CN110357795A - 一种双胍衍生物、药物组合物、制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

一种双胍衍生物、药物组合物、制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双胍衍生物、药物组合物、制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述双胍衍生物为如下结构化合物：或者其药学可接受的盐、异构体、酯、前药；所述R1和R2为卤素，或者R1为卤素取代的甲基，R2为氢；所述R3为异丁基、乙基、环戊烷或正庚基，R4为氢、甲基或乙基；其可以显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，IC50大大低于衍生化前的氯胍，也大于一般的双胍衍生物；在UMUC3、T24、A2780、A549和HCT116细胞中，本发明双胍衍生物活性较衍生化前的氯胍与现有化合物大大提高。

Description

一种双胍衍生物、药物组合物、制备方法和其在制备抗肿瘤药 物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体是涉及到一种双胍衍生物、药物组合物、制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症发病率和死亡率在世界范围内迅速增长。根据GLOBOCAN 2018癌症发病和死亡推算值，2018年全球将有大约1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例。而新增的1810万癌症病例中，亚洲占据近一半，960万癌症死亡患者中，亚洲占近七成。最新统计数据显示，膀胱癌的发病率在全球肿瘤患者中居于前列，并逐年攀升，在我国男性肿瘤中居第七位。卵巢癌在女性患者中发病率(3.4％)和死亡率(4.4％)均排名前十。肺癌依旧是发病率(11.6％)和死亡率(18.4％)第一位的恶性肿瘤。
双胍类药物虽然显示出抗肿瘤作用，也有多项临床试验正在开展，但是至今没有开发出合适的药物。由于使用剂量过大导致乳酸中毒和胃肠道反应等副作用也一直是限制它在临床上使用的主要原因。开发有较高生物活性和较低副作用的抗癌药物非常重要和迫切。
胍基具有良好的降血糖、抗癌、抗菌的药理作用，但具有抗肿瘤活性所需要的浓度较高，因此需要进一步提升活性效力。
中国专利申请号为201711270053.5的专利公开了氯胍在制备抗肿瘤药物中的应用，以及氯胍在制备抑制肿瘤原发性生长和/或转移性生长药物中的应用。
中国专利号为201280038931.X的专利公开了一种N1-环胺-N5-取代苯基双胍衍生物及其制备方法和含有该衍生物的药物组合物，其结构式如下：
其中，(对比例4)、(对比例6)、(对比例7)等用于抑制癌细胞增殖，从说明书中的具体化合物以及具体效果来看，取代基一般为，R1和R2一起连接至氮原子以形成吡咯烷基等杂环烷基。
中国专利申请公布号为CN107108536A的专利公开了双胍化合物及其用途，常见的R1和R2取代基也是R1和R2一起连接至氮原子以形成吡咯烷基等杂环烷基，当其为单纯的烷基时，一般为异丙基或正丙基等小分子烷基。
双胍衍生物，当其一端被苯基取代时，一般才具有抗癌性能，如果被其他小分子物质取代或者不取代，一般只有抗菌能力；当其一端被苯基取代时，另一端的取代基不能是大分子的取代基，一般不能超过六个碳原子；不然会不利于其发挥药效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种双胍衍生物、药物组合物、制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用，其可以显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，IC50大大低于衍生化前的氯胍，也大于一般的现有双胍衍生物；在UMUC3、T24、A2780、A549和HCT116细胞中，本发明双胍衍生物活性是氯胍与现有化合物的4-8倍，具有成为良好抗肿瘤药物的应用前景。
本发明的内容包括双胍衍生物，为如下结构化合物：
或者其药学可接受的盐、异构体、酯、前药；
所述R1和R2为卤素，或者R1为卤素取代的甲基，R2为氢；
所述R3为异丁基、乙基、环戊烷或正庚基，R4为氢、甲基或乙基。
所述盐为双胍衍生物与酸的加成盐，采用公知的成盐方法制备得到。所述酸优选盐酸、磷酸、硫酸、三氟乙酸、氢溴酸、酒石酸、富马酸、马来酸、枸橼酸、对甲苯磺酸或甲磺酸，最优选为盐酸盐。
上述药物可以制成注射剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、外用贴剂等多种剂型，上述剂型的药物均可按照药学领域的常规方法制备。
优选的，所述R1和R2为卤素，R3为正庚基，R4为氢。
优选的，所述双胍衍生物为1-正庚基-5(3,4-二氟苯基)双胍。
优选的，所述R3为异丁基，R4为氢。
优选的，所述卤素为氟。
优选的，本发明包括如下结构的化合物。
本发明优选的化合物为化合物1、4和6，最优选的为化合物1和化合物6。
本发明提供一种药物组合物，包括双胍衍生物，以及任选的药学可接受的载体或辅料。
本发明提供一种双胍衍生物的制备方法，包括如下步骤：
原料的制备方法包括如下步骤：
本发明还提供一种双胍衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤为肺癌、食道癌、胃癌、膀肌癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌或鼻咽癌。
本发明的有益效果是，本发明的实验结果显示双胍衍生物能显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，IC50大大低于衍化前的二甲双胍和氯胍，其中以化合物1、4和6的活性最好，在UMUC3、T24、A2780和A549细胞中，本发明的双胍衍生物活性是二甲双胍的2000-5000多倍，具有良好抗肿瘤药物的应用前景。
附图说明
图1a为不同化合物对人膀胱癌细胞系UMUC3的抑制效果染色图。
图1b为不同化合物对人膀胱癌细胞系UMUC3的抑制效果柱状图。
图2a为不同化合物对人膀胱癌细胞系T24的抑制效果染色图。
图2b为不同化合物对人膀胱癌细胞系T24的抑制效果柱状图。
图3a为不同化合物对人卵巢癌细胞系A2780的抑制效果染色图。
图3b为不同化合物对人卵巢癌细胞系A2780的抑制效果柱状图。
图4a为不同化合物对人肺癌细胞系A549的抑制效果染色图。
图4b为不同化合物对人肺癌细胞系A549的抑制效果柱状图。
图5a为不同化合物对人结直肠癌细胞系HCT116的抑制效果染色图。
图5b为不同化合物对人结直肠癌细胞系HCT116的抑制效果柱状图。
图6为不同化合物对人膀胱癌细胞系UMUC3迁移的抑制效果图。
图7为不同化合物对人膀胱癌细胞系T24迁移的抑制效果图。
图8为不同化合物对人肺癌细胞系A549迁移的抑制效果图。
图9为不同化合物对人膀胱癌细胞系UMUC3、T24，人肺癌细胞系A549迁移的抑制效果柱状图。
具体实施方式
以下具体的实例用详细说明本发明，但本发明绝非仅限于这些例子(除另有注明外，所用原料均有市售)。
实施例1：中间体1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍的制备
将NaN(CN)2(50g，0.56mol)溶于430mL水中配成溶液，在80℃条件下加入4-三氟甲基苯胺溶液(将45g，0.3mol 4-三氟甲基苯胺溶于水和浓HCl(132mL/23.5mL))，维持80℃，持续反应1h左右，反应液中逐渐析出白色粉末状固体，TLC检测反应液直至不含4-三氟甲基苯胺，即反应结束。过滤、真空干燥，得1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍，收率95.5％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),7.66(d,J＝8.5Hz,2H),7.60(d,J＝8.5Hz,2H)；LC-MS m/z229.0[M+1]+。
实施例2：中间体1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍的制备
将NaN(CN)2(50g，0.56mol)溶于430mL水中配成溶液，在80℃条件下加入3,4-二氟苯胺溶液(将38.7g，0.3mol 3,4-二氟苯胺溶于水和浓HCl(132mL/23.5mL))，维持80℃，持续反应1h左右，反应液中逐渐析出固体，TLC检测反应液直至不含3,4-二氟苯胺，即反应结束。过滤、真空干燥，得1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍，收率95.2％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.50(d,J＝7.5Hz,1H),7.34(dd,J＝18.0,8.9Hz,1H),7.09(d,J＝5.8Hz,1H)；LC-MS m/z197.0[M+1]+。
实施例3：中间体1-(2,4-二氟)苯基-3-氰基胍的制备
将NaN(CN)2(50g，0.5618mob)溶于430mL水中配成溶液，在80℃条件下加入2,4-二氟苯胺溶液(将将38.7g，0.3mol 2,4-二氟苯胺溶于水和浓HCl(132mL/23.5mL))，维持80℃，持续反应1h左右，反应液中逐渐析出固体，TLC检测反应液直至不含2,4-二氟苯胺，即反应结束。过滤、真空干燥，得1-(2,4-二氟)苯基-3-氰基胍，收率94.9％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.87(s,1H),7.59(d,J＝6.2Hz,1H),7.35–7.29(m,1H),7.07(d,J＝8.6Hz,1H)；LC-MS m/z194.8[M-1]-。
实施例4：化合物1的制备
在25-35℃条件下将9.12克(0.04摩尔)1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和16毫升(0.16摩尔)异丁胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体6.85g，收率56.9％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.22(s,1H),7.65(d,J＝13.6Hz,2H),7.62(d,J＝9.4Hz,2H),2.93(d,J＝31.9Hz,2H),1.31–1.19(m,1H),0.89(d,J＝6.2Hz,6H)；LC-MS m/z302.1[M+1]+；熔点为213-215℃。
实施例5：化合物2的制备
在25-35℃条件下将9.12克(0.04摩尔)1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和17毫升(0.16摩尔)二乙胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体4.76g，收率39.5％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.93(s,1H),7.72(s,2H),7.65(d,J＝8.7Hz,2H),7.60(d,J＝8.7Hz,2H),3.40–3.34(m,4H),1.18–1.04(m,6H)；LC-MS m/z302.1[M+1]+；熔点215-217℃。
实施例6：化合物3的制备
在25-35℃条件下将9.12克(0.04摩尔)1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和14毫升(0.16摩尔)甲乙胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体6.80g，收率59.2％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.81(s,1H),7.74(s,2H),7.65(d,J＝8.0Hz,2H),7.61(d,J＝7.6Hz,2H),3.37(q,J＝7.0Hz,2H),2.97(s,3H),1.18–0.96(m,3H)；LC-MS m/z288.0[M+1]+；熔点为201-203℃。
实施例7：化合物4的制备
在25-35℃条件下将9.12克(0.04摩尔)1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和16毫升(0.16摩尔)环戊胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(4-三氟甲基)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到灰白色固体6.47g，收率51.7％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.54(s,1H),8.19(s,1H),7.64(d,J＝4.1Hz,2H),7.58(d,J＝7.5Hz,2H),3.93–3.72(m,1H),1.96–1.60(m,4H),1.56–1.40(m,4H)；LC-MSm/z314.1[M+1]+；熔点为225-227℃。
实施例8：化合物5的制备
在25-35℃条件下将7.84克(0.04摩尔)1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和和16毫升(0.16摩尔)异丁胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体7.06g，收率65.6％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.63(s,1H),8.12(s,1H),7.88–7.67(m,1H),7.64–7.48(m,1H),7.36(d,J＝7.6Hz,1H),3.02–2.85(m,2H),1.87–1.66(m,1H),,0.86(d,J＝33.4Hz,6H)；LC-MS m/z270.0[M+1]+；熔点179-181℃。
实施例9：化合物6的制备
在25-35℃条件下将7.84克(0.04摩尔)1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和24毫升(0.16摩尔)庚胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14gEDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体7.50g，收率60.3％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.98–9.78(m,1H),8.09(s,1H),7.74(d,J＝22.0Hz,1H),7.42–7.32(m,1H),7.10(d,J＝8.9Hz,1H),3.14–3.05(m,2H),1.58–1.37(m,2H),1.33–1.16(m,8H),0.90–0.81(m,3H).；LC-MS m/z309.9[M-1]-；熔点为119-121℃。
实施例10：化合物7的制备
在25-35℃条件下将7.84克(0.04摩尔)1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和16毫升(0.16摩尔)环戊胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体8.01g，收率71.3％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.85(s,1H),8.12(s,1H),7.74(d,J＝30.2Hz,1H),7.43–7.27(m,1H),7.10(d,J＝5.0Hz,2H),3.96–3.75(m,1H),1.98–1.61(m,4H),1.59–1.39(m,4H)；LC-MS m/z282.1[M+1]+；熔点为215-217℃。
对比例1
在25-35℃条件下将7.84克(0.04摩尔)1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和14毫升(0.16摩尔)异丙胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体4.74g，收率46.5％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.63(s,1H),8.02(s,1H),7.74(d,J＝35.8Hz,1H),7.63–7.49(m,1H),7.36(d,J＝8.1Hz,1H),7.10(d,J＝8.0Hz,2H),6.75(s,1H),3.86–3.58(m,1H),1.12(d,J＝6.5Hz,6H)；LC-MS m/z256.1[M+1]+；熔点223-225℃。
对比例2
在25-35℃条件下将7.84克(0.04摩尔)1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和17毫升(0.16摩尔)二乙胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(3,4-二氟)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到黄色固体4.55g，收率42.3％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.72(s,1H),7.55(d,J＝10.2Hz,1H),7.37(dd,J＝19.2,9.4Hz,1H),7.11(d,J＝6.4Hz,1H),3.41–3.33(m,4H),1.28–0.98(m,6H)；LC-MS m/z270.1[M+1]+；熔点178-180℃。
对比例3
在25-35℃条件下将7.84克(0.04摩尔)1-(2,4-二氟)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和16毫升(0.16摩尔)异丁胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(2,4-二氟)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，得到灰色固体5.90g，收率54.8％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.09(s,1H),7.89(s,1H),7.29(d,J＝17.6Hz,1H),7.11–7.03(m,1H),6.97(d,J＝20.3Hz,1H),2.92(d,J＝17.0Hz,2H),1.83–1.61(m,1H),0.87(d,J＝19.6Hz,6H)；LC-MS m/z267.9[M-1]-；熔点189-191℃。
对比例4
在25-35℃条件下将7.84克(0.04摩尔)1-(2,4-二氟)苯基-3-氰基胍边搅拌边加入48毫升四氢呋喃(THF)和40毫升水中，随后加入6.8克(0.085摩尔)五水硫酸铜和16毫升(0.16摩尔)环戊胺。加热至40℃，持续搅拌反应。检查TLC中是否存还存在1-(2,4-二氟)苯基-3-氰基胍后，减压蒸馏将四氢呋喃蒸干。待反应物冷却至25-30℃时，加入HCl溶液(20ml浓盐酸在32ml水中)并搅拌30分钟，滴加冷却的氨性EDTA溶液(32ml水，15ml氨水(25％)和14g EDTA二钠盐)至反应混合物中，保持温度范围为15-20℃。加完后，在相同温度下搅拌30分钟，过滤分离的产物，反复用冷水洗涤，在90-95℃温度下干燥，，得到黄色固体9.13g，收率81.2％。
结构验证：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.79(s,1H),8.10–7.93(m,1H),7.65(s,2H),7.31(t,J＝8.7Hz,1H),7.10–7.05(m,1H),6.84(s,1H),4.00–3.64(m,1H),1.95–1.57(m,4H),1.57–1.34(m,4H)；LC-MS m/z282.1[M+1]+；熔点217-219℃。
实验例1：药物IC50值测定
一、实验材料
人膀胱癌细胞系UMUC3购自上海兴泊生物科技有限公司；
人膀胱癌细胞系T24购自上海兴泊生物科技有限公司；
人卵巢癌细胞系A2780购自上海兴泊生物科技有限公司；
人肺癌细胞系A549购自上海兴泊生物科技有限公司；
人结直肠癌细胞系HCT 116购自上海兴泊生物科技有限公司；
氯胍购自Sigma-Aldrich公司；
MTT购自Sigma-Aldrich公司。
二、实验方法及结果
取处于对数期的人膀胱癌细胞系UMUC3、人膀胱癌细胞系T24、人卵巢癌细胞系A2780、人肺癌细胞系A549和人结直肠癌细胞系HCT116分别按照每孔8000个细胞进行种板，将接种完的培养板均放置于培养箱中过夜，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6分别用0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM的药物处理，对比例1、2、3、4、5、6、7的化合物分别用0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM的药物处理，处理完成后将培养板均放回培养箱中培养72小时，然后用MTT比色法检测细胞生存率，并分别计算IC50值，实验结果如表1-5所示。
表1对膀胱癌细胞UMUC3生长的抑制效果
表2对膀胱癌细胞T24生长的抑制效果
表3对卵巢癌细胞系A2780生长的抑制效果
表4对肺癌细胞A549生长的抑制效果
表5对结直肠癌细胞系HCT116生长的抑制效果
从上述表1-5的数据来看，化合物1、4、6的效果明显优于其他化合物，且化合物1、2、3、4、5、6的活性明显优于现有化合物对比例5、6、7，说明R1和R2为卤素、R3为烷基或环烷基的化合物的活性明显优于R1和R2为卤素、R3为环戊烷，以及R1和R2为卤素或卤素取代的甲烷、R3为氨基哌啶或氨基吡咯时的化合物。
实验例2：细胞克隆试验
一、实验材料
10％的福尔马林购自国药集团化学试剂有限公司；
结晶紫染液购自Sigma-Aldrich公司。
二、实验方法及结果
取处于对数生长期的人膀胱癌细胞系UMUC3、人膀胱癌细胞系T24、人卵巢癌细胞系A2780、人肺癌细胞系A549和人结直肠癌细胞系HCT116，分别按照每孔8000个细胞接种于24孔培养板，将接种完的培养板均放置在培养箱中过夜，使细胞贴壁；人膀胱癌细胞系UMUC3、人膀胱癌细胞系T24分别给予0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM的药物处理，人卵巢癌细胞系A2780给予0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM的药物处理，人肺癌细胞系A549给予0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM的药物处理，人结直肠癌细胞系HCT116分别给予0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM的药物处理，；处理完后将培养板均放回培养箱中继续培养两周；待细胞融合至80％后，倒掉培养液，用PBS洗一遍，10％的福尔马林固定1个小时，用并500μL结晶紫染液染色一个小时，最后回收结晶紫染液；之后，分别将24孔板流水冲洗干净，并将24孔板倒置放在滤纸上，干燥后用相机拍摄图像并用酶标仪(Biotek，SYNERGY HTX，Vermont，USA)进行定量分析，实验结果如图1-5所示。
由图1-5可以看出，化合物对人膀胱癌细胞系UMUC3、人膀胱癌细胞系T24、人卵巢癌细胞系A2780、人肺癌细胞系A549和人结直肠癌细胞系HCT116的集落形成均具有明显的抑制作用，并且随着化合物浓度的升高，对人膀胱癌细胞系UMUC3、人膀胱癌细胞系T24、人卵巢癌细胞系A2780、人肺癌细胞系A549和人结直肠癌细胞系HCT116的集落形成的抑制作用增强，即化合物对人膀胱癌细胞系UMUC3、人膀胱癌细胞系T24和人卵巢癌细胞系A2780的集落形成的集落形成的抑制作用呈现浓度依赖性，且化合物1、化合物4、化合物6对癌细胞的抑制效果明显强于对比例。
实验例3：细胞划痕试验
一、实验方法及结果
取处于对数生长期的人膀胱癌细胞系UMUC3、人膀胱癌细胞系T24，人肺癌细胞系分别按照每孔6*105个细胞接种于6孔培养板，将接种完的培养板均放置在培养箱中使细胞融合至70％-80％。用marker笔在6孔板背后用直尺在中间划一个十字作为固定监测点，使前后观察时位置固定。用10μL枪头比着直尺于背后的横线划痕。PBS洗细胞一次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。然后膀胱癌细胞系UMUC3、T24分别给予3μM的药物处理，肺癌细胞系给予2μM的药物处理，放入37度5％CO2培养箱培养。分别于0，24，48小时用显微镜(Leica，DFC450C，Wetzlar，Germany)拍摄图像。实验结果如图6-9所示。由图可以看出，化合物1、4、6对人膀胱癌细胞系T24、人膀胱癌细胞系UMUC3、人肺癌细胞系A549的迁移抑制效果明显优于氯胍与现有化合物对比例5。

Claims (10)

1.一种双胍衍生物，其特征是，所述双胍衍生物为如下结构化合物：
或者其药学可接受的盐、异构体、酯、前药；
所述R1和R2为卤素，或者R1为卤素取代的甲基，R2为氢；
所述R3为异丁基、乙基、环戊烷或正庚基，R4为氢、甲基或乙基。
2.如权利要求1所述的双胍衍生物，其特征是，所述R1和R2为卤素，R3为正庚基，R4为氢。
3.如权利要求1所述的双胍衍生物，其特征是，所述双胍衍生物为1-正庚基-5(3,4-二氟苯基)双胍。
4.如权利要求1所述的双胍衍生物，其特征是，所述R3为异丁基，R4为氢。
5.如权利要求1-4任一项所述的双胍衍生物，其特征是，所述卤素为氟。
6.一种药物组合物，其特征是，包括如权利要求1-5任一项所述的双胍衍生物，以及任选的药学可接受的载体或辅料。
7.一种如权利要求1-5任一项所述的双胍衍生物的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
9.一种如权利要求1-5任一项所述的双胍衍生物或者如权利要求6所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，所述肿瘤为肺癌、食道癌、胃癌、膀肌癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、白血病、前列腺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌或鼻咽癌。
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