反应得1；
2)化合物1与Boc2O反应得化合物2；
3)化合物2脱保护得化合物3
4)mPEG与反应得4；
所述m选自0-6的整数；
5)化合物3与化合物4在缩合剂存在下反应生成化合物5：
6)化合物5脱保护得化合物W-1B-mPEG；
8.如权利要求1所述的淫羊藿苷元衍生物，其特征在于，所述缩合过程可以用到缩合剂；缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/4-二甲氨基吡啶(EDCI/DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三唑/N,N-二异丙基乙胺(EDCI/HOBT/DIPEA)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/N,N-二异丙基乙胺(HATU/DIPEA)、二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)中的至少一种。
9.一种药物组合物，包含权利要求1-6任一项权利要求所述淫羊藿苷元衍生物或其药理学上可接受的盐，及药学上可接受的辅剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗哮喘，骨髓抑制方面药物的用途。
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