CN110354113A - 一种龙脑衍生物抗菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种龙脑衍生物抗菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种4‑醛基苯甲酸龙脑酯及其制备方法和抗菌应用，该4‑醛基苯甲酸龙脑酯以龙脑和4‑醛基苯甲酸为原料，通过一步酯化反应形成龙脑酯化衍生物作为抗菌小分子物质。该4‑醛基苯甲酸龙脑酯对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(如铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌)等具有较强的抗菌作用，同时具有良好的生物相容性、无毒性等特点。此外，本发明的原料和试剂易得，制备方法简便，产物在医学、食品、卫生等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种龙脑衍生物抗菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于合成医药小分子技术领域，涉及一种龙脑衍生物抗菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
细菌感染一直是一个令人关注的问题，但由于其快速传播和发展而使医疗保健行业陷入困境。抗生素在治疗和控制微生物感染中发挥着至关重要的作用，但随着抗生素的持续使用，导致细菌多重药性的现象日趋严重，这使得许多常规抗生素对细菌感染的疗效降低或者无效。因此，开发出有效的治疗方案或者新型抗菌剂显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术存在的问题提供一种龙脑衍生物抗菌小分子物质，该抗菌小分子物质对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(如铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌)等具有较强的抑制细菌生长和杀菌作用，同时具有良好的生物相容性、无毒性等特点。
本发明的目的之二在于提供上述抗菌小分子物质的制备方法，采用该方法制备抗菌小分子物质，工艺简单，成本低廉，产品结构简单且具有高效抑制细菌生长和杀菌作用，在包括医辽、食品、卫生及环保领域上具有广泛的应用价值。
为此，本发明第一方面提供了一种龙脑衍生物抗菌剂，其为4-醛基苯甲酸龙脑酯，由4-醛基苯甲酸和龙脑经酯键结合组成，其分子结构如式(I)所示：
在本发明的一些实施例中，所述龙脑包括L-龙脑、D-龙脑和Iso-龙脑中的一种或几种。
本发明中，所述龙脑衍生物抗菌剂包括4-醛基苯甲酸L-龙脑酯、4-醛基苯甲酸D-龙脑酯和4-醛基苯甲酸Iso-龙脑酯中的一种或几种。
本发明中，所述龙脑衍生物抗菌剂能够抑制细菌生长和杀死细菌。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的龙脑衍生物抗菌剂的制备方法，其包括：将4-醛基苯甲酸和龙脑化合物在第I溶剂中混合均匀，在催化剂和脱水剂存在条件下进行酯化反应，制得龙脑衍生物抗菌剂粗产品。
本发明中，所述龙脑化合物包括L-龙脑、D-龙脑、Iso-龙脑中的一种或几种。
在本发明的一些实施例中，所述的催化剂包括4-二甲氨基吡啶、对甲基苯磺酸和浓硫酸中的一种或几种。
在本发明的一些实施例中，所述的脱水剂包括N，N’-二环己基碳二亚胺、碳化二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙酰氯和亚硫酰氯中的一种或几种。
在本发明的一些实施例中，对于第I溶剂没有特别的限制，只要能够使原料溶解，且不会妨碍反应进行即可，所述第I溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺中的一种或几种。
在本发明的一些实施例中，4-醛基苯甲酸和龙脑化合物的摩尔比为(1-2)∶1；催化剂和龙脑化合物的摩尔比为(0.1-0.5)∶1；脱水剂和龙脑化合物的摩尔比为(1-3)∶1。
在本发明的一些实施例中，所述酯化反应的温度为20-40℃，优选为25-30℃。
在本发明的一些实施例中，所述酯化反应的时间为12-48h，优选为12-36h。
根据本发明的一些实施方式，在制备龙脑衍生物抗菌剂粗产品的步骤之后还包括分离纯化抗菌小分子物质的步骤：先通过减压抽滤脱除大部分脱水剂；再在第II溶剂中进一步沉降提纯；然后利用第III混合溶剂通过柱层析分离，制得抗龙脑衍生物抗菌剂。
本发明中对于第II溶剂没有特别的限制，例如，所述第II溶剂包括石油醚和/或乙醚。
本发明中，所述第III混合溶剂为石油醚与乙酸乙酯的混合液。
在本发明的一些实施例中，所述石油醚与乙酸乙酯的混合液中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为10∶1。
本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的龙脑衍生物抗菌剂或如本发明第二方面所述的方法制备的龙脑衍生物抗菌剂对在制备抗菌产品中的应用。
本发明所制备得到的4-醛基苯甲酸龙脑酯抗菌小分子物质对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)，革兰氏阴性菌(如铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌)具有较强的抗菌活性，同时该抗菌小分子物质具有良好的生物相容性、无毒性特点，可作为小分子抑菌和杀菌剂用于医辽、食品、卫生及环保等领域，具有较大的发展潜力。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1为本发明实施例1中分子结构如式(I)所示的抗菌小分子物质的制备流程图。
图2为本发明实施例1制备而成的4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)的FT-IR图谱。
图3为本发明实施例1制备而成的4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)的1H NMR图谱。
图4为本发明实施例7生物相容性实验中的BF的细胞毒性分析图；
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
I、术语
本发明中所述用语“龙脑衍生物抗菌剂”与“龙脑衍生物抗菌小分子物质”、“抗菌小分子物质”、“4-醛基苯甲酸龙脑酯抗菌小分子物质”、“4-醛基苯甲酸龙脑酯”和“龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质”可以互换使用，均是指分子结构如式(I)所示的抗菌小分子物质。
本发明中所述用语“抗菌”包括“抑菌”和“杀菌”，“抗菌作用”与“抑制细菌生长和杀死细菌”可以互换使用。
所述用语“龙脑”与“龙脑化合物”可以互换使用。
II、实施方案
如前所述，细菌感染一直是一个令人关注的问题，抗生素在治疗和控制微生物感染中发挥着至关重要的作用，但随着抗生素的持续使用，导致细菌多重药性的现象日趋严重，这使得许多常规抗生素对细菌感染的疗效降低或者无效。鉴于此，本发明人对于抑菌杀菌性物质进行了大量的研究。
本发明人注意到龙脑，并设计基于龙脑制备一种抗菌小分子物质。
龙脑，又称冰片，其结构式如式(II)所示，是一种广泛存在于植物中的双环单萜醇，具有广泛的临床医药用价值，如止痛、防腐、镇静。龙脑对人体几乎无毒性，也是一种非常好的渗透增强剂，具有松动细胞壁或增加其渗透性的生理功能，可以帮助一些药物渗透各种生理则屏障，达到目标组织如脑、皮肤、胃粘膜和口腔黏膜等。
中国专利201110147322.5涉及一种(+)-4-甲氧基苯甲酸冰片酯及其制备方法和应用，通过(+)-冰片与4-甲氧基苯甲酸在催化剂作用下进行酯化反应制备得到冰片衍生物，所述衍生物具有低细胞毒性和透血屏障作用，可促进药物穿透血脑屏障。
中国专利201711095399.6涉及一种缬氨酸冰片酯及其制备方法和应用，通过冰片与缬氨酸在催化剂作用下进行酯化反应，以达到抗癫痫和/或抗肿瘤的目的。该发明设计出了缬氨酸冰片酯，具有显著的抗癫痫和抗肿瘤的药理活性，同时具有毒副作用小和作用机制独特等特性。
上述现有技术均没有提及4-醛基苯甲酸龙脑酯(即4-醛基苯甲酸冰片酯)，也没有提及将4-醛基苯甲酸龙脑酯应用于抑制细菌生长和杀死细菌的研究。
本发明人研究发现，通过4-醛基苯甲酸和龙脑化合物酯化反应，可以制得一种抗菌小分子物质，4-醛基苯甲酸龙脑酯，其能够高效抑制细菌生长和杀死细菌。本发明正是基于上述发现做出的。
因此，本发明第一方面所涉及的龙脑衍生物抗菌剂，是通过4-醛基苯甲酸和龙脑化合物酯化反应制得，是由4-醛基苯甲酸和龙脑经酯键结合组成的4-醛基苯甲酸龙脑酯，其分子结构如式(I)所示。4-醛基苯甲酸龙脑酯属于龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质，所述与龙脑抗菌功效相比，能够高效抑制细菌生长和杀死细菌。
本发明中，所述龙脑分子结构式如式(II)所示，其包括L-龙脑、D-龙脑和Iso-龙脑，优选为L-龙脑。
根据构成4-醛基苯甲酸龙脑酯的龙脑的立体化学结构，如，L-龙脑、D-龙脑和Iso-龙脑，而将4-醛基苯甲酸龙脑酯分为4-醛基苯甲酸L-龙脑酯、4-醛基苯甲酸D-龙脑酯和4-醛基苯甲酸Iso-龙脑酯。
因此，所述龙脑衍生物抗菌剂可以是单一组分也可以是混合物，其包括4-醛基苯甲酸L-龙脑酯、4-醛基苯甲酸D-龙脑酯和4-醛基苯甲酸Iso-龙脑酯中的一种或几种，优选为4-醛基苯甲酸L-龙脑酯。
这可以理解为所述4-醛基苯甲酸龙脑酯具有L-龙脑、D-龙脑和Iso-龙脑三种构型，而所述龙脑衍生物抗菌剂可以是分别具有上述三种构型的4-醛基苯甲酸龙脑酯中的任意一种的单一组分，也可以是分别具有上述三种构型的4-醛基苯甲酸龙脑酯中的任意两种或三种的混合物，优选龙脑衍生物抗菌剂为具有L-龙脑构型的4-醛基苯甲酸龙脑酯。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的龙脑衍生物抗菌剂的制备方法，其包括制备龙脑衍生物抗菌剂的步骤：将4-醛基苯甲酸和龙脑在第I溶剂中混合均匀，在催化剂和脱水剂存在条件下进行酯化反应，制得龙脑衍生物抗菌剂粗产品。
本发明中通过4-醛基苯甲酸和龙脑化合物酯化反应制备分子结构如式(I)所示的龙脑衍生物抗菌剂的反应流程如图1所示。
图1所示的反应中，所述龙脑化合物包括L-龙脑、D-龙脑、Iso-龙脑中的一种或几种。
在本发明的一些实施例中，所述的催化剂包括4-二甲氨基吡啶、对甲基苯磺酸和浓硫酸中的一种或几种，优选为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
在本发明的一些实施例中，所述的脱水剂包括N，N’-二环己基碳二亚胺、碳化二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙酰氯和亚硫酰氯中的一种或几种，优选为N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)。
在本发明的一些实施例中，对于第I溶剂没有特别的限制，只要能够使原料溶解，且不会妨碍反应进行即可，所述第I溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等，优选为四氢呋喃(THF)。
在本发明的一些实施例中，4-醛基苯甲酸和龙脑化合物的摩尔比为(1-2)∶1，优选为1.6∶1；催化剂和龙脑化合物的摩尔比为(0.1-0.5)∶1，优选为0.2∶1；脱水剂和龙脑化合物的摩尔比为(1-3)∶1，优选为2∶1。
在本发明的一些实施例中，所述酯化反应的温度为20-40℃，优选为25-30℃，进一步优选为30℃。
在本发明的一些实施例中，上述制备方法中，所述酯化反应的时间为12-48h，优选为12-36h，进一步优选为24h。
根据本发明的一些实施方式，在制备抗菌小分子物质粗产品的步骤之后还包括分离纯化龙脑衍生物抗菌剂的步骤：先通过减压抽滤脱除大部分脱水剂；再在第II溶剂中进一步沉降提纯；然后利用第III混合溶剂通过柱层析分离，制得龙脑衍生物抗菌剂粗产品纯品。
上述分离纯化步骤中，所述第II溶剂包括石油醚和/或乙醚；所述第III混合溶剂为石油醚与乙酸乙酯的混合液；所述石油醚与乙酸乙酯的混合液中石油醚与乙酸乙酯的体积比为10∶1。
在本发明的一些具体实施例中，在制备抗菌小分子物质的步骤结束后，先通过减压抽滤脱除大部分脱水剂，如DCC；再在第II溶剂中进一步沉降提纯至少2次；最后利用第III混合溶剂通过柱层析分离，制得4-醛基苯甲酸龙脑酯纯品。
本发明中对于第II溶剂没有特别的限制，例如，所述第II溶剂为石油醚和/或乙醚。
在本发明的一些实施例中，所述第III混合溶剂为石油醚与乙酸乙酯的混合液，体积比为10∶1。
根据本发明的一些具体实施方式，采用本发明方法制备抗菌小分子物质包括以下步骤：
(1)分别按照4-醛基苯甲酸和龙脑化合物的摩尔比为(1-2)∶1，催化剂和龙脑化合物的摩尔比为(0.1-0.5)∶1，脱水剂和龙脑化合物的摩尔比为(1-3)∶1的量将4-醛基苯甲酸、催化剂如4-二甲氨基吡啶(DMAP)、脱水剂如N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和龙脑化合物依次溶于第I溶剂，例如四氢呋喃(THF)中，反应温度为20-40℃，优选为25-30℃，进一步优选为30℃；酯化反应12-48h，优选为12-36h，进一步优选为24h，得到抗菌小分子物质粗产品。
(2)在制备抗菌小分子物质的步骤结束后，先通过减压抽滤方法除去抗菌小分子物质粗产品中的大部分脱水剂，例如DCC，然后再将抗菌小分子物质粗产品在大量第II溶剂，例如石油醚和/或乙醚中沉降提纯至少2次，最后利用第III混合溶剂，例如石油醚与乙酸乙酯(v/v＝10∶1)通过柱层析分离，制得4-醛基苯甲酸龙脑酯纯品。
在上述合成反应结束后，采用傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Fisher Nicolet6700型傅里叶变换红外光谱仪，Thermo Fisher公司，美国)对所制得抗菌小分子物质纯品进行傅里叶变换红外分析，所述龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质的FT-IR图谱如图2所示。
进一步采用核磁共振仪(Bruker AVANCE 300MHz型核磁共振仪，Bruker公司，瑞士)对所制得抗菌小分子物质纯品进行核磁共振分析，所述龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质的1HNMR图谱如图3所示。
本发明中对于第1溶剂没有特别的限制，只要能够使原料溶解，且不会妨碍反应进行即可，所述第I溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等，优选为四氢呋喃(THF)。
本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的龙脑衍生物抗菌剂或如本发明第二方面所述的方法制备的龙脑衍生物抗菌剂对在制备抗菌产品中的应用。
在本发明的一些具体实施例中，所述抗菌产品包括抗菌药剂等等，可用于医疗、食品、卫生及环保等领域。
实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
实施例1：
本实施例中分子结构如式(I)所示的抗菌小分子物质的制备流程图如图1所示。
称取1.6mmol 4-醛基苯甲酸于反应瓶中，加入30mL的四氢呋喃提供溶剂环境。然后，向溶剂中依次加入0.2mmol DMAP和2.0mmol DCC，完全溶解后，将1mmol龙脑加入到上述体系中，30℃条件下持续反应24h，停止反应后收集粗产物，粗产物依次经过减压抽滤、在大量石油醚中沉降提纯2次，最后通过柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v))和真空干燥等后处理步骤后得到目标产物4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)纯品，其产率95％。该反应具有条件温和、操作简单的优点。
采用傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Fisher Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪，Thermo Fisher公司，美国)对所制得4-醛基苯甲酸龙脑酯纯品进行傅里叶变换红外分析，4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)的FT-IR图谱如图2所示。从图2中的从FT-IR图分析看出，4-醛基苯甲酸龙脑酯合成成功。
采用核磁共振仪(BrukerAVANCE 300MHz型核磁共振仪，Bruker公司，瑞士)对所制得4-醛基苯甲酸龙脑酯纯品进行核磁共振分析，4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)的1HNMR图谱如图3所示。从图3中的从1HNMR图分析看出，4-醛基苯甲酸龙脑酯合成成功。
实施例2：
称取1.6mmol 4-醛基苯甲酸于反应瓶中，加入30mL的四氢呋喃提供溶剂环境。然后，向溶剂中依次加入0.2mmol DMAP和2.0mmol DCC，完全溶解后，将1mmol龙脑加入到上述体系中，25℃条件下持续反应24h，停止反应后收集粗产物，粗产物依次经过减压抽滤、在大量石油醚中沉降提纯2次，最后通过柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v))和真空干燥等后处理步骤后得到目标产物4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)纯品，其产率88％。该反应具有条件温和、操作简单的优点。
实施例3：
称取1.6mmol 4-醛基苯甲酸于反应瓶中，加入30mL的四氢呋喃提供溶剂环境。然后，向溶剂中依次加入0.2mmol DMAP和2.0mmol DCC，完全溶解后，将1mmol龙脑加入到上述体系中，30℃条件下持续反应12h，停止反应后收集粗产物，粗产物依次经过减压抽滤、在大量石油醚中沉降提纯2次，最后通过柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v))和真空干燥等后处理步骤后得到目标产物4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)纯品，其产率85％。该反应具有条件温和、操作简单的优点。
实施例4：
称取1.6mmol 4-醛基苯甲酸于反应瓶中，加入30mL的二氯甲烷提供溶剂环境。然后，向溶剂中依次加入0.2mmol DMAP和2.0mmol DCC，完全溶解后，将1mmol龙脑加入到上述体系中，30℃条件下持续反应12h，停止反应后收集粗产物，粗产物依次经过减压抽滤、在大量石油醚中沉降提纯2次，最后通过柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v))和真空干燥等后处理步骤后得到目标产物4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)纯品，其产率86％。该反应具有条件温和、操作简单的优点。
实施例5：
称取1.6mmol4-醛基苯甲酸于反应瓶中，加入30mL的二氯甲烷提供溶剂环境。然后，向溶剂中依次加入0.2mmol DMAP和2.0mmol DCC，完全溶解后，将1mmol龙脑加入到上述体系中，30℃条件下持续反应36h，停止反应后收集粗产物，粗产物依次经过减压抽滤、在大量石油醚中沉降提纯2次，最后通过柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v))和真空干燥等后处理步骤后得到目标产物4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)纯品，其产率90％。该反应具有条件温和、操作简单的优点。
实施例6：
采用肉汤稀释法(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2017)检测实施例1中制得的龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质的最小抑菌浓度(MIC)，同时选用广谱抗生素环丙沙星和龙脑作为对照，以评价本发明中4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)的高效抗菌活性。检测环丙沙星、龙脑和4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)对各待测菌株的最小抑菌浓度的步骤如下：
将各待测细菌接种于TSA固体培养基上，置于37℃培养箱中倒置培养。长出菌落后，用接种环挑取各待测细菌的单菌落于TSB液体培养基中，在37℃，180r/min转速的摇床中培养至对数生长期，用TSB液体培养基分别稀释至106CFU/mL。
在96孔板的A1-C1孔各加入180μL TSB液体培养基，A2-A10、B2-B10和C2-C10孔分别加入100μL TSB液体培养基。然后，在A1-C1孔中分别加入20μL一定浓度的环丙沙星、龙脑和4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)样品溶液(样品加入前用0.22μm的无菌微孔滤膜过滤除菌)，混匀后分别加入A2-C2孔，再次混匀后取100μL加入A3-C3孔，按照二倍稀释法依次稀释至A10-C10孔，A10-C10孔混匀后弃去100μL溶液，然后A1-A10孔、B1-B10和C1-C10孔分别加入100μL菌悬液。最后两列设置阴性和阳性对照组，阴性对照组每孔加入200μL的TSB液体培养基，阳性对照组每孔加入100μL的TSB液体培养基和100μL菌悬液。将96孔板置于37℃培养箱培养24h，用酶标仪在波长600nm处测定吸光度值。
检测结果计算：96孔板中能够完全抑制细菌生长的最低测试样品的浓度作为最小抑菌浓度。MIC测试结果如表1所示，从表1中可以看出，与龙脑的抗菌活性相比，实施例1中制得的4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性菌如铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌，均具有高效的抗菌活性，其抗菌效力与广谱抗生素环丙沙星相当。
表1本实施例的抗菌实验中BF对各待测细菌的最小抑菌浓度(MIC)
按照实施例6中的最小抑菌浓度实验方法对实施例2-5中制得的龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质进行抗菌试验，结果表明，与龙脑的抗菌活性相比，实施例2-5中制得的4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性菌如铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌，均具有高效的抗菌活性，其抗菌效力与广谱抗生素环丙沙星相当。
实施例7：
将实施例1中制得的龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质4-醛基苯甲酸龙脑酯配制成一系列浓度的溶液，待用。
在37℃、95％空气和5％CO2的湿润培养箱条件下，将小鼠成纤维细胞L929(购自中国北京协和细胞资源中心(CRC/PUMC))在含有10％FBS，100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的RPMI1640培养基中培养至对数生长期，随后用新鲜培养基配制成单细胞悬液。将L929的单细胞悬液以每孔5000个细胞的密度接种在96孔板中，每孔100μL。在37℃、95％空气和5％CO2的湿润培养箱中温育24h。弃去孔板中的培养基，并加入100μL的含有不同浓度的4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)的新鲜培养基继续培养24h和48h。96孔板中4-醛基苯甲酸龙脑酯(BF)的最终浓度为20、40和60μg/mL。通过MTT比色法测定细胞活力，每孔分别加入20μLMTT溶液(5mg/mL)测定细胞活力，37℃下温育4h，移去孔板中的溶液后，向各孔中加入150μL DMSO，并轻轻摇动以溶解每孔中的甲臜晶体。将孔板置于酶标仪中，在570nm波长处测定甲臜液体的吸光度，按以下公式计算相对细胞活力：
细胞活性(％)＝(Abs570样品-Abs570对照)/(Abs570细胞-Abs570对照)×100％。
其中，Abs570样品代表用不同浓度处理的细胞吸光度，Abs570对照代表空白培养基对照组的吸光度，Abs570细胞代表未用样品处理的细胞吸光度。
检测结果如图4所示，即使在60μg/mL的浓度下，经过24h和48h的共培养，实施例1中制得的4-醛基苯甲酸龙脑酯对小鼠成纤维细胞L929几乎没有细胞毒性作用(96％以上)，证明实施例1中制得的4-醛基苯甲酸龙脑酯具有良好的生物相容性。
按照实施例7中的生物相容性实验方法对实施例2-5中制得的龙脑酯化衍生的抗菌小分子物质进行生物相容性试验，结果表明经过24h和48h的共培养，实施例2-4中制得的4-醛基苯甲酸龙脑酯具有良好的生物相容性。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种龙脑衍生物抗菌剂，其为4-醛基苯甲酸龙脑酯，由4-醛基苯甲酸和龙脑经酯键结合组成，其分子结构如式(I)所示：
2.根据权利要求1所述的龙脑衍生物抗菌剂，其特征在于，所述龙脑包括L-龙脑、D-龙脑、Iso-龙脑中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的龙脑衍生物抗菌剂，其特征在于，龙脑衍生物抗菌剂包括4-醛基苯甲酸L-龙脑酯、4-醛基苯甲酸D-龙脑酯和4-醛基苯甲酸Iso-龙脑酯中的一种或几种。
4.根据权利要求1-3所述的龙脑衍生物抗菌剂，其特征在于，所述龙脑衍生物抗菌剂能够抑制细菌生长和杀死细菌。
5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的龙脑衍生物抗菌剂的制备方法，其包括：将4-醛基苯甲酸和龙脑化合物在第I溶剂中混合均匀，在催化剂和脱水剂存在条件下进行酯化反应，制得龙脑衍生物抗菌剂粗产品。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的催化剂包括4-二甲氨基吡啶、对甲基苯磺酸和浓硫酸中的一种或几种；和/或，所述的脱水剂包括N，N’-二环己基碳二亚胺、碳化二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙酰氯和亚硫酰氯中的一种或几种；所述的第I溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺中的一种或几种；和/或，所述龙脑化合物包括L-龙脑、D-龙脑、Iso-龙脑中的一种或几种。
7.根据权利要求5-6中任意一项所述的方法，其特征在于，4-醛基苯甲酸和龙脑化合物的摩尔比为(1-2)∶1；催化剂和龙脑化合物的摩尔比为(0.1-0.5)∶1；脱水剂和龙脑化合物的摩尔比为(1-3)∶1。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述酯化反应的温度为20-40℃，优选为25-30℃；和/或，所述酯化反应的时间12-48h，优选为12-36h。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的方法中，其特征在于，在制备龙脑衍生物抗菌剂粗产品的步骤之后还包括分离纯化龙脑衍生物抗菌剂粗产品的步骤：先通过减压抽滤脱除大部分脱水剂；再在第II溶剂中进一步沉降提纯；然后利用第III混合溶剂通过柱层析分离，制得龙脑衍生物抗菌剂纯品；优选地，所述第II溶剂包括石油醚和/或乙醚；和或，所述第III混合溶剂为石油醚与乙酸乙酯的混合液；进一步优选地，所述石油醚与乙酸乙酯的混合液中石油醚与乙酸乙酯的体积比为10∶1。
10.根据权利要求1-5中任意一项所述的龙脑衍生物抗菌剂或如权利要求6-9中任意一项所述的方法制备的龙脑衍生物抗菌剂对在制备抗菌产品中的应用。
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