CN110339360B - 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用 - Google Patents

瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110339360B
CN110339360B CN201810284657.3A CN201810284657A CN110339360B CN 110339360 B CN110339360 B CN 110339360B CN 201810284657 A CN201810284657 A CN 201810284657A CN 110339360 B CN110339360 B CN 110339360B
Authority
CN
China
Prior art keywords
trpv3
psoriasis
scutellarin
skin
preventing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810284657.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110339360A (zh
Inventor
曹征宇
王雨晶
殷志琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhong Pharmaceutical Group Co ltd
Original Assignee
Suzhong Pharmaceutical Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhong Pharmaceutical Group Co ltd filed Critical Suzhong Pharmaceutical Group Co ltd
Priority to CN201810284657.3A priority Critical patent/CN110339360B/zh
Priority to CN202210683877.XA priority patent/CN115120728B/zh
Priority to PCT/CN2019/070763 priority patent/WO2019192239A1/zh
Publication of CN110339360A publication Critical patent/CN110339360A/zh
Priority to US16/849,555 priority patent/US11304926B2/en
Application granted granted Critical
Publication of CN110339360B publication Critical patent/CN110339360B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了瞬时受体电位阳离子通道，亚族V，成员3(Transient Receptor Potential cation channel,subfamily V,member 3,TRPV3)在银屑病中的病理生理作用，可用于研制预防或治疗银屑病的药物。本发明还公开了野黄芩素作为一种TRPV3的抑制剂，在制备预防或治疗银屑病的药物中的应用。将含有根据本发明发现的或本发明提供的TRPV3抑制剂的药物用于预防或治疗银屑病时能够获得良好的预防或治疗效果。

Description

瞬时受体电位阳离子通道TRPV3在研制预防或治疗银屑病药 物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地，涉及TRPV3抑制剂在预防或治疗银屑病的药物的应用以及野黄芩素作为TRPV3的抑制剂在治疗银屑病及其TRPV3功能增强/表达增加而引起的相关疾病药物中的应用。
背景技术
银屑病是一种常见的红斑鳞屑性皮肤炎症疾病，困扰着全世界2-3％的人群。根据临床特征，可将银屑病分为寻常型、关节型、脓疱型和红皮病型，而90％以上的银屑病属于寻常型。银屑病可出现于全身多个部位，典型的特征为表面附着银白色鳞屑的红色丘疹斑块。由于其病程较长，易复发，难根治，而且常造成患者外观损害，所以对患者的身体健康和精神状况均有较大影响。
根据《中国银屑病治疗指南(2008版)》，银屑病的治疗目的为控制病情，减轻症状，避免复发，提高患者生活质量。对于银屑病的治疗，他扎罗汀(维A酸类)、中效与强效糖皮质激素、卡泊三醇作为局部治疗的一线外用药物；根据银屑病类型，可联合光化学疗法，包括UVA、PUVA、宽谱UVB和窄谱UVB；同时内服抗感染药物、甲氨蝶呤、环孢素或生物制剂(依那西普)等，同时配合心理治疗。尽管目前的治疗方式多种多样，但是其中不乏产生不良反应的药物或治疗方式。比如为追求疗效而滥用糖皮质激素可能导致停药后皮损加重的现象，而且长期外用糖皮质激素会导致皮肤萎缩，屏障功能损伤等；长期光化学疗法容易导致皮肤老化、色素沉着和皮肤癌；环孢素类内服药物的主要不良反应是肾毒性，而维A酸类内服药物可能导致患者的骨质出现变化。因此，发现新颖的治疗银屑病的作用靶点并针对这一新靶点开发一种能够缓解病情，可以长期使用而不产生副作用的新型药物具有十分重要的意义。
目前，对银屑病的认识是一种自身免疫性炎症疾病，由各种炎症因子引起的角质细胞异常增生在疾病发展中起到关键作用。皮肤角质细胞不仅是炎症的应答者，也是炎症的加速者。而在皮肤角质细胞上广泛分布的多种离子通道参与着表皮分化与增殖，皮肤再生和免疫应答。
瞬时受体电位阳离子通道(Transient Receptor Potential cation channel,TRP)是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道超家族，在人体各个器官的几乎所有细胞中均有表达。TRP通道分为6个亚家族：TRPC(Cannonical,TRPC1-7)，TRPV(Vanilloid,TRPV1-6)，TRPM(Melastatin,TRPM1-8)，TRPP(Polycystin,TRPP2,TRPP3,TRPP5)，TRPML(Mucolipin,TRPML1-3)和TRPA(Ankyrin,TRPA1)。这些通道涉及的功能包括视觉，听觉，嗅觉，味觉和躯体感觉(比如痛觉，机械性刺激，温度感受等)。其中，温度敏感型瞬时受体电位通道包括TRPV1，TRPV2，TRPV3，TRPV4，TRPM8和TRPA1，在皮肤上表达于皮肤感觉神经元，用于感知外界温度的变化，而TRPV1，TRPV3则在角质形成细胞表达较高，有可能和皮肤炎症以及皮肤屏障的形成相关。
瞬时受体电位阳离子通道，亚族V，成员3(Transient Receptor Potentialcation channel,subfamily V,member 3,TRPV3)与首先鉴定的TRPV1有着43％的序列相似性。但是，TRPV3在感觉型背根神经节(sensory Dorsal Root Ganglia,DRG)和三叉神经节(Trigeminal Ganglia,TG)中表达较低，相反在皮肤中表达最为丰富，特别是在表皮和发囊角质细胞中。但由于缺乏特异性的激动剂以及特异性的抑制剂，TRPV3的生理功能研究较少。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了以TRPV3为靶点筛选预防或治疗银屑病的药物的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了TRPV3作为用于预防或治疗银屑病的药物靶点的证据，本发明研究表明皮肤炎症中TRPV3的表达升高和(或)活性增强，TRPV3活化导致皮肤角质细胞过度增殖并释放促炎症因子。
本发明具体技术方案如下：
瞬时受体电位阳离子通道TRPV3在研制预防或治疗银屑病的药物中的应用。
上述应用以TRPV3作为药物靶点，考察药物降低TRPV3在皮肤炎症中的表达和/或活性。
进一步的，所述药物为TRPV3抑制剂。所述TRPV3抑制剂包括可逆性、不可逆性、竞争性、非竞争性或反竞争性抑制剂或通道阻断剂。
进一步的，可利用过表达TRPV3的细胞系筛选并验证所述药物。优选的，所述的过表达TRPV3的细胞系包括经质粒转染或病毒感染得到的稳定表达TRPV3的工具细胞。
本发明提供了筛选及鉴定TRPV3抑制剂的高通量筛选方法，利用过表达TRPV3的细胞系利用特异性结合于钙的荧光探针筛选并鉴定对2-氨基乙氧基联苯硼酸盐(2-APB)诱导的细胞内钙增加有抑制的药物。
本发明的另一目的在于提供野黄芩素及其立体异构体、其在药学上可接受的盐和/或溶剂化物在制备瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂中的应用，所述野黄芩素具有式(1)结构。
上述瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂为预防或治疗由于TRPV3功能增强/表达增加而引起的相关疾病。优选的，所述疾病为银屑病。
本发明所述的疾病为银屑病，包括寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病中的一种或几种。
在本发明所述野黄芩素的制备方法没有特别的限定，本领域技术人员可以根据本领域内的公知常识制备本发明所述的野黄芩素，或者通过市售获得本发明所述的野黄芩素。在优选情况下，本发明所述的野黄芩素可以根据文献(Qian L H,Li N G,Tang Y P,etal.Synthesis and Bio-Activity Evaluation of Scutellarein as a Potent Agentfor the Therapy of Ischemic Cerebrovascular Disease[J].International Journalof Molecular Sciences,2011,12(11):8208-16.)中提供的方法制备得到。
本发明所述野黄芩素的立体异构体没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如可以是野黄芩素的对映异构体或非对映异构体。另外，本发明对所述在药学上可接受的盐也没有特别的限定，可以为本领域的常规选择。进一步的，本发明对所述溶剂化物也没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，在优选情况下，所述溶剂化物包括将野黄芩素溶于二甲基亚砜、吐温80、生理盐水、盐酸和乙醇中的一种或多种，优选为二甲基亚砜、吐温80或生理盐水。
进一步的，上述瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂还包括药学上可接受的载体。所述述TRPV3抑制剂的剂型没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，只要其可以实现便于使用且可以获得较好的治疗效果的目的即可。在优选的情况下，所述药物可以皮下注射剂、皮内注射剂、喷雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂中的一种或几种，进一步优选为皮下注射剂或软膏剂。当所述药物以上述剂型的形式被使用时，该药物还可以包括赋形剂、稳定化剂、保存剂、缓冲剂、助溶剂、乳化剂、稀释剂或等渗剂。
在本发明中对上述皮下注射剂、皮内注射剂、喷雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员所公知的方法，在此不再赘述。
在本发明中，对所述TRPV3抑制剂中野黄芩素的含量没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，只要能够获得良好的治疗效果即可，例如，所述野黄芩素的质量百分含量可以为0.1-5％。
本发明优点：
(1)本发明将瞬时受体电位阳离子通道TRPV3作为预防或治疗银屑病的药物靶点，为预防或治疗银屑病提供新的思路。
(2)利用本发明所述的过表达TRPV3细胞系能够方便地筛选并鉴定TRPV3抑制剂，具有很高的准确性。
(3)本发明研究发现野黄芩素及其立体异构体、其在药学上可接受的盐和/或溶剂化物能够有效抑制瞬时受体电位阳离子通道TRPV3，对银屑病具有很好的预防或治疗效果。给药方便，药物副作用小，毒性低，生物利用度高。进一步地，从本发明提供的研究结果可以看出:在5％咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)诱导的小鼠银屑病皮损中TRPV3表达增高，而活化TRPV3能够促进人永生化角质细胞系HaCaT的增殖及促炎症因子表达；利用脂质体转染得到的过表达TRPV3的HEK-293细胞系能够应答2-APB，而筛选得到的野黄芩素对2-APB诱导的钙内流及其电流具有明显的抑制作用。野黄芩素能够抑制TRPV3活化所导致的HaCaT细胞过度增殖和促炎症因子表达，并对5％IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损具有显著的缓解作用。
综上所述，将本发明所述的以TRPV3为靶点发现用于制备预防或治疗银屑病的药物具有很好的开发前景。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分的予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1A为本发明提供的实施方式中典型的由5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处外观；图1B为5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损PASI评分；图1C为典型的由5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处的病理变化；图1D为5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处表皮厚度统计。
图2A为本发明提供的优选实施方式中5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处TRPV3的蛋白表达；图2B为5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处TRPV3的蛋白水平定量图；图2C为在5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处TRPV3的mRNA转录水平。
图3A为在本发明提供的实施例中HaCaT细胞中TRPV3的蛋白表达；图3B为在HaCaT细胞上300μM 2-APB诱导的TRPV3电流；图3C为在HaCaT细胞上典型的TRPV3电流-电压曲线。
图4A为在本发明提供的实施例中TRPV3功能上调增加HaCaT细胞的增殖能力；图4B为TRPV3功能上调增加HaCaT细胞中白介素-6(Interleukin-6,IL-6)mRNA转录水平；图4C为TRPV3功能上调增加HaCaT细胞中白介素-8(Interleukin-8,IL-8)mRNA转录水平。
图5A为在本发明提供的实施例中2-APB在表达TRPV3的HEK-293细胞上诱导的电流，内置图为典型的TRPV3电流-电压关系；图5B为2-APB激动mTRPV3通道的量效关系。
图6A，利用细胞内钙荧光成像高通量筛选方法发现野黄芩素能够在稳定转染TRPV3的HEK-293细胞上抑制2-APB诱导的钙内流；图6B为不同浓度的野黄芩素在稳定转染mTRPV3通道的HEK-293细胞上抑制2-APB诱导的电流；图6C为野黄芩素对2-APB诱导的mTRPV3电流的抑制作用的量效关系。
图7A为在本发明提供的实施例中野黄芩素对TRPV3激动剂引起的HaCaT增殖的影响；图7B为在本发明的一种实施例中野黄芩素对HaCaT中IL-6转录水平的影响；图7C为野黄芩素对HaCaT中IL-8转录水平的影响。
图8A为本发明提供的优选实施方式中野黄芩素对IMQ诱导的小鼠银屑病模型外观的影响；
图8B为野黄芩素对小鼠银屑病模型诱导进程的影响。图8C为在本发明的一种实施例中野黄芩素对IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处病理变化的影响；图8D为野黄芩素对IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处表皮厚度的影响。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了以TRPV3为靶点研制预防或治疗银屑病药物的应用，包括寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病中的一种或几种。本发明还提供了野黄芩素作为一种TRPV3的抑制剂，在制备预防或治疗银屑病的药物中的应用。将含有根据本发明发现的或本发明提供的TRPV3抑制剂的药物用于预防或治疗银屑病时能够获得良好的预防或治疗效果，所述野黄芩素为式(1)所示的化合物。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所使用的各种试剂和材料均来自市售。
在以下优选实施方式中，使用5％咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)连续涂抹诱导的小鼠银屑病模型评价药物对银屑病的作用。IMQ诱导的银屑病模型是目前应用最为广泛的评价药物对银屑病进程的影响的模型。
在以下优选实施方式中，使用银屑病区域和严重性指数(Psoriasis Area andSeverity Index,PASI)评分标准对小鼠银屑病模型进行评价。PASI评分是临床试验中常用的评价银屑病严重程度的方法。
在以下优选实施方式中，使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法对小鼠皮肤石蜡切片进行染色，并进行病理学检查。
在以下优选实施方式中，所使用的实验C57BL/6小鼠均购自扬州大学比较医学中心，雌雄各半，体重18-20g，鼠龄6-8周。
在以下实施例中，使用人永生化角质细胞系HaCaT作为体外模型评价药物对皮肤胶质细胞功能的影响。HaCaT在实验中很好的表现出人角质细胞的特性，是广为认可的细胞模型。
在以下实施例中，通过MTT实验反映药物对细胞增殖的影响。
在以下实施例中，通过实时定量PCR实验反映药物对细胞或组织中特定基因的转录水平的影响。
在以下实施例中，编码TRPV3通道的质粒通过脂质体转染，在HEK-293细胞系中稳定表达TRPV3通道。
在以下实施例中，TRPV3抑制剂是在稳定表达TRPV3的HEK-293细胞吧上通过高通量检测药物对细胞内钙增加的抑制而发现，药物对TRPV3通道的作用进一步利用膜片钳放大系统(HEKA公司)进行检测的。
在以下实施例中，所使用的野黄芩素根据文献(文景兵,张庆文,殷志琦,等.木蝴蝶种子中黄酮类化学成分研究[J].中国药学杂志,2011,46(3):170-173.)中提供的方法制备得到。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供以TRPV3为靶点筛选预防或治疗银屑病药物的应用。
(1)咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型
购自扬州大学比较医学中心的16只C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重18-20g。剃除小鼠背毛，用记号笔在背部皮肤上画出2×1.5cm的造模区域。将小鼠按雌雄，分别随机分成2组(每组8只)。实验前将小鼠放置在安静、避强光的环境中饲养3天以适应环境，光照与黑暗时间比为1:1，室温控制在25℃，湿度55％，小鼠能够自由进食和饮水。将62.5mg 5％(0.1g:2g)咪喹莫特软膏(珠海联邦制药股份有限公司)连续涂抹于小鼠背部皮肤6天诱导银屑病样皮损，对照组给予同等剂量的凡士林软膏。于造模第1，3，5天，对小鼠背部皮肤进行拍照记录，造模第5天皮肤外观如图1A所示。
(2)小鼠银屑病模型临床症状评价
小鼠银屑病模型的临床症状采用PASI评分标准，从红斑、鳞屑和浸润增厚3项指标进行评价，以0～4分进行记分，将3个指标的积分相加得到总积分。PASI评分标准如下：0分，无症状；1分，轻度；2分，中度；3分，重度；4分，极重度。每天于涂抹IMQ软膏之前进行PASI评价。结果如图1B和表1所示，注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，使用单因素方差分析检测，分析结果中，**P<0.01，相对于对照组(Vaseline)。
连续涂抹咪喹莫特乳膏会导致小鼠背部皮肤出现银屑病样皮损，临床特征为红斑、鳞屑和皮肤增厚，较凡士林组有显著性差异(图1B和表1)。
表1：咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型皮肤外观的PASI评分
注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，使用单因素方差分析检测，分析结果中**P<0.01，模型组和对照组比较
(3)小鼠银屑病模型组织病理学检查
脱颈处死小鼠后，按记号笔标记区域取皮肤组织，皮肤组织采用10％(质量分数)多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，行3μm切片，进行HE染色。使用Eclipse Ti型倒置显微镜(尼康株式会社，东京，日本)于400倍放大倍数下观察并拍照，使用NIS-element BR软件(尼康株式会社，东京，日本)对皮肤表皮层厚度进行测量，每张切片随机选取6个视野。结果如图1C和图1D所示，从HE染色的皮肤组织切片可以看出，在咪喹莫特诱导的银屑病样皮损处，皮肤棘皮层显著增厚，颗粒层断裂或消失，角质层角化过度，表皮层中偶见朗格汉斯细胞等炎性细胞浸润。而凡士林组皮肤各层呈现正常生理形态，表皮层厚度显著低于咪喹莫特造模组(图1C和图1D)。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，使用单因素方差分析检测，**表示P<0.01，咪喹莫特造模组相对于凡士林对照组。
(4)小鼠银屑病模型中TRPV3蛋白水平
称取20mg皮肤组织，液氮研磨至粉末，加入100μL裂解液(裂解液的蛋白酶抑制剂及PMSF临用前加入)，将裂解产物转移至1.5mL离心管中。用电动匀浆器冰上研磨20s后，于4℃，12000rpm离心15min，将上清液转移至新的0.5mL离心管中，取4μL上清液用于蛋白浓度测定。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书配制标准蛋白及样品蛋白溶液，于酶标仪562nm波长处测定蛋白标准曲线及样品蛋白含量。具体操作流程不再赘述。配置10％分离胶和浓缩胶。已变性的蛋白样品涡旋，离心(12000rpm，5min)后，将预染的蛋白marker(1μL)及蛋白样品(约20μg)上样于点样孔内，最外侧的两个泳道加入裂解液上样缓冲液混合液。恒定电压80V电泳40分钟，再调节电压至120V电泳60分钟。采用湿法将蛋白从胶中转印至硝酸纤维素膜上，恒定电流320mA转印70分钟。转膜结束后，取出硝酸纤维素膜，浸入TBS溶液中振摇洗涤5分钟，用5％脱脂奶粉封闭液室温振荡封闭1h；封闭结束后，用新鲜的封闭液按1：1000比例稀释TRPV3抗体(Novus，货号：NBP2-12909)，4℃振荡孵育过夜；一抗孵育结束后，用1×TBST溶液洗膜4次，室温振荡，每次5分钟。再用TBS溶液洗涤5分钟。用5％脱脂奶粉以1:10000比例配制680RD荧光二抗(LI-COR，林肯，美国)，避光室温孵育1小时；二抗孵育结束后，用l×TBST洗膜4次，室温振荡，每次5分钟。再用TBS溶液洗涤5分钟。将洗涤过的硝酸纤维素膜蛋白面朝下放置于奥德赛红外荧光扫描成像系统(LI-COR，林肯，美国)专用的玻璃板上，避免产生气泡，预览后设置合适的参数，避免过曝，进行显影，如图2A所示。使用Image Studio version 5.2软件(LI-COR，林肯，美国)计算目标蛋白的荧光值，结果如图2B所示。注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，分析结果中，*P<0.05，咪喹莫特造模组相对于凡士林组。
(5)小鼠银屑病模型中TRPV3 mRNA水平
称取20mg皮肤组织，液氮研磨至粉末，加入0.5mL Trizol(Vazyme，货号：R401-01)，冰上孵育10分钟。将裂解产物转移至1.5mL无酶(RNase-free)离心管中，加入100μL氯仿剧烈振荡15秒，冰上静置2分钟。于4℃，12000rpm离心10分钟。吸取上层水相到新的1.5mLRNase-free离心管中，加入等量的异丙醇沉淀RNA。再于4℃，12000rpm离心10分钟。弃上清，加入DEPC水配置的75％乙醇500μL洗涤RNA沉淀。再于4℃，12000rpm离心5分钟。弃上清，略干燥RNA沉淀，用10μL DEPC水溶解RNA。取1μL进行浓度检测，检测仪器是Nano-100超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，货号：AS-11010)。再取500ng RNA进行逆转录反应，按II One Step RT-PCR Kit(Vazyme，货号：P611-01)说明书进行操作。逆转录产物于-20℃保存，备用。
TRPV3引物(前引：5’-CGGTCACCAAGACCTCTCCA-3’，SEQ ID NO:1，后引：5’-CGCTCGGACTGTTGGGATTG-3’，SEQ ID NO:2)由南京思普金生物有限公司合成。实时定量PCR反应按照AceQ qPCRGreen Master Mix(Vazyme，货号：Q111-01)说明书在实时荧光定量PCR系统(QuantStudio3,Thermo Fisher Scientific,USA)中进行。反应体系为1μL逆转录产物，0.5μL 10μM前引，0.5μL 10μM后引，8μL DEPC水和10μL染料预混液；反应条件为：95℃预变性10分钟，94℃变性30秒，60℃退火与延伸30秒(采集一次信号)，变性、退火与延伸反复进行40次；随后进入溶解曲线反应：95℃维持1分钟，55摄氏度维持1分钟，然后开始每个循环增加0.5摄氏度，维持13秒(采集一次信号)，共81个循环，增加到95℃结束。实时定量PCR的数据以2-ΔΔCt法进行处理，以相对于凡士林组的mRNA转录水平反映IMQ造模对皮肤中TRPV3表达的影响，结果如图2C所示。注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，分析结果中，*表示P<0.05，咪喹莫特造模组相对于凡士林组。
根据图2的结果可以看出，IMQ诱导的小鼠银屑病模型的皮损处TRPV3的转录和翻译水平都显著高于正常皮肤。以上结果表明TRPV3在银屑病的病理进程中发挥重要作用，可能用于预防和治疗银屑病等皮肤炎症的药物靶点。
实施例2
本实施例用于进一步说明本发明提供的以TRPV3为靶点筛选预防或治疗银屑病的药物的应用。
(1)人永生化角质细胞HaCaT细胞系的培养
人永生化角质细胞HaCaT细胞系购自赛百慷生物技术有限公司(上海，中国)。HaCaT细胞培养条件为含10％FBS(GIBCO，货号16000-044)的DMEM培养基(GIBCO，货号11965-092)，于5％CO2，37℃，湿度为70％-80％的培养箱中培养。如果细胞密度达80％-90％，即可进行传代培养。弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS(包含137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH＝7.4)润洗细胞1-2次。加2mL消化液(0.25％Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。按6-8mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
(2)HaCaT细胞系中中TRPV3蛋白水平
HaCaT细胞和HEK-293细胞培养于T-60小皿中，汇合度为70％-80％。吸弃培养基，用预冷的PBS润洗细胞3次后，加入100μL裂解液(裂解液的蛋白酶抑制剂及PMSF临用前加入)，持续轻摇使裂解液充分浸润细胞，待细胞裂解完全不再贴壁，即可将细胞裂解液及细胞转移至1.5mL离心管中。蛋白定量及Western Blot按照实施例1(5)所述进行，结果如图3A。
(3)HaCaT细胞系功能性表达TRPV3
将HaCaT细胞系接种至T-60小皿中，汇合度为20-30％，次日用膜片钳放大系统进行全细胞电流记录。记录电极由硼硅酸盐玻璃管(Sutter Instruments Inc,CA,USA)经微电极拉制仪(P-1000,Sutter Instruments Inc,CA,USA)拉制，电极电阻约为5MΩ。记录电极内冲灌电极内液，电极内液包含140mM CsCl,1mM MgCl2,5mM EGTA,10mM Hepes和0.1mMCaCl2,pH值为7.20。记录时，HaCaT细胞系置于细胞浴液中，细胞浴液含140mM NaCl,5mMKCl,2mM CaCl2,1mM MgCl2,10mM glucose和10mM Hepes，pH值为7.40。电流信号以10kHz频率采集并以2.9kHz滤波。为了记录全细胞电流，细胞膜钳制电位从-60mV步阶至-100mV，维持10ms；在300ms内，再从-100mV逐渐连续(即斜坡ramp)增加至+100mV；在+100mV维持10ms后，电压降低至钳制电压。使用快速溶液转换器搭配氮气灌流系统(RSC-200,ALAScientific Instruments,NY,USA)在膜片钳记录过程中给予不同药物。每种溶液在氮气压力驱动下通过不同管道经灌流微管在距离细胞50μm处持续灌流。
形成全细胞记录模式之后，给予多次上述电压变化刺激，刺激之间间隔680ms。灌流含0.3mM 2-APB的细胞浴液，维持80s后，用细胞浴液洗脱。通过膜片钳放大系统检测mTRPV3通道介导的全细胞电流，并绘制灌流前，灌流2-APB时及洗脱后电流稳定时的一次刺激的电流-电压关系，以验证HaCaT细胞系中功能性表达TRPV3，结果如图3B和图3C所示，300μM2-APB能够在HaCaT上诱导出电流，该电流能被洗脱；而TRPV3通道介导的电流变化具有电压依赖性，且表现出特有的外向整流特征，反转电位为0mV。根据图3的结果可以看出，HaCaT细胞系表达有功能性TRPV3。
(4)TRPV3活化促进HaCaT细胞增殖
利用MTT实验检测药物处理HaCaT细胞系12小时后的细胞活力。具体步骤如下:常规消化细胞，将细胞密度调节为1×105个/mL的HaCaT细胞接种于96孔板中，每孔100μL。每个处理组设置6个复孔。完全培养基与基础培养基按1:5比例稀释后，每孔加入100μL，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，同步细胞状态。次日，用含溶剂对照，TRPV3激动剂2-APB(10μM)，或香芹酚(100μM,Carvacrol)，及TRPV3抑制剂钌红(30μM,Ruthenium Red,RR)及钌红加2-APB或香芹酚处理12小时后，在避光条件下每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，随后弃掉孔内液体，加入150μL二甲基亚砜，置于摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪490nm波长(630nm作为参考波长)处测定各孔的吸光度(OD)值。吸光度值大小与细胞活力成正比，以各组吸光度值与溶剂对照组的吸光度值的比值反映药物处理对细胞增殖的影响，结果如图4A所示。注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，分析结果中，**P<0.01，激动剂组相对于溶剂对照组；##P＜0.01，钌红加2-APB组相对于2-APB组；$$P＜0.01，钌红加香芹酚组相对于香芹酚组(使用单因素方差分析检测)。
根据图4A的结果可以看出，TRPV3激动剂2-APB和香芹酚可以促进HaCaT细胞的增殖能力，而抑制剂钌红能够抑制由TRPV3活化介导的细胞增殖。以上结果表明银屑病皮损处表达升高的TRPV3能够参与角质细胞的过度增殖。
(5)TRPV3活化促进HaCaT细胞促炎症因子的转录
利用实时定量PCR检测药物处理HaCaT细胞系2小时后IL-6和IL-8的mRNA水平。具体步骤如下：常规消化细胞，接种于6孔板中，每孔含4×105个细胞。待细胞贴壁之后，用含有溶剂对照，TRPV3激动剂混合物(2-APB+香芹酚)，钌红及钌红加TRPV3激动剂混合物处理细胞2小时。每孔加入Trizol(Vazyme，货号：R401-01)0.5mL，RNA提取及逆转录按照实施例1(4)所述进行。IL-6引物(前引：5’-GTGTGAAAG CAGCAAAGAG-3’，SEQ IDNO:3，后引：5’-CTCCAAAAGACCAGTGATG-3’，SEQ ID NO:4)和IL-8引物(前引：5’-GTCCTTGTTCCACTGTGCCT-3’，SEQ ID NO:5；后引：5’-GCTTCCACATGTCCTCACAA-3’，SEQ ID NO:6)由南京思普金生物有限公司合成。实时定量PCR反应按照实施例1(4)所述进行。实时定量PCR的数据以2-ΔΔCt法进行处理，以相对于溶剂对照组(Vehicle)的mRNA转录水平反映药物处理对HaCaT细胞炎症因子表达的影响，结果如图4B和图4C所示。根据图4B和图4C的结果可以看出，TRPV3激动剂混合物可以促进HaCaT细胞的IL-6和IL-8转录水平，而钌红能够抑制因TRPV3活化介导的相关促炎症因子转录。以上结果表明银屑病皮损处表达升高的TRPV3可能通过介导角质细胞表达促炎症因子参与皮肤炎症的进程。注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，分析结果中，**P<0.01，激动剂组相对于溶剂对照组；#P＜0.05，##P＜0.01，钌红加激动剂混合物组相对于TRPV3激动剂混合物组(使用单因素方差分析检测)。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的TRPV3抑制剂优选地为野黄芩素在预防或治疗银屑病药物的应用。
(1)稳定转染TRPV3的细胞系的获得，培养及鉴定
mTRPV3质粒由the University of Texas Health Science Center,MichaelX.Zhu教授赠予。
转染步骤：汇合度70-80％且生长状态良好的HEK293细胞于转染前一天接种于T-60小皿中，每个小皿含4×105个细胞，添加无双抗培养，于37℃5％CO2环境中过夜培养。次日，10μL质粒(质粒浓度为1000ng/μL)稀释至250μl DMEM(DMEM，货号：12800017，Gibco)中，10μL Lipofectamine 2000(Lipofectamine 2000，货号：11668027，Gibco)稀释至250μLDMEM中，将250μL Lipofectamine 2000稀释液逐滴加入250μL质粒稀释液中(缓慢混合均匀)，将混合物室温孵育1h，将混合物逐滴均匀加入T-60小皿中，转染6h后移除混合物，加入正常培养基5mL培养。转染48h后消化传代(依据细胞分裂速度)，加入抗生素G418(货号：11811031，Gibco)1mg/mL(选择性培养基)筛选10天左右，待细胞稳定生长。采用有限稀释法挑选单克隆：将筛选过后的细胞消化计数，以104细胞/孔、103细胞/孔、102细胞/孔、10细胞/孔、1细胞/孔的密度依次接种于96孔板中。荧光显微镜下观察，标记带有绿色荧光的单个细胞的孔，该孔扩增出的细胞即为稳定转染mTRPV3的HEK-293细胞。稳定转染mTRPV3的HEK-293细胞培养于含10％FBS(Fetal Bovine Serum,货号：F2442,Sigma)和1mg/mL G418的DMEM中。细胞传代按照实施例2(1)所述进行。
将稳定转染mTRPV3的HEK-293细胞接种至T-60小皿中，汇合度为20-30％，全细胞电流记录按照实施例2(3)所述进行。依次灌流含0.01,0.03,0.1,0.3和1mM 2-APB的细胞浴液，维持50s。各浓度药物转换之间，通过灌流细胞浴液对药物作用进行洗脱，避免药物累积。通过膜片钳放大系统检测mTRPV3通道介导的全细胞电流，并绘制不同浓度2-APB作用下电流稳定时的一次刺激的电流-电压关系，以对所建立的细胞模型进行验证，并且根据各浓度2-APB诱导的最大外向电流计算2-APB的半数有效浓度(EC50)，结果如图5所示。
根据图5的结果可以看出，2-APB能够剂量依赖性地增加mTRPV3通道介导的全细胞电流(图5A)，mTRPV3通道介导的电流变化具有电压依赖性，且表现出特有的外向整流特征，反转电位为0mV(图5A内置图)；2-APB对mTRPV3通道的EC50值为289.4μM(图5B)。以上结果表明该细胞模型可以很好地反映药物对mTRPV3通道的作用，适用于进行针对mTRPV3通道的活性药物的筛选。
(2)野黄芩素在过表达TRPV3的HEK-293细胞上抑制2-APB诱导的细胞内钙浓度增加
将稳定转染mTRPV3的HEK-293细胞接种至PDL包被的黑壁底透96孔板，每孔2×104个细胞，待细胞贴壁后，弃去原培养基，每孔加入60μL由Locke’s缓冲液(8.6mM HEPES,5.6mM KCl,154mM NaCl,5.6mM Glucose,1.0mM MgCl2,2.3mM CaCl2,0.0001mM glycine,pH7.4)稀释的4μM Fluo-4染料，37℃孵育60分钟，随后用Locke’s缓冲液润洗5次，将细胞板放入30℃预热的(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)，在488nm波长下激发，在515-575nm范围内以1s的采样间隔记录荧光信号。60s的基础荧光信号采集之后，加入溶剂对照、野黄芩素(终浓度为10μM)和钌红(终浓度为30μM)，继续采集240s，随后加入2-APB(终浓度为300μM)，继续采集300s荧光信号。荧光信号以F/F0表示，其中F为不同时间点的荧光信号，F0为基础荧光信号，即最初5个时间点荧光信号的平均值。结果如图6A所示。
(3)野黄芩素抑制mTRPV3通道的电流
将稳定转染mTRPV3的HEK-293细胞接种至T-60小皿中，汇合度为20-30％，次日用膜片钳放大系统进行全细胞电流记录。先灌流含2-APB(100μM)的细胞浴液，再灌流含不同浓度的野黄芩素(0.3,1,3,10,30μM)和2-APB(100μM)的细胞浴液，记录2-APB诱导的mTRPV3通道介导的最大外向电流(Imax)及野黄芩素和2-APB同时作用下mTRPV3通道介导的外向电流，根据mTRPV3通道介导的全细胞电流的外向电流抑制率计算出野黄芩素的半数有效浓度(IC50)，结果如图6B和图6C所示。
根据图6的结果可以看出，野黄芩素能够抑制2-APB诱导稳定转染mTRPV3的HEK-293细胞内钙浓度增加(图6A)；野黄芩素能够抑制2-APB诱导的mTRPV3介导的全细胞电流，并且具有剂量依赖性(图6B)；野黄芩素对mTRPV3通道的IC50值为1.01μM(图6C)。以上结果表明野黄芩素可以抑制mTRPV3通道的活性，可能用于治疗因TRPV3通道过度活化引起的疾病。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的TRPV3抑制剂优选地为野黄芩素在预防或治疗银屑病药物的应用。
(1)野黄芩素抑制TRPV3激动剂诱导的HaCaT细胞增殖
利用MTT实验检测药物处理HaCaT细胞系12小时后的细胞活力。具体步骤按照实施例2(4)所述进行，结果如图7A所示。根据图7A的结果可以看出，TRPV3激动剂2-APB和香芹酚可以促进HaCaT细胞的增殖能力，而野黄芩素能够抑制因TRPV3活化介导的细胞增殖。以上结果表明野黄芩素可以通过抑制TRPV3通道的活性，降低HaCaT细胞的过度增殖。注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，分析结果中，*P＜0.05，**P<0.01，2-APB或香芹酚组相对于溶剂对照组；#P＜0.05，野黄芩素+2-APB组相对于2-APB组；$P＜0.05，野黄芩素+2-APB相对于香芹酚组(使用单因素方差分析检测)。
(2)野黄芩素抑制TRPV3激动剂诱导的HaCaT细胞的IL-6和IL-8转录
利用实时定量PCR检测药物处理HaCaT细胞系2小时后IL-6和IL-8的mRNA水平。具体步骤按照实施例2(5)所述进行，结果如图7B和图7C所示。根据图7B和图7C的结果可以看出，TRPV3激动剂2-APB和香芹酚可以促进HaCaT细胞的IL-6和IL-8转录水平，而野黄芩素能够抑制由于TRPV3活化介导的相关促炎症因子转录。以上结果表明野黄芩素可以通过抑制TRPV3通道的活性从而降低HaCaT细胞的相关促炎症因子转录水平。注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，分析结果中，**P<0.01，TRPV3激动剂混合物组相对于溶剂对照组；##P＜0.01，野黄芩素+激动剂混合物组相对于TRPV3激动剂混合物组(使用单因素方差分析检测)。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的TRPV3抑制剂优选地为野黄芩素在预防或治疗银屑病药物的应用。
(1)野黄芩素改善5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损
购自扬州大学比较医学中心的32只C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重18-20g。将小鼠按雌雄，分别随机分成4组(每组8只)。小鼠银屑病模型的建立按照实施例1(1)所述进行，在造模的过程中，对小鼠造模区域皮肤进行皮下注射含溶剂对照，0.1％地塞米松，0.1‰野黄芩素，0.2‰野黄芩素的生理盐水，每次100μL，每天2次。
于造模第1，3，5天，对小鼠背部皮肤进行拍照记录。临床症状采用PASI评分标准，按照实施例1(2)所述进行，结果如图8A，图8B和表2所示。
表2 野黄芩素在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型皮肤皮肤外观的PASI评分(n＝8)
注：计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，使用单因素方差分析检测，分析结果中**，P<0.01，给药组相对于咪喹莫特模型组。
连续涂抹咪喹莫特乳膏会导致小鼠背部皮肤出现银屑病样皮损，临床特征为红斑、鳞屑和皮肤增厚。溶剂对照组小鼠皮肤损伤最为严重。皮下注射含地塞米松和不同浓度的野黄芩素能够不同程度地减轻小鼠背部银屑病样皮损(图8A)，并延缓咪喹莫特诱导的皮肤损伤出现(图8B和表2)。
小鼠银屑病模型组织病理学检查按照实施例1(3)所述进行，结果如图8C和图8D所示。从HE染色的皮肤组织切片可以看出，溶剂对照组小鼠皮肤棘皮层显著增厚，颗粒层断裂或消失，角质层角化过度，表皮层中偶见朗格汉斯细胞等炎性细胞浸润。而皮下注射地塞米松和不同浓度野黄芩素可以改善上述由咪喹莫特诱导的皮肤病理变化(图8C)并显著降低银屑病样皮损处的表皮层厚度(图8D)。
由上述实施例的结果可以看出，本发明所述的TRPV3通道在银屑病皮损处表达升高，该通道活化能够促进人永生化皮肤角质细胞HaCaT细胞增殖和促炎症因子的表达，而TRPV3抑制剂钌红能够抑制由于TRPV3活化而导致的皮肤角质细胞增殖以及以及TRPV3活化而导致的皮肤角质细胞促炎因子的表达，因此TRPV3能够成为一个治疗银屑病的理想靶点，由此可知，将本发明所述的以TRPV3为靶点能够筛选预防或治疗银屑病的药物，具有很好的开发前景。本发明所述的野黄芩素为TRPV3抑制剂，能够显著降低TRPV3活化引起的HaCaT细胞增殖和促炎症因子表达，进一步地，野黄芩素可改善5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损。因此野黄芩素能够预防或治疗银屑病的药物，进一步的，能够治疗由于TRPV3功能增强而导致的其它疾病。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 中国药科大学
<120>瞬时受体电位阳离子通道TRPV3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggtcaccaa gacctctcca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgctcggact gttgggattg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtgaaagc agcaaagag 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctccaaaaga ccagtgatg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtccttgttc cactgtgcct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcttccacat gtcctcacaa 20

Claims (3)

1.野黄芩素、其在药学上可接受的盐作为唯一活性成分在制备预防或治疗银屑病皮损的药物中的应用，所述野黄芩素具有式（1）结构:式（1），所述药物为皮下注射剂、皮内注射剂、喷雾剂、粉雾剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为皮下注射剂或软膏剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为外用溶液剂。
CN201810284657.3A 2018-04-02 2018-04-02 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用 Active CN110339360B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810284657.3A CN110339360B (zh) 2018-04-02 2018-04-02 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用
CN202210683877.XA CN115120728B (zh) 2018-04-02 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用
PCT/CN2019/070763 WO2019192239A1 (zh) 2018-04-02 2019-01-08 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用
US16/849,555 US11304926B2 (en) 2018-04-02 2020-04-15 Application of transient receptor potential cation channel TRPV3 in developing drug for preventing or treating psoriasis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810284657.3A CN110339360B (zh) 2018-04-02 2018-04-02 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210683877.XA Division CN115120728B (zh) 2018-04-02 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110339360A CN110339360A (zh) 2019-10-18
CN110339360B true CN110339360B (zh) 2024-04-19

Family

ID=68100097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810284657.3A Active CN110339360B (zh) 2018-04-02 2018-04-02 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11304926B2 (zh)
CN (1) CN110339360B (zh)
WO (1) WO2019192239A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110664990B (zh) * 2019-11-07 2021-03-16 江南大学 一种trpc1肽类分子在制备治疗病毒感染引起的炎症的药物中的应用
CN111388485B (zh) * 2020-04-23 2022-05-24 安徽医科大学第二附属医院 2-apb在制备治疗骨关节炎药物中的应用
CN113975372B (zh) * 2021-11-11 2023-06-23 中国人民解放军空军军医大学 一种采用激动剂制备抑制银屑病药物的用途
CN116492358A (zh) * 2023-04-10 2023-07-28 陕西中医药大学 野黄芩苷单体的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004037184A3 (en) * 2002-10-24 2004-07-08 The Quigley Corp Methods for the treatment of skin disorders
CN1890232A (zh) * 2003-12-05 2007-01-03 默克专利股份有限公司 类黄酮衍生物
CN101233132A (zh) * 2005-05-09 2008-07-30 海德拉生物科学公司 调节trpv3功能的化合物
CN103655547A (zh) * 2013-12-18 2014-03-26 成都中医药大学 野黄芩素的新用途
KR101396387B1 (ko) * 2013-03-28 2014-05-19 부산대학교 산학협력단 재조합 아밀로수크라제를 이용한 바이칼레인-6-알파-d-글루코사이드의 제조방법, 및 이에 의해 제조된 바이칼레인-6-알파-d-글루코사이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN106883244A (zh) * 2017-02-15 2017-06-23 中国药科大学 野黄芩素衍生物及其制备方法和应用
WO2018005695A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Menlo Therapeutics Inc. Use of neurokinin-1 antagonists to treat a variety of pruritic conditions

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7893260B2 (en) * 2005-11-04 2011-02-22 Hydra Biosciences, Inc. Substituted quinazolin-4-one compounds for antagonizing TRPV3 function
WO2008033564A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Hydra Biosciences Inc. Compounds for modulating trpv3 function
KR101034300B1 (ko) * 2008-12-02 2011-05-16 고려대학교 산학협력단 Ｔｒｐｖ３ 활성 억제 약물 및 이의 활용
CA2924224C (en) * 2012-09-14 2023-03-21 John M. Stewart Trpv3 agonists for the treatment of skin conditions

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004037184A3 (en) * 2002-10-24 2004-07-08 The Quigley Corp Methods for the treatment of skin disorders
CN1890232A (zh) * 2003-12-05 2007-01-03 默克专利股份有限公司 类黄酮衍生物
CN101233132A (zh) * 2005-05-09 2008-07-30 海德拉生物科学公司 调节trpv3功能的化合物
KR101396387B1 (ko) * 2013-03-28 2014-05-19 부산대학교 산학협력단 재조합 아밀로수크라제를 이용한 바이칼레인-6-알파-d-글루코사이드의 제조방법, 및 이에 의해 제조된 바이칼레인-6-알파-d-글루코사이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN103655547A (zh) * 2013-12-18 2014-03-26 成都中医药大学 野黄芩素的新用途
WO2018005695A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Menlo Therapeutics Inc. Use of neurokinin-1 antagonists to treat a variety of pruritic conditions
CN106883244A (zh) * 2017-02-15 2017-06-23 中国药科大学 野黄芩素衍生物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Baicalein increases keratin 1 and 10 expression in HaCaT keratinocytes via TRPV4 receptor activation;Huang et al.;《Exp Dermatol》;第25卷(第8期);623-629 *
杨秀伟.灯盏乙素.《中药成分的吸收、分布、代谢、排泄、毒性与药效 上》.2006, *
邓大学.银屑病.《中医临床粹要进展篇》.2001, *
银屑病瘙痒特征及其发生机制的初步研究;刘芳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (医药卫生科技辑)》;E075-31 *
黄芩甙治疗寻常银屑病近期疗效初报;郑茂荣等;《中国皮肤性病学杂志》;19900829;第217-219页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019192239A1 (zh) 2019-10-10
US11304926B2 (en) 2022-04-19
CN115120728A (zh) 2022-09-30
CN110339360A (zh) 2019-10-18
US20200246305A1 (en) 2020-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110339360B (zh) 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用
Wright et al. Erythropoietin receptor expression in adult rat cardiomyocytes is associated with an acute cardioprotective effect for recombinant erythropoietin during ischemia‐reperfusion injury
Mahmood et al. Interactions between retinoids and TGF β s in mouse morphogenesis
Yang et al. Functional TRPV1 expression in human corneal fibroblasts
Tian et al. Melanosome transport and regulation in development and disease
EP3498278B1 (en) Compounds for treatment of diseases related to dux4 expression
Liu et al. Role of NLRC5 in progression and reversal of hepatic fibrosis
Weickert et al. Striatal TGF-α: postnatal developmental expression and evidence for a role in the proliferation of subependymal cells
Chuang et al. On the range of hedgehog signaling
Benzoni et al. The funny current: Even funnier than 40 years ago. Uncanonical expression and roles of HCN/f channels all over the body
Xiong et al. Autophagy is required for remodeling in postnatal developing ribbon synapses of cochlear inner hair cells
Brown et al. Mouse model of testosterone-induced muscle fiber hypertrophy: involvement of p38 mitogen-activated protein kinase-mediated Notch signaling
Li et al. TRPM7 channels mediate the functional changes in cardiac fibroblasts induced by angiotensin II
He et al. Long noncoding RNA CASC2 facilitated wound healing through miRNA-155/HIF-1α in diabetic foot ulcers
Chung et al. TGF-β-stimulated aberrant expression of class III β-tubulin via the ERK signaling pathway in cultured retinal pigment epithelial cells
Tang et al. Serotonin/5‐HT7 receptor provides an adaptive signal to enhance pigmentation response to environmental stressors through cAMP‐PKA‐MAPK, Rab27a/RhoA, and PI3K/AKT signaling pathways
Yang et al. Stimulation of epithelial sodium channels in endothelial cells by bone morphogenetic protein‐4 contributes to salt‐sensitive hypertension in rats
Li et al. The chemokine-like factor 1 induces asthmatic pathological change by activating nuclear factor-κB signaling pathway
Zhang et al. Protective effects of Notch1 signaling activation against high glucose-induced myocardial cell injury: analysis of its mechanisms of action
Chen et al. Roles and mechanisms of TRPC3 and the PLCγ/PKC/CPI-17 signaling pathway in regulating parturition Corrigendum in/10.3892/mmr. 2018.8572
CN115120728B (zh) 瞬时受体电位阳离子通道trpv3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用
Jung et al. A potential role of somatostatin and its receptor SSTR4 in the migration of hepatic oval cells
US20170326118A1 (en) Drug treatment of tumors wherein hedgehog/smoothened signaling is utilized for inhibition of apoptosis of tumor cells
WO2007041965A1 (fr) L&#39;application de trpc dans le criblage de médicaments antitumoraux et l&#39;utilisation pharmaceutique de son inhibiteur
Bielanska et al. Voltage-dependent potassium channels Kv1. 3 and Kv1. 5 in human fetus

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220224

Address after: No. 158, Yaocheng Avenue West Road, Taizhou, Jiangsu 225300

Applicant after: JIANGSU KANGSIER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: No. 639 Jiangning longmian Road District of Nanjing City, Jiangsu province 211198

Applicant before: CHINA PHARMACEUTICAL University

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20240313

Address after: No.1 Suzhong Road, Jiangyan District, Taizhou City, Jiangsu Province 225500

Applicant after: Suzhong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: No. 158, Yaocheng Avenue West Road, Taizhou, Jiangsu 225300

Applicant before: JIANGSU KANGSIER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Country or region before: China

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant