CN110352961A - 一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用，本发明利用茉莉酸甲酯在防治黑粉菌中的应用，构建了一种防治黑粉菌的工程菌，受体菌过表达茉莉酸甲酯转移酶。本发明中工程菌的代谢产物为茉莉酸甲酯，并不存在生物安全性问题；茉莉酸甲基转移酶来自植物，通过大肠杆菌表达后也不会带来生物安全性问题；工程菌为大肠杆菌，培养条件简单，成本低廉，实施方法简便；本发明所有通过提高植物体内激素茉莉酸甲酯的含量来提高防御能力，并不影响植物生长；将本发明工程菌应用于玉米瘤黑粉病的防治，具有明显的防治效果，值得大力推广应用。

Description

一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用。
背景技术
在生物防治病害出现之前的很长一段时间内，植物病害防治主要以化学防治为主。农药防治呈现的趋势是高效即高毒，所以寻找高效低毒甚至无毒的病害防治方法也十分迫切。生物防治病害是解决化学防治高效高毒的方法中最为安全的之一。
通过从不同环境中分离具有病原菌具有拮抗作用的微生物是目前生防菌的主要筛选方法。但是，原生环境的改变对微生物的生活状态也是一种挑战，新环境的定植问题、发挥生防作用的时机和是否会导致被保护植物发病以及对周边环境的生物安全问题等，都是生防菌在实际应用中需要考虑的因素。
真菌致病菌在植物致病菌中占据约80％，其中大部分真菌通过菌丝侵染植物进而为害植物，并且在高温高湿的条件下会在病斑处长出绒毛(菌丝)，菌丝是真菌造成侵染危害的主要媒介。在黑粉菌属真菌中，黑粉菌经过配合产生菌丝侵染宿主植物，通过抑制菌丝生长就可以显著抑制病害。
目前尚无一种安全有效的防控黑粉菌属真菌的生防方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的尚无一种安全有效的防控黑粉菌属真菌的生防方法的不足，提供一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用。
本发明的第一个目的是提供茉莉酸甲酯在防治黑粉菌中的应用。
本发明的第二个目的是提供茉莉酸甲酯转移酶基因在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用。
本发明的第三个目的是提供茉莉酸甲酯转移酶在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，同时提供一种茉莉酸甲酯的仪器检测方法。
本发明的第四个目的是提供一种防治黑粉菌的工程菌。
本发明的第五个目的是提供所述的工程菌的制备方法。
本发明的第六个目的是提供一种防治黑粉菌的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明构建出一种黑粉菌菌丝生长具有抑制作用的大肠杆菌菌株。黑粉菌必须通过二型态转变形成双核菌丝对植物进行危害，而本发明中的大肠杆菌工程菌株对黑粉菌菌丝生长具有强烈的抑制作用，所以在黑粉病防治中具有潜在的应用价值。
因此本发明要求保护以下内容：
茉莉酸甲酯在防治黑粉菌中的应用。
茉莉酸甲酯转移酶基因在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，所述茉莉酸甲酯转移酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
茉莉酸甲酯转移酶在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，所述茉莉酸甲酯转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述黑粉菌为甘蔗鞭黑粉菌和玉米瘤黑粉菌中的一种或两种。
一种防治黑粉菌的工程菌，受体菌过表达茉莉酸甲酯转移酶。
优选地，受体菌为大肠杆菌。
所述的工程菌的制备方法，包括以下步骤：
S1.获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的茉莉酸甲酯转移酶基因；
S2.将茉莉酸甲酯转移酶连接到表达载体，得到重组载体
S3.将重组载体转入受体菌，得到工程菌。
优选地，表达载体为pRSFDUET-1。
一种防治黑粉菌的方法，将所述工程菌接种到植物上。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的工程菌的产生的代谢产物为茉莉酸甲酯，并不存在生物安全性问题。
2、本发明的茉莉酸甲基转移酶来自植物，通过大肠杆菌表达后也不会带来生物安全性问题。
3、本发明得到的工程菌为大肠杆菌，培养条件简单，成本低廉，实施方法简便。
4、本发明所需反应底物均来自植物，通过提高早期植物体内激素茉莉酸甲酯含量来提高植物防御能力，实验证明并不影响植物生长。
5、将本发明工程菌应用于玉米瘤黑粉病的防治，具有明显的防治效果，值得大力推广应用。
附图说明
图1为茉莉酸甲酯处理抑制黑粉菌菌丝结果图
图2为用于表达植物源JMT基因的载体示意图。
图3为大肠杆菌E-JMT菌株对甘蔗鞭黑粉菌形成菌丝的抑制效果图。
图4为大肠杆菌E-JMT菌株提取物对两种黑粉菌形成菌丝的抑制效果图；A为提取物对玉米瘤黑粉菌的抑制情况；B为提取物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制情况。
图5为大肠杆菌E-JMT菌株将JA转化为MeJA的HPLC测鉴定图。
图6为大肠杆菌E-JMT菌株将JA转化为MeJA的GC/MS测鉴定图。
图7为200μM茉莉酸甲酯的防治效果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
(1)YEPSA培养基的配制：(试剂均购买自鼎国昌盛)蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，蔗糖20g/L，琼脂4g/L，加1000ml水混匀后121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。
(2)YEPSA-c培养基的配制：(试剂均购买自鼎国昌盛)蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，蔗糖20g/L，碳粉10g/L，琼脂4g/L，加1000ml水混匀后121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。
(3)LB液体培养基的配制：称取胰蛋白胨(Tryptone，Oxoid LTD LP0042，England)10g，酵母提取物(Yeast extract，Oxoid LTD LP0021，England)5g，氯化钠(NaCl，国药集团化学试剂有限公司，10019318)10g，加水1000mL搅拌均匀，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。
(4)LB固体培养基的配制：为LB液体培养基配置方法后添加再加15g琼脂，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。
实施例1茉莉酸甲酯对两种黑粉菌菌丝生长的抑制作用
一、实验方法
1、甘蔗鞭黑粉菌菌液、玉米瘤黑粉菌菌液准备
取-80℃保存的甘蔗鞭黑粉菌(WT17、WT18)、玉米瘤黑粉菌(U9、U10)菌种点于YEPSA平板上，28℃培养2～3天后刮取菌落于28℃200rpm条件摇菌，待用。
2、在YEPS中添加茉莉酸甲酯终浓度为200μM，设置不加茉莉酸甲酯的为对照组，点甘蔗鞭黑粉菌于平板上于28℃培养三天，观察实验结果。在YEPS-c中添加茉莉酸甲酯终浓度为400μM，设置不加茉莉酸甲酯的为对照组，点玉米瘤黑粉菌于平板上于28℃培养三天，观察实验结果。
二、实验结果
结果如图1，茉莉酸甲酯处理下，与对照组比较看出菌丝明显受到抑制，茉莉酸甲酯可以抑制两种黑粉菌菌丝的生长。
实施例2表达植物源茉莉酸甲基转移酶基因的工程菌构建
一、实验方法
1、茉莉酸甲基转移酶(JMT)表达载体构建
茉莉酸甲基转移酶基因序列(其核苷酸序列SEQ ID NO：1所示)，由苏州金唯智生物科技有限公司代为合成，并且在左右两端各添加了酶切位点EcoRI、SalI，其核苷酸序列如下(下划线部分位为酶切位点)：
gaattcatggaggtaatgcgagttcttcacatgaacaaaggaaacggggaaacaagttatgccaagaactccaccgctcagagcaacataatatctctaggcagaagagtaatggacgaggccttgaagaagttaatgatgagcaattcagagatttcgagcattggaatcgccgacttaggctgctcctccggtccgaacagtctcttgtccatctccaacatagttgacacgatccacaacttgtgtcctgacctcgaccgtccagtccctgagctcagagtctctctcaacgacctccctagcaatgacttcaactacatatgtgcttctttgccagagttttacgaccgggttaataataacaaggagggtttagggttcggtcgtggaggaggagaatcgtgttttgtgtcggccgtcccaggttcgttctacggacgtttgtttcctcgccggagccttcactttgtgcattcttcttctagtttacattggttgtctcaggttccatgtcgtgaggcggagaaggaagacaggacaataacagctgatttagaaaacatggggaaaatatacatatcaaagacaagtcctaagagtgcacataaagcttatgctcttcaattccaaactgatttcttggtttttttgaggtcacgatctgaggagttggtcccgggaggccgaatggttttatcgttccttggtagaagatcactggatcccacaaccgaagagagttgctatcaatgggaactcctagctcaagctcttatgtccatggccaaagagggtatcatcgaggaagagaagatcgatgctttcaacgctccttactatgctgcgagctccgaagagttgaaaatggtgatagagaaagaagggtcattttcgatcgataggcttgagataagtccgattgattgggaaggtgggagtatcagtgaggagagttatgaccttgcaataaggtccaaacccgaagccctagctagtggccgaagagtgtctaataccataagagctgtggtcgagccgatgctagaacctactttcggtgaaaatgtgatggacgagctttttgaaaggtatgcaaagatcgtgggagagtacttctatgtaagctcgccacgatacgctattgttattctttcgctcgttagaaccggttgagtcgac
茉莉酸甲基转移酶氨基酸序列(其氨基酸序列SEQ ID NO：2所示)序列如下：
经双酶切后片段连接到载体pRSFDUET-1载体的多克隆位点上，启动子为T7启动子，其受lac操纵子操纵，并将质粒命名为pJMT。
2、含有载体pJMT载体工程菌的构建
大肠杆菌DH5α感受态细胞为实验室自己制备，转化方法如下：
取-80℃保存的大肠杆菌感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后添加pJMT质粒于感受态细胞中，并混匀。冰上静置30分钟后于42℃水浴锅中水浴1分钟，转移到冰上静置2分钟。冰浴结束后，添加500微升LB液体培养基于感受态中，在37℃200rpm摇床复苏1小时，涂于含有100mg/mL的卡那霉素的LB平板上，待菌落长出，经菌落PCR验证，于-80℃保存验证正确的大肠杆菌，并命名该菌为E-pJMT。
二、实验结果
构建的重组质粒pJMT结构图如图2。经测序转化后的阳性重组菌E-pJMT，茉莉酸甲基转移酶(JMT)的插入质粒的位点和插入序列均正确，可以用于进一步实验。
实施例3对峙培养法测定茉莉酸甲酯及大肠杆菌E-pJMT活性
一、甘蔗鞭黑粉菌菌液、玉米瘤黑粉菌菌液准备
取-80℃保存的甘蔗鞭黑粉菌、玉米瘤黑粉菌菌种点于YEPSA平板上，28℃培养2-3天后刮取菌落于28℃200rpm条件摇菌，待用。
二、E-pJMT工程菌菌液准备
取-80℃保存的E-pJMT工程菌划线于LB平板上，37℃培养1天后挑取单菌落于LB液体培养基37℃200rpm摇菌，待用。
三、E-pJMT工程菌异源表达
取过夜摇菌的E-pJMT工程菌于50mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm摇菌，待菌液OD600＝1.0，添加终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)于菌液中28℃200rpm摇菌4小时，待用。
四、活性测定：
1、E-pJMT对峙实验
(1)实验方法
取E-pJMT、玉米瘤黑粉菌、甘蔗鞭黑粉菌菌液按照中间是致病真菌，周围成品字形点E-pJMT工程菌，菌液各5μL点于含有200μM茉莉酸、200μM SAM(S-腺苷基甲硫氨酸，S-Adenosyl Methionine)、1mM IPTG的YEPSA、YEPS-c培养基上，28℃培养约3天观察对真菌的抑制作用。
(2)实验结果
结果如图3所示。E-pJMT能显著抑制甘蔗鞭黑粉菌两个交配型担孢子混合、交配以后形成菌丝。
结果讨论：通过对峙实验发现茉莉酸甲酯、E-pJMT(图3)、E-pJMT诱导表达后收集的上清液(图4)均对玉米瘤黑粉菌、甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长有抑制作用。
2、E-pJMT活性检测
(1)实验方法
取异源表达的E-pJMT工程菌菌液，离心收集菌体将菌体重新悬浮于10mL LB含有200μM茉莉酸培养基中，于28℃200rpm摇床中培养约1天，离心取上清液约1mL，通过0.22μ滤膜过滤上清液除菌，上清液添加到培养基中(10％，v/v)，28℃培养约3天观察实验结果。结果如图4所示，结果表明上清液中含有能抑制甘蔗鞭黑粉菌两个交配型担孢子混合、交配以后形成菌丝的活性成分。
用约1.5倍体积的乙酸乙酯萃取上清液，乙酸乙酯萃取液通过旋转蒸发至干，用1mL甲醇从容器洗下来，过0.22μm的有机尼龙膜装至棕色样品瓶，待检测。(茉莉酸甲酯标准品购买自Sigma-Aldrich,CAS#:1211-29-6)
相关仪器型号：
高效液相色谱仪(HPLC):Agilent-1260；
色谱柱型号:Agilent HC-C18(2)250×4.6mm,5μm；
气相质谱仪(GC\MS):Agilent-5977B
HPLC检测：进样量10μL，流动相：甲醇/0.1％甲酸水＝65/35，流速0.3
mL/min，检测波长205nm，检测时间20min，柱温30℃；
GC/MS检测：60℃保持5min，30℃/min升温到270℃，离子源温度220℃，传输线温度270℃，电子电离能70eV，m/z＝30～450。
(2)实验结果
结果如图5、6所示，HPLC可以同时检测出茉莉酸、茉莉酸甲酯，根据已经建立的标准曲线可以算出茉莉酸的浓度小于实验前添加的浓度200μM，故可以推测E-JMT催化茉莉酸转变为茉莉酸甲酯。更进一步，通过GC/MS检测结果(图6)显示菌液中的确有茉莉酸甲酯产生。
以上结果表明了植物源激素茉莉酸甲酯的确具有抑制黑粉菌形成菌丝的能力，同时茉莉酸通过茉莉酸甲基转移酶催化转化成茉莉酸甲酯可用于抑制黑粉菌菌丝生长。
实施例4玉米瘤黑粉病防效实验
一、MeJA对玉米瘤黑粉病防效实验
1、实验方法
菌液处理：取OD600≈1.0的玉米瘤黑粉菌，添加终浓度为200μM的茉莉酸甲酯于玉米瘤黑粉菌中作为药品处理组，同时，设置未添加茉莉酸甲酯的玉米瘤黑粉菌菌液、清水作为对照。
玉米接菌：玉米(购买自市场：华美甜8号)长至四叶到五叶期后，用注射器从玉米茎部注射菌液至菌液从叶基部溢出(约1mL)，约两周后玉米发病，统计发病情况。
2、实验结果
结果如图7所示和表1所示：在200μM茉莉酸甲酯处理下，玉米瘤黑粉病发病率比不加处理的发病率降低了大约23.08％。
表1：
注：第二组中有四株因发病烂在田间，第三组中有两株因发病烂在田间。
二、E-pJMT对玉米瘤黑粉病的防效实验
1、实验方法
取OD600≈1.0的玉米瘤黑粉菌，与大肠感觉菌液(分别为实施例2制备的大肠杆菌E-pJMT和转入空载体的大肠杆菌pCK)悬浮混合，同时，设置清水作为对照。
玉米接菌：玉米(购买自市场：华美甜8号)长至四叶到五叶期后，用注射器从玉米茎部注射菌液至菌液从叶基部溢出(约1mL)，约两周后玉米发病，统计发病情况。
统计发病情况。
2、实验结果
结果如表2所示：E-pJMT与玉米瘤黑粉菌混合接种的发病率与对照组相比发病率降低了15％。
表2：
注：pCK*空载体转入大肠杆菌
三、结论
在茉莉酸甲酯或E-pJMT存在的情况下，玉米瘤黑粉病的发病率下降，说明茉莉酸甲酯具有抑制黑粉菌发病的能力。在自然条件下，从黑粉菌侵染作物到发病存在一定的机会性，所以E-pJMT作为提高植物苗期的防御能力的工程菌株具有生防价值。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaggtaa tgcgagttct tcacatgaac aaaggaaacg gggaaacaag ttatgccaag 60
aactccaccg ctcagagcaa cataatatct ctaggcagaa gagtaatgga cgaggccttg 120
aagaagttaa tgatgagcaa ttcagagatt tcgagcattg gaatcgccga cttaggctgc 180
tcctccggtc cgaacagtct cttgtccatc tccaacatag ttgacacgat ccacaacttg 240
tgtcctgacc tcgaccgtcc agtccctgag ctcagagtct ctctcaacga cctccctagc 300
aatgacttca actacatatg tgcttctttg ccagagtttt acgaccgggt taataataac 360
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acagctgatt tagaaaacat ggggaaaata tacatatcaa agacaagtcc taagagtgca 600
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gttattcttt cgctcgttag aaccggttga 1170
<210> 2
<211> 389
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Val Met Arg Val Leu His Met Asn Lys Gly Asn Gly Glu Thr
1 5 10 15
Ser Tyr Ala Lys Asn Ser Thr Ala Gln Ser Asn Ile Ile Ser Leu Gly
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Phe Tyr Asp Arg Val Asn Asn Asn Lys Glu Gly Leu Gly Phe Gly Arg
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Gly Arg Leu Phe Pro Arg Arg Ser Leu His Phe Val His Ser Ser Ser
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Ser Leu His Trp Leu Ser Gln Val Pro Cys Arg Glu Ala Glu Lys Glu
165 170 175
Asp Arg Thr Ile Thr Ala Asp Leu Glu Asn Met Gly Lys Ile Tyr Ile
180 185 190
Ser Lys Thr Ser Pro Lys Ser Ala His Lys Ala Tyr Ala Leu Gln Phe
195 200 205
Gln Thr Asp Phe Leu Val Phe Leu Arg Ser Arg Ser Glu Glu Leu Val
210 215 220
Pro Gly Gly Arg Met Val Leu Ser Phe Leu Gly Arg Arg Ser Leu Asp
225 230 235 240
Pro Thr Thr Glu Glu Ser Cys Tyr Gln Trp Glu Leu Leu Ala Gln Ala
245 250 255
Leu Met Ser Met Ala Lys Glu Gly Ile Ile Glu Glu Glu Lys Ile Asp
260 265 270
Ala Phe Asn Ala Pro Tyr Tyr Ala Ala Ser Ser Glu Glu Leu Lys Met
275 280 285
Val Ile Glu Lys Glu Gly Ser Phe Ser Ile Asp Arg Leu Glu Ile Ser
290 295 300
Pro Ile Asp Trp Glu Gly Gly Ser Ile Ser Glu Glu Ser Tyr Asp Leu
305 310 315 320
Ala Ile Arg Ser Lys Pro Glu Ala Leu Ala Ser Gly Arg Arg Val Ser
325 330 335
Asn Thr Ile Arg Ala Val Val Glu Pro Met Leu Glu Pro Thr Phe Gly
340 345 350
Glu Asn Val Met Asp Glu Leu Phe Glu Arg Tyr Ala Lys Ile Val Gly
355 360 365
Glu Tyr Phe Tyr Val Ser Ser Pro Arg Tyr Ala Ile Val Ile Leu Ser
370 375 380
Leu Val Arg Thr Gly
385

Claims (9)

1.茉莉酸甲酯在防治黑粉菌中的应用。
2.茉莉酸甲酯转移酶基因在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，其特征在于，所述茉莉酸甲酯转移酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.茉莉酸甲酯转移酶在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，其特征在于，所述茉莉酸甲酯转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1到3任一所述应用，其特征在于，所述黑粉菌为甘蔗鞭黑粉菌和玉米瘤黑粉菌中的一种或两种。
5.一种防治黑粉菌的工程菌，其特征在于，受体菌过表达茉莉酸甲酯转移酶。
6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，受体菌为大肠杆菌。
7.权利要求5所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的茉莉酸甲酯转移酶基因；
S2.将茉莉酸甲酯转移酶连接到表达载体，得到重组载体
S3.将重组载体转入受体菌，得到工程菌。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，表达载体为pRSFDUET-1。
9.一种防治黑粉菌的方法，其特征在于，将权利要求4所述工程菌接种到植物上。
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