KR101912332B1 - 신규 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 카베올린-1 특이적 저해제 또는 카베올린-1 인산화 억제제를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

신규 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물{Novel Pharmaceutical composition for treating cerebrovascular diseases or stroke}
본 발명은 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
표면소포(caveolae)는 대부분 세포에서 찾을 수 있는 구조로서 세포에서 가장 풍부하며, 원형질막에 함입된 구조이다. 표면소포에는 카베올린(caveoloin) 이라는 단백질이 발현되는데 주로 3가지의 동형단백질(isoform)을 갖는 Cav-1,-2,-3가 있고 세포마다 특징적으로 발현된다. 또한 표면소포에는 카베올린 뿐만 아니라 수용체, 채널, 단백질 및 콜레스테롤이 모여 있어서 여러 세포 신호 전달에 중요한 역할을 하는 것으로 판단되고 특히 caveolin-1 단백질은 그 기능에 대해 최근 활발히 연구되고 있지만 아직 불분명하다. 한편, RMASMC(Rat mesentery artery smooth muscle cell)은 근원성 수축(myogenic tone)이 존재하는 조직으로 신전(stretch)에 의해 생기는 근원성 긴장(myogenic tone)은 VDCC(Voltage-dependent Ca2+ channel)을 통한 Ca2+ 유입에 의해 조절 받는 것으로 알려져 있는데 산화스트레스에 의한 VDCC의 변화가 세포내의 어떠한 신호를 경유하는지 밝히기 위한 연구가 계속되고 있다. 산화 스트레스는 자외선, 매연, 흡연 등에 의해 발생하며 특히 최근 당뇨병 합병증 중 동맥경화의 원인이 산화스트레스가 주원인이라는 보고가 있고 혈관계 질환과 밀접한 연관이 있다. 그러나 산화스트레스에 대한 근본적인 차단 효과 물질이 없고 항산화 물질들을 함유한 예방물들이 있지만 완벽하게 억제하지 못하고 있다. 이와 관련하여 한국 등록특허 제1001815호는 신경뇌혈관 장애를 치료하기 위한 조성물을 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 식물추출물로부터 조성물을 제조하여 부작용이 발생하고 치료 효율도 낮은 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 산화 스트레스 증가에 의한 혈관 수축을 효과적으로 억제하여 혈관 관련 질환을 치료하는 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 카베올린-1 특이적 저해제 또는 카베올린-1 인산화 억제제를 유효성분으로 함유하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료 및 예방용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 카베올린을 발현하는 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; ii) 상기 세포에서의 상기 카베올린의 발현 정도 또는 인산화 정도를 측정하는 단계; 및 iii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 아니한 대조군과 비교하여 상기 카베올린의 발현 또는 인산화 정도를 유의하게 감소시킨 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 카베올린-1 단백질, 상기 카베올린-1 단백질과 상호작용하는 파트너 물질 및 피검 화합물 또는 천연물을 혼합하는 단계; 및 ii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 카베올린-1 단백질 및 상기 파트너 물질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 카베올린-1 단백질, ATP 및 피검 화합물 또는 천연물을 혼합하는 단계; 및 ii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 카베올린-1 단백질의 인산화를 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 산화 스트레스 증가에 의한 혈관 수축으로 인해 발생하는 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물의 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 산화스트레스에 의해 카베올린-1의 인산화가 증가됨을 확인한 웨스턴 블랏 겔 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 들이 산화 스트레스에 의한 카베올린 단백질의 세포내의 발현을 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 siRNA를 이용하여 세포내 카베올린-1의 유전자를 억제함에 따라 단백질이 억제됨을 관찰한 겔 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 카베올린 유전자를 억제 한 후 세포 내 H2O2를 처리 하였을 때 세포내 칼슘 변화를 관찰한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 카베올린 유전자를 제거한 후 세포의 안전막 전압의 변화를 관찰한 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "카베올린-1(caveolin-1, Cav-1)"은 대부분의 세포 유형의 카베올라(caveolae) 플라스마 막의 주요 구성요소인 스캐폴드 단백질을 의미한다. 카베올린-1은 인테그린 서브유닛을 티로신 인산화효소 FYN과 연결시키는 역할을 수행하는데, 이는 인테그린을 Ras-ERK 신호전달과정에 연결하는데 그리고 세포 주기 진행을 촉진하는데 있어서 초기단계에 해당된다.
본 문서에서 사용되는 "VDCC(Voltage-dependent Ca2+ channel)"는 전압-의존성 칼슘 채널로 Ca2+에 대한 투과성을 가진 흥분성 세포(예:근육, 신경아 교세포, 뉴런 등)의 멤브레인에서 발견되는 전압-게이트 이온 채널의 그룹이다. 상기 채널은 Ca과 같은 2가 양이온이 없을 경우 나트륨 이온이 통과할 수 있지만, 칼슘으로의 침투성은 정상적인 생리 조건에서 나트륨보다 약 1000 배 더 크다. Ca이 없는 상태에서 Na를 이용하여 VDCC의 투과도를 측정하면 Ca으로 기록한 것보다 10배 크게 기록할 수 있는 장점이 있다. 생리적 조건에서는 Ca이 존재하기 때문에 Ca만 통과할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "산화스트레스(oxidative stress)"는 체내 활성산소가 많아져 생체 산화 균형이 깨진 상태를 말하며 인체의 에너지 생성과정(섭취한 음식물이 산소와 반응하는 산화과정을 거침) 중에 유해산소가 급격히 증가해 인체에 나쁜 영향을 일으키거나 그러한 상황을 이른다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 카베올린-1 특이적 저해제 또는 카베올린-1 인산화 억제제를 유효성분으로 함유하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료 및 예방용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 카베올린-1 특이적 저해제는 카베올린-1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA, 비스포스포네이트, GGTI-286, 또는 안카르도네이트일 수 있고 상기 카베올린-1 인산화 억제제는 imatinib, butein, mesylate, 또는 PP2(4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(dimethylethyl)pyrazolo[3,4-d] pyrimidine)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 카베올린을 발현하는 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; ii) 상기 세포에서의 상기 카베올린의 발현 정도 또는 인산화 정도를 측정하는 단계; 및 iii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 아니한 대조군과 비교하여 상기 카베올린의 발현 또는 인산화 정도를 유의하게 감소시킨 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 카베올린의 발현 정도는 노던 블랏 분석, 역전사 PCR, 실시간 역전사 PCR, DNA 마이크로어레이 분석 또는 웨스턴 블랏 분석을 통해 수행될 수 있고 상기 카베올린-1 단백질의 인산화는 항-인산화 카베올린-1 항체를 이용한 면역분석, 또는 질량분석을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 카베올린-1 단백질, 상기 카베올린-1 단백질과 상호작용하는 파트너 물질 및 피검 화합물 또는 천연물을 혼합하는 단계; 및 ii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 카베올린-1 단백질 및 상기 파트너 물질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 파트너 물질은 PDGFRα, PDGFRβ, EGFR, 인슐린 수용체, TGFβRI, TrkA/p75NTR, 헷지혹(Hedgehog) 수용체, 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체, H-Ras, Gαq/Gαo/Gαs, 아데닐 사이크레이즈/PLCβ2, Trp1/IP3R/Gq11, c-Src, Lyn, Csk, GRK1, GRK2, GRK5, COX-2, PLD/PKCα, PKA, PKC, Integrin/cortactin/Src, Integrin(α, β)/Shc/Fyn uPAR/integrinβ1, eNOS, nNOS, Flotillin 1, 2/Cav-2, 190-kDa pY, 30-kDa pY, HSP56/cyc40/cycA, Filamin, Grb7, Striatin/SG2NA/zinedin, Connexin, 콜레스테롤, 지방산, GM1 또는 GD3일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 카베올린-1 단백질 및 상기 파트너 물질의 상호작용은 면역침강분석, GST 풀다운 분석, 효모 투-하이브리드 분석, 단백질 마이크로어레이, 표면 플라스몬 공명 분석(surface plsmon resonance assay), 또는 형광 공명에너지 전이분석(FRET)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) 카베올린-1 단백질, ATP 및 피검 화합물 또는 천연물을 혼합하는 단계; 및 ii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 카베올린-1 단백질의 인산화를 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 카베올린-1 단백질의 인산화는 항-인산화 카베올린-1 항체를 이용한 면역분석, 질량분석 또는 루시퍼레이즈 분석을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.
상기 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명자들은 카베올린-1이 세포막 단백질로서 그 기전에 대한 연구가 불분명한 가운데 카베올린 단백질은 산화 스트레스에 의해 인산화가 잘 되는 단백질로 산화스트레스와 연관성이 있고 이전 보고에서 VDCC 활성에 중요한 단백질로 보고되었다. 산화스트레스와 카베올린 및 혈관의 상관관계는"산화스트레스에 의한 칼슘 전류의 증가 기전”을 매개하는 효소나 단백질 등을 차단하는 것이 유용한 혈관계 질환의 치료 표적이 될 수 있으며 적절한 억제를 한다면 정상적인 조절기전에는 큰 영향 없이 혈관계 질환에서 관찰되는 혈관계 질환을 선택적으로 억제할 수 있음에 주목하고 예의노력한 결과, 카베올린 단백질의 억제를 통해 산화 스트레스에 의해 증가되는 혈관 수축을 억제하여 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료에 효과적인 약학적 조성물을 개발하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 동물 및 세포
본 발명에서 사용된 동물은 10~11 주령의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트를 사용하였고 모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 가이드라인에 따라서 수행하였으며, 건국대학교 동물실험 관리위원회가 본 연구를 승인하였다. 상기 랫트는 이산화탄소를 흡입 마취 후 경동맥 절개를 통하여 체내 혈액을 제거하였고 장간막 동맥을 분리한 후 단일세포로 분리하였으며, 단일세포 분리를 위한 조성물은 종래에 보고된 바에 따라 (Kim et al. Eur. J. Pharmacol. 483:117-126, 2004)에 기재된 것과 같이 제조하였다.
실시예 2: 용액 및 화학물질
실험은 NaCl 115 mM, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulphonic acid(HEPES) 5 mM, 포도당 11 mM, 및 슈크로스 65 mM를 포함하고 NaOH를 이용하여 pH 7.4로 적정한 등장액(isotonic solution)을 사용하였다. 단일 세포에서 세포 신전에 의한 VDCC 전류를 기록하기 위하여, 60 mM의 슈크로스를 등장액으로부터 제거하여 저장액을 제조하였다. VDCC 전류의 기록을 위하여, 10 mM BaCl2을 첨가한 등장액을 사용하였다. 전세포 패치(whole cell patches)의 기록을 위하여, 세슘 메탄술론산(CH3O3SCs) 100 mM, CsCl 40 mM, MgCl2 1 mM, MgATP 5 mM, HEPES, 5 mM 및 EGTA 0.05 mM를 포함하고 CsOH를 이용하여 pH를 7.2로 적정한 피펫 용액에 첨가하였다. 모든 화학물질은 특별한 언급이 없으면 Sigma사(Sigma Chemical Co., USA)로부터 구입하였다.
실시예 3: 웨스턴 블럿팅
상기 랫트로부터 장간막 동맥 평활근 세포(Mesenteric arterial smooth muscle cells, RMASMC)를 분리하여, 6 에서 10 계대배양을 수행한 후, 웨스턴 분석 실험에 사용하였으며, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 모든 실험을 위하여, 6 에서 10 계대 배양 후 세포를 전체 디쉬 면적대비 80% 포화도로 배양한 후 FBS가 없는 DMEM에서 12 내지 24시간 동안 굶겼다. 실험 두 시간 전, 배양배지를 신선한 배지로 교체하였다. 그 후 세포를 생리식염수(PBS)로 3회 세척하고 RIPA 완충액(TNT Research, LTD., KOREA)를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 샘플을 8% 또는 14% SDS-폴리아크릴아마이드 비환원 젤에서 단백질 크기별로 분리한 후 PVDF 막(Millpore)으로 옮겼다. 상기 블랏을 대상으로 각각 모두 토끼에서 수득한 1차 항체인 항-caveolin 항체(1:1000; cell signaling), 항-pCaveolin 항체(1:1000; cell signaling, Try14), 항-Ca 1.2 채널 항체(1:500; alomone lab), 항-GAPDH 항체(1:2000; santa cruz) 및 HRP가 부착된 2차 항체를 이용하여 웨스턴 블럿(1:2,000; cell signaling) 분석을 수행하였고 증가된 인산화 신호들은 Las-4000(Fusi film)을 통하여 관찰하였다.
그 결과, 산화스트레스에 의해 카베올린-1의 인산화가 증가됨을 확인하였다(도 1).
실시예 4: 카베올린 단백질 관찰
공초점 현미경을 통하여 카베올린 단백질의 변화를 관찰하기 위하여 상기 분리한 RMASMC를 본 실험에 사용하였으며, 세포 분리 후 냉장고에서 2시간 동안 유리 슬라이드에 적재하였다. 2시간 경과 후 세포가 부착된 것을 확인하였고 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 상기 세포를 고정하였으며 1% Triton X-100을 이용하여 세포막에 구멍을 형성하였다. 이 후, 5% BSA를 이용하여 blocking을 실시하였고 카베올린(1:1000; cell signaling) 대한 토끼 1차 항체 및 Cy2가 부착된 2차 항체를 면역면색(1:2,000; cell signaling)에 사용하였다. 신호들을 LSM 공초첨 현미경(zeiss)에 통하여 관찰하였다.
그 결과, 평소에는 세포막에 있던 카베올린 단백질이 산화 스트레스에 의해 세포내에서 발현하고 있는 것을 관찰하였다(도 2).
실시예 5: 짧은 간섭(small interfering) RNA
상기 실시예 4의 결과로부터 카베올린-1이 칼슘 채널의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 카베올린-1의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제작하여, 상기 RMASMC에 형질감염 시킨 후, Cav 2.1 채널의 발현정도를 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다.
구체적으로 상기 실시예 3과 같은 방법으로 세포를 굶겼다. 실험시작 전 배양접시에 담겨 있던 용액을 제거 후 60 mm 배양접시에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 1.6 ml를 넣어 주었다. 그 후 두 개의 용액을 준비하였는데 첫 번째 용액의 조성은 198 ml DMEM, 2 ml Caveolin-1 siRNA(100mM)(L-093600-02, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)이고 두 번째 용액의 조성은 193ml, DMEM 7 ml, DhamaFECT(T-2002-02, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)의 상기 두 용액을 각각 5분간 실온에서 혼합하였고 상기 용액 1 및 2를 실온에서 30분간 혼합하였다. 상기 혼합 용액을 1.6 ml의 배지가 포함된 60 mm 배양 접시에 첨가하여 2일이 지난 후 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. GAPDH는 단백질 정량을 확인하기 위한 단백질로 이용하였고 Mork는 siRNA를 넣지 않은 대조군으로 이용하였다.
그 결과, siRNA를 이용하여 세포내 카베올린-1의 유전자를 억제하여 단백질이 억제되는 것을 관찰할 수 있었고 혈관 수축에 중요한 VDCC인 Cav 1.2 채널의 발현양은 변함없는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 6: 칼슘 이미지 실험
카베올린-1 siRNA 형질감염 RMASMC 세포로부터 단일세포를 분리한 후 Fura2-AM(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)을 1:1000 농도로 혼합하였다. 30분간 혼합한 후 현미경 위에 올려놓고 관류장치를 이용한 NT를 이용하여 세포안으로 들어가지 못한 잔류 Fura2-AM을 세척하였고 세포내 칼슘 농도를 측정하기 위하여 Lambda DG-4(Sutter Instrument Company,Novato, CA, USA) 장비를 이용하여 관찰하였다
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 정상적인 세포에서 H2O2에 의해 세포내 칼슘이 증가하는 것을 관찰하였고(A), 니페디핀(nifedifine)에 의해 억제되는 것을 확인하여 산화 스트레스에 의한 전압 의존성 칼슘 통로의 활성이 중요한 것을 확인하였다. 또한 카베올린 유전자를 억제 한 후 H2O2를 처리하여 세포내 칼슘 변화를 관찰한 결과, 카베올린 유전자 억제 후 산화스트레스에 의한 변화가 없음을 확인하였고(C) 산화스트레스에서 카베올린 단백질의 억제가 중요함을 관찰하였다(D).
실시예 7: 전기생리학적 기록
본 발명의 일 실시예에 따라 장간막 동맥 평활근 세포(Mesenteric arterial smooth muscle cells, RMASMC)를 분리하여 패치클램프(patch-clamp) 실험을 수행하였다. 상기 실험을 위해 장비는 EPC8 patch-clamp amplifier(Heka, Germany)를 사용하였고 데이터는 1 kHz에서 low-pass 필터된 후 1 -10 kHz의 샘플링 속도에서 프로그램에 의하여 디지털화되고 컴퓨터에 저장하였으며 전압 펄스 생성도 소프트웨어로 조절하였다. 또한 borosilicate capillaries (Clark Electromedical Instruments, Pangbourne, UK) 및 puller (PP-83, Narishige, Japan)을 사용하여 패치 피펫을 제작하였고 피펫 용액으로 채운 경우 2 - 3 MΩ 저항을 가지는 패치 피펫을 사용하였다. 상기 모든 실험은 상온에서 수행하였고 상업적으로 이용 가능한 bathing chamber(RC-11, WPI, USA) 및 sliver/silver chloride (Ag/AgCl) 펠렛 전극(WPI, USA)을 사용하여 세포의 안전막 전압을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 시간대 별로 안전막 전압의 변화가 없는 것으로 나타났고(A) VDCC를 활성화시키는 주원인으로 산화스트레스에 의한 안전막 전압의 탈분극이 발생하는 것을 관찰하였다(B). 또한 카베올린 유전자를 제거한 후 세포의 안전막 전압을 측정한 결과, 산화스트레스에 의한 안전막 전압의 변화가 없는 것을 확인하였다(C).
상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 카베올린-1은 세포막 단백질로서 그 기전에 대한 연구가 불분명하였으나 본 발명자들은 전기 생리(patch-clamp) 및 약리적 차단제 실험을 통해 카베올린-1의 억제가 산화 스트레스에 의한 칼슘 전류 증가 현상을 효과적으로 차단하여 혈관 수축을 억제한다는 것을 증명하여 산화 스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중과 같은 혈관계 질환의 치료제 및 예방약으로의 활용가능성을 제시하였다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 카베올린-1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA, 비스포스포네이트, GGTI-286, 및 안카르도네이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 카베올린-1 특이적 저해제 또는 imatinib, butein, mesylate, 및 PP2(4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(dimethylethyl)pyrazolo[3,4-d] pyrimidine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 카베올린-1 인산화 억제제를 유효성분으로 함유하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료 및 예방용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. i) 카베올린을 발현하는 분리된 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; ii)
    상기 세포에서의 상기 카베올린의 발현 정도 또는 인산화 정도를 측정하는 단계; 및
    iii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 아니한 대조군과 비교하여 상기 카베올린의 발현 또는 인산화 정도를 유의하게 감소시킨 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 카베올린의 발현 정도는 노던 블랏 분석, 역전사 PCR, 실시간 역전사 PCR, DNA 마이크로어레이 분석 또는 웨스턴 블랏 분석을 통해 수행되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 카베올린-1 단백질의 인산화는 항-인산화 카베올린-1 항체를 이용한 면역분석, 또는 질량분석을 통해 수행되는, 방법.
  7. i) 카베올린-1 단백질, 상기 카베올린-1 단백질과 상호작용하는 파트너 물질 및 피검 화합물 또는 천연물을 혼합하는 단계; 및
    ii) 상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 카베올린-1 단백질 및 상기 파트너 물질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 파트너 물질은 PDGFRα, PDGFRβ, EGFR, 인슐린 수용체, TGFβRI, TrkA/p75NTR, 헷지혹(Hedgehog) 수용체, 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체, H-Ras, Gαq/Gαo/Gαs, 아데닐 사이크레이즈/PLCβ2, Trp1/IP3R/Gq11, c-Src, Lyn, Csk, GRK1, GRK2, GRK5, COX-2, PLD/PKCα, PKA, PKC, Integrin/cortactin/Src, Integrin(α, β)/Shc/Fyn uPAR/integrinβ1, eNOS, nNOS, Flotillin 1, 2/Cav-2, 190-kDa pY, 30-kDa pY, HSP56/cyc40/cycA, Filamin, Grb7, Striatin/SG2NA/zinedin, Connexin, 콜레스테롤, 지방산, GM1 또는 GD3인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 카베올린-1 단백질 및 상기 파트너 물질의 상호작용은 면역침강분석, GST 풀다운 분석, 효모 투-하이브리드 분석, 단백질 마이크로어레이, 표면 플라스몬 공명 분석(surface plsmon resonance assay), 또는 형광 공명에너지 전이분석(FRET)에 의해 수행되는, 방법.
  10. i) 카베올린-1 단백질, ATP 및 피검 화합물 또는 천연물을 혼합하는 단계; 및 ii)
    상기 피검 화합물 또는 천연물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 카베올린-1 단백질의 인산화를 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 산화스트레스에 의한 뇌혈관질환 또는 뇌졸중 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 카베올린-1 단백질의 인산화는 항-인산화 카베올린-1 항체를 이용한 면역분석, 질량분석 또는 루시퍼레이즈 분석을 통해 측정되는, 방법.
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