CN110343640B - 一种人肠道菌群的发酵方法和应用 - Google Patents

一种人肠道菌群的发酵方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人肠道菌群的发酵方法和应用，所述方法包括如下步骤：a.筛选供体：12‑14岁男孩，身体健康，无重大疾病史，无明显胃肠道症状，至少6个月内未服用过任何抗生素，生活规律；b.样本采集和处理：采集供体的新鲜粪便，迅速转移至厌氧工作站，称重，按照比例加入预还原的无菌生理盐水，充分涡旋混匀；然后过滤，收集粪悬液；c.发酵：将粪悬液转移至无菌血清瓶，密封后置于培养箱中静置发酵。本发明获得的pH酸性且富含多种益生菌的发酵产物是一种优化的健康人的肠道菌群，可用于粪菌移植技术以及以肠道菌群为靶点的药物、保健品等的开发。

Description

一种人肠道菌群的发酵方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物、临床、药品和保健品领域，具体涉及一种人肠道菌群发酵方法及其应用。
背景技术
人体肠道中定植着数量庞大、种类繁多的微生物，它们广泛参与人体的食物消化、代谢及免疫等生理活动，与人体健康息息相关。近年来的大量研究表明，肠道菌群失衡与肥胖、糖尿病、炎症性肠病、结直肠癌、自闭症等多种现代社会高发的慢性疾病密切相关，调节肠道菌群结构可以对疾病起到预防和治疗作用。
目前常用的调节肠道菌群的方法包括服用益生菌或益生元物质、膳食干预、粪菌移植等。其中，服用益生菌药品或保健品是应用较广泛的一种，该方法是通过补充一株或几株公认的有益细菌来发挥其益生效果。但是，有研究显示，单一或有限种类的益生菌在肠道中的定植能力较差，不能有效调节宿主肠道菌群的整体结构而发挥其功效。肠道菌群是一个复杂的生态系统，其中的细菌并不是各自独立的，而是相互作用形成生态学中的“功能群”来发挥功能，以应对系统环境的变化。因此，建立一个多样性高且富含益生菌的肠道微生物功能群是实现调节肠道菌群的更合理、有效的方法。
粪菌移植是近几年医学和微生物组学领域的一项热点技术，该方法运用了微生态学的概念，将健康人的整个粪便菌群转移到患者的肠道中，通过改变患者的肠道菌群，改善肠道稳态，达到治疗疾病的效果。研究人员已尝试将粪菌移植引入到复发性艰难梭菌感染、炎性肠病、自闭症等多种疾病的治疗中，但治疗的效果在不同的临床研究中并不一致。移植物中的肠道菌群组成是决定粪菌移植疗效的关键因素，但供体不同、粪悬液制备方法不同都会导致移植物中的菌群组成不同。一些表观“健康”的供体其肠道菌群组成有可能并不“健康”和平衡，甚至可能存在一些潜在的机会致病菌，如果将这样的菌群移植给患者，就可能严重影响治疗的效果。因此，发展能优化人肠道菌群结构的方法来获得益生菌含量高且无明显病原菌的肠道菌群组合物，在粪菌移植技术的发展和益生菌产品的开发方面具有应用前景。
温度是影响细菌生长的一个重要因素。现有的肠道菌群发酵多采用37℃，有研究显示，在该温度下进行肠道菌群的体外培养和发酵，变形菌门(Proteobacteria)细菌含量显著增加，而该门中包括多种公认的病原菌和常见的机会致病菌。因此，探索较低温度下肠道菌群发酵后细菌组成的特征，有可能建立一种机会致病菌含量低而潜在益生菌含量高的结构更健康的肠道菌群。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人肠道菌群的发酵方法，该方法简单易行、可操作性强。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种人肠道菌群的发酵方法，按照如下步骤进行：
a.筛选供体：12-14岁男孩，身体健康，无重大疾病史，无明显胃肠道症状，至少6个月内未服用过任何抗生素，生活规律；
b.样本采集和处理：采集供体的新鲜粪便，迅速转移至厌氧工作站，称重，按照比例加入预还原的无菌生理盐水，充分涡旋混匀；然后过滤，收集粪悬液；
c.发酵：将粪悬液转移至无菌血清瓶，密封后置于10～20℃培养箱中静置发酵。
优选地，所述预还原的无菌生理盐水为0.9％氯化钠溶液经121℃高温灭菌20分钟、厌氧工作站脱气和置换气体处理12小时以上制备而得；所述新鲜粪便与预还原的无菌生理盐水的混合比例为1:10(w/v)。
优选地，所述发酵步骤中，采用的粪悬液是1名供体的粪悬液，或者是2～5名供体的粪悬液的等体积混合物。
优选地，所述粪悬液在10℃培养箱中静置发酵的时间为30～120天。
更优选地，所述发酵的时间为30～90天。
本发明还提供了一种根据前述发酵方法获得的人肠道菌群在粪菌移植技术以及以肠道菌群为靶点的药物、保健品中的应用。
优选地，所述在粪菌移植技术的应用中，发酵获得的人肠道菌群以粪悬液或冻干菌剂的形式应用。
优选地，所述以肠道菌群为靶点的药物、保健品的应用中，发酵获得的人肠道菌群作为益生菌进行应用，应用剂型为胶囊剂、口服液、片剂或冲剂。
优选地，包括发酵获得的人肠道菌群在制备抗炎药物中的应用。
本发明还提供了一种根据前述发酵方法获得的人肠道菌群在抑制促炎细胞因子IL-8水平中的应用。
本发明的人肠道菌群发酵方法，通过筛选12～14岁童男作为供体以及对粪悬液进行低温厌氧发酵，得到的发酵产物有如下有益效果：
(1)pH降低至4.7～5.4，这种酸性的pH环境可以有效抑制肠道中多种机会性病原菌的生长；
(2)发酵产物为一个平衡的肠道菌群生态系统，其中Lactobacillus(乳杆菌)及Blautia、ClostridiumⅣ等多种短链脂肪酸产生菌含量显著增加，而大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌等机会病原菌含量低于1％或检测不到；
(3)发酵产物具有抗炎活性。
这些特性说明通过本发明的技术方法得到的肠道菌群发酵产物是一种优化的人肠道菌群系统。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1发酵过程中的pH测定；
图2为实施例1发酵体系中细菌的组成；
图3为实施例1发酵体系中显著变化的OTUs(操作分类单元)的含量；
图4为实施例1发酵产物的抗炎活性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：
一种人肠道菌群的发酵方法，包括以下步骤：
(1)筛选供体：选择3名12-14岁男孩(2名12岁，1名13岁)，身体健康，无重大疾病史，无明显胃肠道症状，至少6个月内未服用过任何抗生素，生活规律。
(2)样本采集和处理：采集每一位供体的新鲜粪便，迅速转移至厌氧工作站，称重，按照1:10(w/v)的比例加入预还原的无菌生理盐水，充分涡旋混匀；用双层纱布过滤，收集粪悬液；
所述预还原的无菌生理盐水为0.9％氯化钠溶液经121℃高温灭菌20分钟、厌氧工作站脱气和置换气体处理12小时以上制备而得。
(3)发酵：各取3名供体的粪悬液150mL，混合均匀，分装至无菌血清瓶，每瓶75mL，用硅胶塞和铝盖密封。其中3瓶为实施例1组，置于10℃培养箱中静置发酵；另外3瓶为对比例组，置于37℃(常规细菌发酵温度)培养箱中静置发酵。
上述粪悬液静置发酵120天，期间连续采集样本进行pH以及菌群结构的分析。
实施例1组和对比例组在发酵前2天pH均显著下降，对比例组2天后稳定在5.6左右，而实施例1组2天后仍然逐渐下降，pH处于4.7～5.4之间。结果见图1。
发酵过程中，实施例1组和对比例组中菌群的变化规律不同，实施例1组中，Blautia、Roseburia、Clostridium IV、Lactobacillus等属的细菌的含量显著高于对比例组，而对比例组中Bacteroides、Ruminococcus、Romboutsia等属的细菌含量高于实施例1组。在实施例1组中，Shigella(志贺氏菌)、Klebsiella(克雷伯氏菌)、Enterococcus(肠球菌)等机会病原菌含量低于1％或检测不到。结果见图2。
图3为实施例1组和对比例组两个体系中一些属于潜在益生菌的OTUs在发酵前后的含量变化。实施例1组中，属于Blautia、Roseburia、Coprococcus、Lactobacillus和Clostridium IV的多个OTUs的丰度在发酵后显著增加，它们是目前公认的乳酸产生菌和丁酸盐产生菌，具有潜在的益生效果。而对比例组中，属于Blautia、Faecalibacterium、Roseburia、Bifidobacterium、Anaerostipes、Butyricicoccus的多个OTUs含量显著下降，发酵90天后甚至接近于0，表明该体系中潜在益生菌在发酵后显著降低。以上数据表明本发明的发酵方法形成了一组结构更优的肠道菌群。
图4是实施例1组和对比例组的发酵产物对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型分泌促炎细胞因子IL-8的影响，结果显示，实施例1组使Caco-2细胞产生IL-8的水平显著低于对比例组，且远低于TNF-α诱导产生的IL-8水平。这说明实施例1的发酵产物具有抗炎活性。
实施例2：
一种人肠道菌群的发酵方法，包括以下步骤：
(1)筛选供体：选择3名12-14岁男孩(2名12岁，1名13岁)，身体健康，无重大疾病史，无明显胃肠道症状，至少6个月内未服用过任何抗生素，生活规律。
(2)样本采集和处理：采集每一位供体的新鲜粪便，迅速转移至厌氧工作站，称重，按照1:10(w/v)的比例加入预还原的无菌生理盐水，充分涡旋混匀；用双层纱布过滤，收集粪悬液；
所述预还原的无菌生理盐水为0.9％氯化钠溶液经121℃高温灭菌20分钟、厌氧工作站脱气和置换气体处理12小时以上制备而得。
(3)发酵：各取3名供体的粪悬液150mL，混合均匀，分装至无菌血清瓶，每瓶75mL，用硅胶塞和铝盖密封。其中3瓶为实施例2组，置于20℃培养箱中静置发酵；另外3瓶为对比例组，置于37℃(常规细菌发酵温度)培养箱中静置发酵。
上述粪悬液静置发酵120天，期间连续采集样本进行pH以及菌群结构的分析。
实施例2组和对比例组在发酵前2天pH均显著下降，对比例组2天后稳定在5.6左右，而实施例2组在4天后pH逐渐稳定，维持在5.2左右。对比二者肠道菌群组成，实施例2组在120天时含有24.53％的Faecalibacterium和18.55％的Blautia，显著高于对比例组(对比例组含有5.30％的Faecalibacterium和0.59％的Blautia)。Faecalibacterium和Blautia属的细菌具有较强的产生短链脂肪酸能力，是公认的肠道益生菌。在实施例2组中，Shigella(志贺氏菌)、Klebsiella(克雷伯氏菌)、Enterococcus(肠球菌)等机会病原菌含量未检测到。以上数据表明本实施例的发酵方法形成了一组结构更优的肠道菌群。
实施例3：
一种人肠道菌群的发酵方法，包括以下步骤：
(1)筛选供体：选择1名12岁男孩，身体健康，无重大疾病史，无明显胃肠道症状，至少6个月内未服用过任何抗生素，生活规律。
(2)样本采集和处理：采集该供体的新鲜粪便，迅速转移至厌氧工作站，称重，按照1:10(w/v)的比例加入预还原的无菌生理盐水，充分涡旋混匀；用双层纱布过滤，收集粪悬液；
所述预还原的无菌生理盐水为0.9％氯化钠溶液经121℃高温灭菌20分钟、厌氧工作站脱气和置换气体处理12小时以上制备而得。
(3)发酵：取该供体的粪悬液225mL，分装至3个无菌血清瓶，每瓶75mL，用硅胶塞和铝盖密封。置于10℃培养箱中静置发酵33天，期间连续采集样本进行菌群结构的分析。
实施例3组在发酵33天时，pH下降为5.35，属于潜在益生菌的Bifidobaterium、Blautia和Butyricicoccus等属的细菌含量显著高于对比例组，而常见机会性致病菌基本检测不到。本发明的发酵方法能够得到一组优化了的人肠道菌群。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种人肠道菌群的发酵方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
a. 筛选供体：12-14岁男孩，身体健康，无重大疾病史，无明显胃肠道症状，至少6个月内未服用过任何抗生素，生活规律；
b. 样本采集和处理：采集供体的新鲜粪便，迅速转移至厌氧工作站，称重，按照比例加入预还原的无菌生理盐水，充分涡旋混匀；然后过滤，收集粪悬液；
c. 发酵：将粪悬液转移至无菌血清瓶，密封后置于培养箱中静置发酵；
所述粪悬液的发酵温度为10℃，所述粪悬液的发酵时间为30～120天。
2.根据权利要求1所述的人肠道菌群的发酵方法，其特征在于，所述预还原的无菌生理盐水为0.9%氯化钠溶液经121℃高温灭菌20分钟、厌氧工作站脱气和置换气体处理12小时以上制备而得；所述新鲜粪便与预还原的无菌生理盐水的混合比例为1:10（w/v）。
3.根据权利要求1所述的人肠道菌群的发酵方法，其特征在于，所述发酵步骤中，采用的粪悬液是1名供体的粪悬液，或者是2～5名供体的粪悬液的等体积混合物。
4.根据权利要求1所述的人肠道菌群的发酵方法，其特征在于，所述发酵的时间为30～90天。
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