CN110343721B - 一种延迟家蚕化蛹的方法 - Google Patents
一种延迟家蚕化蛹的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110343721B CN110343721B CN201910574985.1A CN201910574985A CN110343721B CN 110343721 B CN110343721 B CN 110343721B CN 201910574985 A CN201910574985 A CN 201910574985A CN 110343721 B CN110343721 B CN 110343721B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- egt
- recombinant
- protein
- silkworms
- silkworm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 title claims abstract description 61
- 230000019617 pupation Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 claims abstract description 16
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 101150093002 EGT gene Proteins 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 11
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 abstract description 15
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 abstract description 15
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 abstract description 4
- 150000002061 ecdysteroids Chemical class 0.000 abstract description 4
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 abstract description 3
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 229930014550 juvenile hormone Natural products 0.000 description 2
- 239000002949 juvenile hormone Substances 0.000 description 2
- 150000003633 juvenile hormone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- -1 ecdysteroid uridine diphosphate Chemical class 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/04—Silkworms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种延迟家蚕化蛹的方法。本发明利用在桑叶中添加家蚕核型多角体病毒BmNPV编码表达的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP‑glucosyltransferase，EGT)，使家蚕体内蜕皮激素失去活性，从而延迟家蚕化蛹。其原理是EGT酶可催化将UDP‑葡萄糖中的糖基转移至蜕皮激素的反应而使后者失活，从而阻断家蚕的蜕皮和化蛹。本发明解决了鲜茧必须立即烘干杀死蚕茧内蚕蛹的问题，节省了生产成本，并且能够提供蚕丝的品质，这为实现鲜茧缫丝和提高生产效率创造了条件。
Description
技术领域
本发明涉及DNA重组技术、蛋白质的表达技术，尤其涉及利用杆状病毒表达的重组EGT蛋白延迟家蚕化蛹的方法。
背景技术
昆虫杆状病毒基因组中存在一个编码蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyhransferase，EGT)的基因egt。杆状病毒感染昆虫后产生的EGT酶能催化昆虫体内尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucosyl)中的葡萄糖基转移到蜕皮激素上，使蜕皮激素失活，从而阻碍宿主昆虫的蜕皮和化蛹，延长幼虫的取食时间，以利于病毒自身的大量繁殖；而蜕皮激素是调控昆虫发育变态的最主要物质，因此，egt基因对于研究宿主昆虫的激素代谢以及激素对昆虫的发育调节作用等具有重要意义。
家蚕杆状病毒BmNPV编码的EGT基因大小1518bp，该基因所编码的蛋白质由506个氨基酸组成，分子量约为57kDa，该基因产物使家蚕体内蜕皮激素失活，打破了蚕体内保幼激素和蜕皮激素的平衡，阻碍了家蚕的正常蜕皮和蛹化，延长了感染家蚕的取食时间，有利于病毒自身的繁殖，是病毒在机体水平控制感染宿主的独特范例。在蚕业生产上，若能通过EGT酶控制蜕皮激素延长化蛹对于采用鲜茧缫丝、提高蚕丝质量和生产效率具有重要意义。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，填补现有技术的空白，本发明提供了一种延迟家蚕化蛹的方法。
家蚕的生长发育受保幼激素和蜕皮激素调节，本发明利用在桑叶中添加家蚕核型多角体病毒BmNPV编码表达的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，EGT)，使家蚕体内蜕皮激素失去活性，从而延迟家蚕化蛹。其原理是EGT酶可催化将UDP-葡萄糖中的糖基转移至蜕皮激素的反应而使后者失活，从而阻断家蚕的蜕皮和化蛹。
本发明所采用的具体技术方案是：
(1)家蚕BmNPV编码的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因的克隆：以家蚕核型多角体病毒BmNPV的基因组为模板，利用PCR方式克隆获得蓖麻EGT基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，获得pCR2.1-EGT，利用DNA测序确认克隆的EGT基因序列正确性；
(2)含有EGT基因的重组杆状病毒的构建：
用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-EGT得到蓖麻EGT基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA-EGT；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内与BmNPV DNA同源重组产生重组病毒；在离心管中加入1μg的pBlueBacHisA-EGT DNA和15μg的BmNPV DNA，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；将该混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的BmN培养细胞，再用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有质量浓度为10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清液作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒；重组病毒用病毒储存原液通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组病毒溶液，浓度为108pfu/ml；本申请将此重组病毒命名为BmNPV-EGT。
(3)家蚕培养细胞内表达重组EGT蛋白：使用家蚕培养细胞BmN，在培养基中加入上述浓度为106pfu/ml的重组病毒溶液，使病毒感染细胞，然后在27℃下培养，培养96小时后收集细胞和上清液；将收集的细胞和上清液作为重组EGT蛋白纯化的起始材料，使用冻融法和超声波溶解细胞，经高速离心后再收集上清液；重组蛋白的N-末端带有6×His用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得重组EGT蛋白；
(4)家蚕经口添食EGT蛋白：在家蚕五龄第一天，将10mg/ml的上述重组EGT蛋白喷于桑叶表面，通过添食的方法，让家蚕食下重组EGT蛋白，由此实现延迟家蚕化蛹。
所述步骤(1)中，PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：94℃模板变性3分钟；30个循环，94℃变性30秒，57℃退火50秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟；
所述步骤(1)中，引物设计如下：正向引物：5'-AGGGATCCCTAAAAGTGTGCTATATG-3'，如SEQ ID NO.1，含有BamHI酶切位点，反向引物：5'-GAAGCTTGCAATAACTTGCTGTCCT-3'，如SEQ ID NO.2，含有HindIII酶切位点。
所述步骤(3)中，用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化获得重组EGT蛋白，具体为：将该上清液结合于Ni-NTA柱，随后用硫酸缓冲液进行漂洗，最后用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，获得重组EGT蛋白。
所述步骤(3)最后，获得重组EGT蛋白后通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组EGT蛋白。
本发明与背景技术相比，具有的有益效果是：
本发明巧妙底利用杆状病毒编码的EGT蛋白具有催化蚕体内尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucosyl)中的葡萄糖基转移到蜕皮激素上，使蜕皮激素失活的特性，延迟了家蚕化蛹时间，解决了鲜茧必须立即烘干杀死蚕茧内蚕蛹的问题，节省了生产成本，并且能够提供蚕丝的品质，这为实现鲜茧缫丝和提高生产效率创造了条件，在蚕丝业生产中具有重要的应用价值。
附图说明
附图1为pBlueBacHisA质粒图谱；
附图2为实施例中获得的家蚕培养细胞表达与纯化EGT电泳图；
附图3为实施例中经口添食EGT延迟化蛹的效果图。
具体实施方式
本发明的实施例具体如下：
1、材料：杆状病毒基因组DNA抽提试剂盒购于Qiagene。DNA处理和PCR扩增试剂盒购于Takara Biomedicals(Kyoto，Japan)。TA克隆试剂盒、杆状病毒转移载体pBlueBacHisA、lipofectin和Ni-NTA树脂均为Invitrogen公司产品。DNA测序试剂盒购于PEApplied Biosystems。家蚕核型多角体病毒BmNPV和家蚕培养细胞BmN由我们实验室保存。胎牛血清FCS、其培养基TC-100均为GibcoBRL的产品。家蚕BmN细胞用添加10％(v/v)FCS的TC-100培养基在27℃培养。
2、工作流程：
1、利用EGT延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：
(1)家蚕BmNPV编码的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因的克隆：以BmNPV的基因组为模板，利用PCR技术克隆获得蓖麻EGT基因；引物设计如下：正向引物：5'-AGGGATCCCTAAAAGTGTGCTATATG-3'，含有BamHI酶切位点，反向引物：5'-GAAGCTTGCAATAACTTGCTGTCCT-3'，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：94℃模板变性3分钟；30个循环，94℃变性30秒，57℃退火50秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，结果如图2所示，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，利用DNA测序确认克隆的EGT基因序列正确性；
(2)含有EGT基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-EGT得到EGT基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA质粒(如图1所示)获得重组体pBlueBacHisA-EGT；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内与BmNPV DNA同源重组产生重组病毒。在离心管中加入1μg pBlueBacHisA-EGT DNA和15μg BmNPV DNA，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的BmN培养细胞；用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒。重组病毒通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml。申请将此重组病毒命名为BmNPV-EGT；
(3)家蚕培养细胞内表达重组EGT蛋白：使用家蚕培养细胞BmN，在培养基中加入上述浓度为106pfu/ml的重组病毒溶液，使病毒感染细胞，然后在27℃下培养；培养96小时后收集细胞和上清。
将收集的细胞和上清作为重组EGT蛋白纯化的起始材料，使用冻融法和超声波溶解细胞，经高速离心后收集上清液。
由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；将上述上清液样品结合于Ni-NTA柱，随后用硫酸缓冲液进行漂洗，最后用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白。
(4)家蚕经口添食EGT蛋白。在家蚕五龄第一天，将10mg/ml的上述重组EGT蛋白喷于桑叶表面，通过添食的方法，让家蚕食下EGT，这样经口添食EGT能延迟化蛹，如图3所示，延迟化蛹时间与对照相比，平均延迟了96小时，因此，本申请专利的方法具有明显延迟家蚕幼虫化蛹的效果。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：正向引物1
来源：人工合成
5'-AGGGATCC CTAAAAGTGTGCTATATG-3'
SEQ ID NO.1：反向引物1
来源：人工合成
5'-GAAGCTTGCAATAACTTGCTGTCCT-3'。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种延迟家蚕化蛹的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggatccct aaaagtgtgc tatatg 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaagcttgca ataacttgct gtcct 25
Claims (5)
1.一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：
(1)家蚕BmNPV编码的EGT基因的克隆：以家蚕核型多角体病毒BmNPV的基因组为模板，利用PCR方式克隆获得EGT基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，获得pCR2.1-EGT；
(2)含有EGT基因的重组杆状病毒的构建：
用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-EGT得到EGT基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA-EGT；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内与BmNPV DNA同源重组产生重组病毒；在离心管中加入1μg的pBlueBacHisA-EGT DNA和15μg的BmNPV DNA，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；将该混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的BmN培养细胞，再用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有质量浓度为10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清液作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒；重组病毒用病毒储存原液通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组病毒溶液，浓度为108pfu/ml；
(3)家蚕培养细胞内表达重组EGT蛋白：使用家蚕培养细胞BmN，在培养基中加入上述浓度为106pfu/ml的重组病毒溶液，使病毒感染细胞，然后在27℃下培养，培养96小时后收集细胞和上清液；将收集的细胞和上清液作为重组EGT蛋白纯化的起始材料，使用冻融法和超声波溶解细胞，经高速离心后再收集上清液；用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得重组EGT蛋白；
(4)家蚕经口添食EGT蛋白：在家蚕五龄第一天，将10mg/ml的上述重组EGT蛋白喷于桑叶表面，通过添食的方法，让家蚕食下重组EGT蛋白，由此实现延迟家蚕化蛹。
2.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：94℃模板变性3分钟；30个循环，94℃变性30秒，57℃退火50秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟。
3.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，引物设计如下：正向引物：5'-AGGGATCC CTAAAAGTGTGCTATATG-3'，如SEQ ID NO.1，含有BamHI酶切位点，反向引物：5'-GAAGCTTGCAATAACTTGCTGTCCT-3'，如SEQID NO.2，含有HindIII酶切位点。
4.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：
所述步骤(3)中，用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化获得重组EGT蛋白，具体为：将该上清液结合于Ni-NTA柱，随后用硫酸缓冲液进行漂洗，最后用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，获得重组EGT蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：
所述步骤(3)最后，获得重组EGT蛋白后通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组EGT蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910574985.1A CN110343721B (zh) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | 一种延迟家蚕化蛹的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910574985.1A CN110343721B (zh) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | 一种延迟家蚕化蛹的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110343721A CN110343721A (zh) | 2019-10-18 |
| CN110343721B true CN110343721B (zh) | 2021-06-08 |
Family
ID=68176902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910574985.1A Active CN110343721B (zh) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | 一种延迟家蚕化蛹的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110343721B (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11123079A (ja) * | 1997-10-24 | 1999-05-11 | Noyaku Bio Technology Kaihatsu Gijutsu Kenkyu Kumiai | エクジステロイドｕｄｐ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子 |
| CN102174481B (zh) * | 2011-03-21 | 2013-05-15 | 苏州大学 | 斜纹夜蛾基因工程病毒1号及其构建方法 |
| CN107619836B (zh) * | 2017-09-30 | 2020-10-09 | 西南大学 | 一种降低吐丝期活性20e浓度改变丝蛹营养分配比例增加蚕茧产量的系统及应用和方法 |
-
2019
- 2019-06-28 CN CN201910574985.1A patent/CN110343721B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110343721A (zh) | 2019-10-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1665934A (zh) | GNTIII(UDP－N乙酰葡萄糖胺:β－D－甘露糖苷β(1,4)－N－乙酰葡萄糖胺基－转移酶III)在植物中的表达 | |
| CA2780540A1 (en) | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity | |
| CN111088255A (zh) | 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子 | |
| CN101845439B (zh) | 家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法 | |
| US20150191732A1 (en) | Lepidopteran insect n-acetylglucosaminidase genes and their use in glycoengineering | |
| KR20080028923A (ko) | 테트라히메나 열 유도성 프로모터 및 그의 용도 | |
| KR102069045B1 (ko) | 코르코루스 올리토리우스 및 코르코루스 캡슐라리스로부터의 wuschel-관련 호메오박스4(wox4) 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 이의 사용 방법 | |
| CN110343721B (zh) | 一种延迟家蚕化蛹的方法 | |
| JP3538428B2 (ja) | 植物プロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 | |
| CN108998455B (zh) | 家蚕核型多角体病毒诱导型39k启动子及其重组载体和应用 | |
| CA2265441A1 (en) | Protein kinases and uses thereof | |
| CN1265704A (zh) | 增加植物产量的方法 | |
| Kariuki et al. | In vitro host range studies with a new baculovirus isolate from the diamondback moth Plutella xylostella (L.)(Plutellidae: Lepidoptera) | |
| Lee et al. | Production of a cellulase in silkworm larvae using a recombinant Bombyx mori nucleopolyhedrovirus lacking the virus-encoded chitinase and cathepsin genes | |
| CN114716522B (zh) | Kin10蛋白及其相关生物材料在植物耐盐碱中的应用 | |
| CN113549560B (zh) | 一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株 | |
| Lee et al. | Gene Expression of Cotesiaplutellae Bracovlrus EP1-like Protein (CpBV-ELP1) in Parasitized Diamondback Moth, Plutellae xylostella | |
| KR100730875B1 (ko) | 번역반응 촉진 ｄｎａ 단편 및 그것을 사용한 무세포계단백질 합성방법 | |
| CN114317569A (zh) | 苹果基因MdBGLU40及在苹果树抗腐烂病中的应用 | |
| WO2000022100A2 (en) | Arthropod protein disulfide isomerases | |
| JP4353754B2 (ja) | 昆虫への遺伝子導入ベクターおよび遺伝子産物製造法 | |
| KR100446010B1 (ko) | 신규 재조합 배큘로바이러스 발현벡터 및 이를 이용한효소의 제조방법 | |
| Licari et al. | Production of a discrete, heterogeneous population of β‐galactosidase polypeptides using baculovirus expression vectors | |
| JP5308055B2 (ja) | β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ | |
| CN114214334B (zh) | 来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |