CN110337706A - 用于低温电子显微镜的可冻结流体单元 - Google Patents

用于低温电子显微镜的可冻结流体单元 Download PDF

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Abstract

公开了一种使用可冷冻流体单元系统对生物样本进行成像的系统和方法。可冷冻流体单元包括顶部芯片、底部芯片和间隔件，以控制玻璃化生物样本的厚度。间隔件定位在顶部芯片和底部芯片之间以限定通道，该通道与可冷冻流体单元系统的入口端口和出口端口流体连通。通道可以用生物样本来填充，被玻璃化并成像以产生高分辨率电子显微镜图像。

Description

用于低温电子显微镜的可冻结流体单元
相关申请的交叉引用
本申请基于，要求于2016年12月6日提交的美国临时专利申请第62/430,666号的权益，并通过引用结合于此。
关于联邦资助研究的说明
不适用。
技术领域
本公开涉及低温电子显微镜和用于保持低温电子显微镜的样本的改善的流体单元。
背景
低温电子显微镜(“cryo-EM”)是在玻璃化含水样本的薄膜上执行的成像技术。Cryo-EM在结构生物学中越来越普及，并且使得在分子分辨率下观察单元、病毒和蛋白质组装体在其原始状态下的结构成为可能。Cryo-EM基于在低温条件和高真空下在透射电子显微镜中对辐射敏感样本进行成像的原理。
将冷冻的水溶液浸入冷冻剂(诸如液体乙烷)中是用于制备用于低温EM应用的样本的常用方法。在低温下冷冻样本会降低对生物样本造成的辐射损伤程度。具体而言，电子辐射导致化学键断裂和自由基的产生，这反过来又导致对样本的进一步损伤。快速冷冻或玻璃化薄冷冻层中的生物样本的方法的发展允许减少辐射损伤并且允许以更高的辐射剂量对样本进行成像。另外，在低温下保存生物样本允许在高真空下保存生物样本。
发明内容
本文公开了一种使用可冷冻流体单元用于低温电子显微镜成像生物样本的系统和方法。如本文所使用的，术语“生物样本”是指多种大分子组装体，包括但不限于蛋白质分子、小肽、单个细菌、病毒、完整组织切片、和插入冷冻单元。在所公开的方法中，将包含生物样本的水性液滴引入可冷冻流体单元的入口端口，其中通过毛细管作用将生物样本拉入设备中。然后将生物样本拉入单元内的薄的、平面流体单元方案。然后快速冷却可冷冻的流体单元以将生物样本固定在冰的薄膜中，其可替代地称为玻璃化生物样本。然后可以使用低温电子显微镜对薄膜成像。
用于对cryo-EM样本进行成像的先前方法使用机器人印迹方法来创建通常被较差地控制的薄的玻璃化生物样本。也就是说，机器人印迹方法通常包括将几微升纯化的蛋白质溶液沉积到金属(通常是铜)网格上，在其上面是配置有孔的无定形碳薄膜。一部分蛋白质溶液进入无定形碳网格的孔中，并且在液体乙烷中插入冷冻之前使用过滤纸将剩余的溶液吸去。这些先前的印迹方法导致由于大的空气-液体界面和大分子组装体的浓度梯度而具有可变冰厚度的冷冻样本。可变冰厚度和浓度梯度需要对玻璃化生物样本进行时间密集的人工筛选以定位合适的区域以用于成像。此外，与先前印迹方法相关联的可变冰厚度导致跨样本的背景噪声信号不一致。不一致的背景噪声信号使数据后处理和图像重建变得复杂。此cryo-EM的样本制备阶段被广泛认为是结构测定的瓶颈和结构测定自动化的障碍。
本公开通过提供可冷冻的流体单元来限定生物样本的冰厚度，从而解决了上述缺点。本公开还移除了使用机器人印迹方法在很大程度上不可避免的气体-液体界面，这在三维结构确定中可能是有问题的。通过移除气体-液体界面并在平面流体单元方案内将生物样本插入冷冻，本公开解决了可变冰厚度和较差的大分子分布的问题。
本公开还有助于自动化过程。以前的方法阻碍了高分辨率cryo-EM成像的自动化，因为传统的印迹和插入式冷冻系统创建的冰厚度在整个基板表面上变化。这需要人工干预以找到足够薄的区域以获得高分辨率信息，但又不能太薄以至于蛋白质被排除在冰之外。例如，厚的冰会减弱信号，但如果冰太薄，蛋白质就会被推开。本发明有利于自动化，因为它创建具有定制的且均匀的冰厚度的冰，其也容纳蛋白质。结果，计算机控制的成像系统可以从点到点移动来获取图像，并且图像将具有一致的质量，因为冰厚度是恒定的。此外，本公开还通过规则的成像窗口阵列促进自动化过程。
根据一个方面，本公开提供了一种用于低温电子显微镜的可冷冻流体单元系统。可冷冻流体单元系统包括顶部芯片和底部芯片。顶部芯片包括连接到第一电子透明构件的第一结构构件。底部芯片包括连接到第二电子透明构件的第二结构构件。可冷冻流体单元还包括位于所述顶部芯片和所述底部芯片之间的间隔件，其中该间隔件连接顶部芯片和底部芯片，以在第一电子透明构件和第二电子透明构件之间限定一个或多个通道。其中顶部芯片进一步包括一个或多个延伸穿过第一结构构件和第一电子透明构件的入口端口和出口端口，使得入口端口、出口端口、和通道流体连通。入口端口和出口端口允许可冷冻的流体单元设备在不拆卸设备的情况下使用和重复使用。
用于第一和第二电子透明构件的合适材料可包括沉积在相应的第一或第二结构构件上的二氧化硅、氮化硅、碳化硅、石墨烯或其衍生物。设想了使用石墨烯或碳化硅可通过减少系统中存在的噪声来改善图像分辨率。
在一些形式中，第一和第二电子透明构件各自可具有150nm或更小的厚度。在一些非限制性示例中，厚度可以在2nm至100nm之间的范围、或者可以在2nm至75nm之间的范围、或者可以在2nm至50nm的之间的范围、或者可以在2nm至40nm之间的范围、或者可以在2nm至30nm之间的范围、或者可以在2nm至20nm之间的范围、或者可以在2nm至10nm之间的范围、或者可以在2nm至5nm之间的范围。还可以设想当使用材料(诸如，但不限于石墨烯)时，第一和第二电子透明构件的厚度可接近原子厚度。原子厚度可以小于2nm，例如，厚度可以在0.4nm至1.7nm之间的范围，该厚度大约是单层石墨烯的厚度。第一电子透明构件和第二电子透明构件的厚度不必相同。
在一些形式中，第一结构构件和第二结构构件可各自包含硅，并且每个可具有500μm或更小的厚度。在一些非限制性示例中，第一和第二结构支撑构件的厚度可以在10μm与200μm之间、或者在20μm与180μm之间、或者在30μm与170μm之间、或者在40μm与160μm之间、或者在50μm与150μm之间。此外，第一和第二结构构件中的每一个可包含多个梯形凹槽，这些梯形凹槽延伸穿过第一或结构构件中的相应一个，以在相应的第一和第二电子透明构件的表面上形成相应的第一和第二成像窗口。第一和第二成像窗口可各自具有小于10mm2的面积。在一个非限制性示例中，成像窗口的面积可以在1μm2和20μm2之间。
在一些形式中，间隔件可以包括氧化硅、铟或微粒珠，并且可以具有2μm或更小的厚度。在一些非限制性示例中，用于细胞生物学应用的间隔件108的厚度可受益于使间隔件的厚度为约1μm，而高分辨率蛋白质成像受益于间隔件108的厚度为约20nm。在一些配置中，间隔件108的厚度可以在20nm与1μm之间。在优选的配置中，间隔件108的厚度可以在20nm和200nm之间。在铟的情况下，铟的导热性和导电性可以促进成像期间的电荷耗散。
根据另一方面，本公开还提供了一种使用低温电子显微镜对生物样本进行成像的方法。将生物样本沉积到上述可冷冻流体单元系统的入口通道中(其可具有本文所述结构中的任何各种可作业排列)，其中生物样本填充通道内的总体积。然后冷冻生物样本以产生玻璃化的生物样本。电子束被引导通过第一电子透明构件、玻璃化生物样本和第二电子透明构件。使用统计方法获取并集体地处理图像的集合。
在一些形式中，统计方法可以包括主成分分析、多变量分析或协方差分析。
在一些形式中，该方法可以进一步包括以下步骤：以相对于入射电子束的方向的不同倾斜获取一系列图像，通过成像滤波器处理图像，以及计算地组合图像以产生玻璃化生物样本的断层图像和三维图像。
在一些形式中，引导电子束和处理图像的步骤可以进一步包括：使用荧光显微镜获取一系列图像，定位荧光生物样本的位置，以及将来自荧光图像的数据与cryo-EM图像合并，使得荧光生物样品在cryo-EM图像内是可标识的。
在一些形式中，生物样本可包括进一步包含一种或多种病毒、蛋白质分子、细菌或组织样品的水溶液。
本发明的前述及其他优点从以下说明书中将变得明显。在该描述中，参考形成其一部分且作为说明示出本发明的优选实施例的附图。然而，这样的实施例不必要表示本发明的全部范围，并因此对权利要求和在本文中作出参考以用于解释本发明的范围。
附图说明
图1A示出了用于可冷冻流体单元系统的顶部芯片的俯视图和截面图。
图1B示出了用于可冷冻流体单元系统的间隔件的俯视图和截面图。
图1C示出了用于可冷冻流体单元系统的底部芯片的俯视图和截面图。
图2示出了沿图1A、1B和1C中的2—2截取的组装的可冷冻流体单元系统的代表性截面侧视图。
图3A示出了取自可冷冻流体单元系统的来自轮状病毒VLP制备的囊泡材料的图像。图像的比例尺约为100nm。
图3B示出了取自可冷冻流体单元系统的来自轮状病毒VLP制备的囊泡材料的另一图像。
图4A示出了用于可冷冻流体单元系统的顶部芯片的俯视图和截面图。
图4B示出了用于可冷冻流体单元系统的间隔件的俯视图和截面图。
图4C示出了用于可冷冻流体单元系统的底部芯片的俯视图和截面图。
图5示出了说明用于降低与可冷冻流体单元的成像窗口中的晶格相关联的噪声的方法的一个非限制性示例的示意流程图。
图6示出了在单晶硅成像窗口上使用图5的方法的一个非限制性示例。以下示出了：单晶硅成像窗口的真实空间图像(左)，具有衍射斑点的倒易空间(reciprocal space)图像(左中间)，衍射斑点上方的掩模(右中间)，以及具有改善对比度的单晶硅成像窗口的经校正的真实图像(右)。
图7示出了在成像通道中具有金纳米粒子的单晶硅成像窗口上使用图5方法的一个非限制性示例。以下示出了：单晶硅成像窗口和金纳米粒子的真实空间图像(左)，具有衍射斑点的倒易空间(reciprocal space)图像(左中间)，衍射斑点上方的掩模(右中间)，以及具有改善对比度的单晶硅成像窗口的经校正的真实图像和金纳米粒子(右)。
图8示出了图示出用于制造可冷冻流体单元系统的方法的一个非限制性示例的示意流程图。
具体实施方式
现在参考图1A、图1B、图1C以及图2，示出了根据本公开的可冷冻流体单元系统100的一个示例性实施例。可冷冻流体单元系统100包括顶部芯片102、间隔件108和底部芯片110。在图1A、图1B、以及图1C的每一个中，说明了可冷冻流体单元系统100的每个部分(顶部、底部、间隔件)的俯视图以及相应的一对截面侧视图。
在图1A中，示出了可冷冻流体单元系统100的顶部芯片102。顶部芯片102包括连接到第一电子透明构件106的第一结构构件104。顶部芯片102具有至少一个入口端口122和至少一个出口端口124，该入口端口122和出口端口124延伸穿过第一结构构件104以及第一电子透明构件106使得间隔件108内的至少一个通道134(下面更详细地描述并且在图1B和图2中示出)可以保持与入口端口122和出口端口124流体连通。顶部芯片102还包括延伸穿过第一结构构件104到达第一电子透明构件106的暴露部分或未覆盖部分的一个或多个成像窗口128。
现转到图1C，示出了底部芯片110。类似于顶部芯片102，底部芯片110具有第二结构构件114和第二电子透明构件112。第二电子透明构件112将底部芯片110连接到间隔件108。底部芯片110还具有延伸穿过第二结构构件114到达第一电子透明构件112的暴露部分或未覆盖部分的一个或多个成像窗口132。成像窗口128、132可包括垂直或具有向内倾斜的侧壁。
在参考图1B和图2所示，间隔件108位于顶部芯片102和底部芯片110之间，其中间隔件108提供结构支撑，将顶部芯片102与底部芯片110连接，并在它们之间限定空间。如所示出的，间隔件108具有多个在其中形成的开口，这些开口与顶部芯片102和底部芯片110一起限定一个或多个通道134，生物样本130可以由毛细管力通过入口端口122被吸入可冷冻流体池系统100中，进入一个或多个通道134。然后可以冷冻生物样本130以建立薄的玻璃化膜。在对样本进行成像和解冻之后，然后可以通过出口端口124从间隔件108内的至少一个通道134移除样本以重新使用。
如图2中最佳示出的那样，在低温EM成像期间，由低温EM设备产生的电子束126将首先被引导通过顶部芯片102中的一个或多个成像窗口128，穿过冷冻样本130，穿过一个或多个成像窗口132，并由一个或多个检测器接收或收集。由检测器收集的数据包括在生物样本130内配置的生物分子的二维投影。可以通过使用计算机处理二维投影以产生图像(即，生物样本130中的生物分子的二维或三维结构)来确定各个粒子的相对取向。可以使用本领域技术人员已知的方法，通过使用计算机硬件和软件将二维投影组合成三维重建。
在生物样本130的成像期间，可冷冻流体单元系统100内的最相关的背景噪声源可归因于冰厚度、第一电子透明构件106、和第二电子透明构件112。因此，可冷冻流体单元系统100内的噪声取决于这些构件中的每一个构件的厚度和组成。
在一些形式中，第一电子透明构件106和第二电子透明构件112可包括具有晶格的化合物。例如，第一电子透明构件106可包括氮化硅、碳化硅、石墨烯、二氧化硅、其衍生物或混合物。碳化硅提供优势，因为在后处理期间可以在倒易空间中计算性地减少与碳化硅相关的背景噪声。这是由于碳化硅的特有的固体晶格。这提供了优于氮化硅的益处，氮化硅包含无定形固相，其背景噪声在后处理步骤中不能方便地移除。类似地，石墨烯也具有晶格，允许在后处理步骤中减少背景噪声。石墨烯也具有原子厚度，并且因此在图像处理期间对背景噪声的贡献可忽略不计。在其他配置中，第一电子透明层106和第二电子透明层112可以包括其他碳的同素异形体(诸如石墨、炭、碳纳米管和富勒烯)。第一电子透明层106和第二电子透明层112也可以涂覆有薄膜。合适的薄膜包括，但不限于氮化硅涂层。
在一些配置中，电子透明构件106、112可具有150nm或更小的厚度。如上所述，电子透明构件106、112的厚度对背景噪声具有显著的贡献，在保持可冷冻流体单元系统100的结构完整性的同时减小它们的厚度可有助于减少噪声。在其他配置中，电子透明构件106、112的厚度可以在2nm至100nm之间的范围、或者可以在2nm至75nm之间的范围、或者可以在2nm至50nm的之间的范围、或者可以在2nm至40nm之间的范围、或者可以在2nm至30nm之间的范围、或者可以在2nm至20nm之间的范围、或者可以在2nm至10nm之间的范围、或者可以在2nm至5nm之间的范围。还可以设想当使用材料(诸如，但不限于石墨烯)时，第一和第二电子透明构件的厚度可接近原子厚度。原子厚度可以小于2nm，例如，厚度可以在0.4nm至1.7nm之间的范围，该厚度大约是单层石墨烯的厚度。电子透明构件106、112中的每一个的厚度不必相同。第一和第二成像窗口128、132可各自具有小于10mm2的面积。在一个非限制性示例中，成像窗口的面积可以在1μm2和20μm2之间。
应理解，本文所用的术语“电子透明”不要求电子透明构件是100％透明的。相反，可以使用允许足够比例的电子束126穿过电子透明构件以允许图像被获取的任何材料。
用于第一结构支撑构件104和第二结构支撑构件114的合适材料可包括硅、二氧化硅、金、衍生物或其混合物。结构支撑构件104和114的厚度可以是500μm或更小。在一些非限制性示例中，结构支撑构件104和114的厚度可以在10μm与200μm之间、或者在20μm与180μm之间、或者在30μm与170μm之间、或者在40μm与160μm之间、或者在50μm与150μm之间。在其他配置中，用于结构支撑构件104、114的合适材料可包括合成的有机聚合物或无机聚合物(诸如，但不限于聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、尼龙、聚四氟乙烯、热塑性聚氨酯、及其衍生物)。
在一些配置中，用于间隔件108的合适材料可包括氧化硅、氧化铝、硅酸铝、镓或铟。在一个特定配置中，间隔件108包括二氧化硅或铟。铟可以提供优于二氧化硅的几个优点。首先，铟具有合适的导电性，该导电性可以促进成像期间的电荷耗散。其次，铟具有更高的密度并为可冷冻流体单元系统100提供改善的结构完整性。第三，铟的低温热蒸发简化了制造期间底部芯片上的铟的图案化以及其厚度控制。
如上所述，间隔件108的厚度限定并最终对应于玻璃化生物样本130的厚度，该厚度有助于可冷冻流体单元系统100内的背景噪声。因此，希望最小化间隔件108的厚度，同时保持结构完整性。然而，应当理解，不同的生物成像应用受益于间隔件108的不同厚度。在一些形式中，间隔件的厚度可以是2μm或更小。在一些非限制性示例中，用于细胞生物学应用的间隔件108的厚度可受益于使间隔件的厚度为约1μm，而高分辨率蛋白质成像受益于间隔件108的厚度为约20nm。在一些配置中，间隔件108的厚度可以在20nm与1μm之间。在优选的配置中，间隔件108的厚度可以在20nm与200nm之间。
在一些形式中，间隔件108可包括微粒珠408，如图4A、图4B和图4C中所示。该实施例与图1A、图1B和图1C中公开的可冷冻流体单元100平行。在该配置中，微粒珠408定位成使得顶部芯片402和底部芯片410的四个角中的每一个角由微粒珠408连接。类似于上文，微粒珠408可以由氧化硅、氧化铝、硅酸铝、镓或铟制成。在这种配置中，微粒珠408不覆盖顶部芯片402和底部芯片410之间的整个外围。因此，用于封装生物样本430的可冷冻流体单元设备400的内部空间434将具有沿着具有厚度由微粒珠限定的四个侧壁的空气的开放界面。在该配置中，生物样本430通过毛细管作用沿开放界面加载。
在一个方面，微粒珠408不将顶部芯片402结合到底部芯片410，而是将微粒珠放置在底部芯片410的角中，随后将顶部芯片402放置在微粒珠408的顶部以组装可冻结流体设备400。这允许可冷冻流体设备400被拆卸，并且每个组件在试验之间容易被清洗。微粒珠408对于某些生物样本430特别有利。具体而言，开放界面允许空气与生物样本430接触，这允许细胞在可冷冻流体单元设备400内部生长。在这种情况下，将细胞接种在可冷冻流体单元设备400内部并浸入细胞培养基中。然后，开放界面允许细胞培养基中的营养物扩散到可冷冻流体腔室中以使细胞能够生长。一旦细胞充分生长，移除设备并插入冷冻用于如上所述的成像。
参考图3，示出了利用可冷冻流体单元系统100拍摄的生物样本130的非限制性图像。具体地，图3显示了在轮状病毒VLP制剂中观察到的囊泡材料，在液体乙烷中插入冷冻后利用可冷冻流体单元系统100成像。可冷冻流体单元系统100的有利方面在于在冷冻流体单元时形成的均匀限定的冰层，以及在第一成像窗口128边缘处(即，第一电子透明构件106与第一结构构件104的锥形边缘重叠处)的高对比度使该设备适合于自动数据收集。自动化目前用于cryo-EM，但是因为由于标准cryo-EM系统上冰层缺乏均匀性，所得到的数据质量不稳定，所以妨碍了高分辨率工作。
除了细胞和蛋白质的单峰cryo-EM成像之外，可冷冻流体单元系统100可以用于具有荧光光学显微镜和cryo-EM的多模态相关成像。例如，可冷冻流体单元系统100可以用荧光和非荧光蛋白质的混合物来填充、冷冻、然后用荧光显微镜成像以定位荧光蛋白质。然后可以进行Cryo-EM成像，并且然后合并来自两种成像模态的数据以标识cryo-EM图像数据中的荧光分子(即，cryo-EM数据不捕获荧光，但可以用来自荧光显微镜的数据增强)。可替代地，可以对表达感兴趣的荧光蛋白的单元采用相同的方法。在用荧光显微镜定位蛋白质后，可以将蛋白质定位在电子显微镜中并获得显微照片或断层图像。
本公开还涉及一种使用可冷冻流体单元系统100使用cryo-EM对生物样本130进行成像的方法。首先，将生物样本130沉积到可冷冻流体单元系统100的入口端口122中。沉积生物样本130，使得其填充间隔件108的至少一个通道134的总体积。然后，冷却可冷冻流体单元系统100以产生玻璃化的生物样本130。形成玻璃化的生物样本，使得其沿着至少一个通道134的长度具有均匀的厚度，并且使得玻璃化的生物样本130与电子透明构件106、112中任一者之间不存在空气界面。然后，电子束被引导通过第一电子透明构件106、玻璃化生物样本130和第二电子透明构件112。最后，使用统计方法处理图像。
在一些配置中，冷却生物样本130涉及插入冷冻成冷冻剂(诸如，通过液氮冷却的液态乙烷)。冷冻剂的替代方案可包括液体丙烷。上面公开的方法不限于二维成像，而是可以包括三维成像。为了收集生物样本130的三维图像，一系列图像被收集，其中每个图像以相对于入射电子束126的方向的不同倾斜度拍摄。然后图像被计算地组合，以生成断层图像。然后可以采用平均方法来获得更详细的结构信息。如果结构在形态学上是异构的，则可以使用多个断层图像来标识结构变化中的图案。
在一些形式中，使用cryo-EM对生物样本130进行成像包括用于减少与成像窗口128、132的晶格相关联的噪声的方法500。参考图5，方法500包括获取可冷冻流体单元系统100中的成像窗口128、132的真实空间图像502，即TEM图像。然后，通过应用，例如，傅立叶变换或衍射图案分析(诸如，但不限于Gatan程序等)从真实空间图像产生倒易空间图像504。倒易空间图像504包括与成像窗口128、132的晶格相关联的衍射斑点，衍射斑点可以使用降噪操作506来标识和掩蔽。降噪操作506可以包括例如采用倒易空间中的高斯形状的软边缘掩模以抑制某些频率范围。
然后，通过例如对掩蔽的倒易空间图像进行逆傅立叶变换，从掩蔽的倒易空间图像生成经校正的真实图像508。为了进一步说明方法500，图6示出了单晶硅成像窗口中减少与晶格相关的噪声的一个非限制性示例。图6中所示出的单晶硅成像窗口具有35nm的厚度，并且沉积在具有100μm厚度的硅结构构件上。从衍射研究的<1-0-0>取向拍摄了单晶硅成像窗口(左)的真实空间图像。图6进一步示出了具有明显衍射斑点的倒易空间图像(左中)。使用快速傅立叶变换衍射图案分析利用Gatan编程从真实空间图像生成倒易空间图像。标识并掩蔽单晶硅成像窗口的衍射图案，如图6所示(右中)。然后通过应用快速傅立叶逆变换来生成经校正的真实空间图像(右)，以减少与单晶硅想象窗口相关联的信号。降低与成像窗口的晶格相关联的噪声产生具有改善的对比度的真实图像。
图7示出了在成像通道中具有金纳米颗粒的单晶硅成像窗口中减少与晶格相关的噪声的另一个非限制性示例。图7中所示出的单晶硅成像窗口具有35nm的厚度，并且沉积在具有100μm厚度的硅结构构件上。从衍射研究的<1-0-0>取向拍摄了单晶硅成像窗口和金纳米颗粒(左)的真实空间图像。图7进一步示出了具有明显衍射斑点的倒易空间图像(左中)。使用快速傅立叶变换衍射图案分析利用Gatan编程从真实空间图像生成倒易空间图像。标识并掩蔽单晶硅成像窗口的衍射图案，如图7所示(右中)。然后通过应用快速傅立叶逆变换来生成经校正的真实空间图像(右)，以减少与单晶硅想象窗口相关联的信号。经校正的真实空间图像(右)包括真实空间图像(左)上的改善的对比度。
尽管图6-图7示出了用于减少与单个成像窗口的晶格相关联的噪声的方法；然而，方法500可以在具有第一成像窗口128和第二成像窗口132的可冷冻流体单元系统100上执行。也就是说，通过使用与上述类似的方法标识和掩蔽独立的衍射图案，可以同时减小归因于两个成像窗口128、132的晶格的背景噪声。
参考图8，提供了用于制造根据本公开的可冷冻流体单元系统100的方法800的一种实现的流程图，例如从顶部芯片102和底部芯片110。最初在制造期间，顶部芯片102和底部芯片110可以被提供为具有多个层的基本上为平面的基板。例如，如上所述，顶部芯片102可以包括连接到第一电子透明构件106的第一结构构件104，并且底部芯片110可以包括连接到第二电子透明构件112的第二结构构件114。
方法800进一步包括图案化顶部芯片806以在第一结构构件104和第一电子透明构件106中形成入口端口122、出口端口124、和第一成像窗口128。在一些方面，方法800包括将掩蔽剂804沉积到顶部芯片102的一部分(即第一结构构件104和第一电子透明构件106)上的可选步骤，以在蚀刻期间保护感兴趣的区域。如本文所使用的，“掩蔽剂”是指对蚀刻剂可以是耐光的或耐化学腐蚀的材料。本发明的合适的掩蔽剂包括耐用材料(诸如氮化硅及其衍生物)。
用于本公开的合适的图案化技术可以包括光刻、干法蚀刻、湿法蚀刻、或本领域已知从大块基板蚀刻薄膜部分的类似技术。在一个非限制性示例中，执行湿法蚀刻技术(诸如缓冲氧化物蚀刻(BOE)或四甲基氢氧化铵(TMAH))以将基板上的感兴趣区域图案化。用于本公开的合适的沉积技术可以包括化学沉积和物理沉积方法。非限制性沉积方法可包括例如化学气相沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、物理气相沉积(PVD)、溅射或类似方法。
方法800进一步包括将底部芯片810图案化以在第二结构构件114中形成第二成像窗口132。与上面类似，将底部芯片810图案化包括将掩蔽剂808沉积到顶部芯片110的一部分(即第二结构构件114和第二电子透明构件112)上的可选步骤，以在蚀刻期间保护感兴趣的区域。在图案化之后，可以将间隔件108沉积810到顶部芯片102或底部芯片110上。在一个非限制性示例中，间隔件108可以沉积在第一电子透明构件106或第二电子透明构件112上。在沉积之后，方法800进一步包括将间隔件812耦合到顶部芯片102和底部芯片110，以形成与入口端口122和出口端口124流体连通的通道134。如本文所使用的，“耦合”可以指将间隔件108化学键合到顶部芯片102和底部芯片110，或者它可以指将间隔件108放置成与顶部芯片102和底部芯片110接触。
应当理解，可以在本发明的精神和范围内对优选实施例进行各种其他修改和变化。因此，本发明不应限于所描述的实施例。为了确定本发明的全部范围，应该参考以下权利要求。

Claims (23)

1.一种用于低温电子显微镜的可冷冻流体单元系统，所述可冷冻流体单元系统包括：
顶部芯片，包括连接到第一电子透明构件的第一结构构件，所述第一结构构件包括一个或多个成像窗口，所述成像窗口延伸穿过所述第一结构构件到达所述第一电子透明构件的暴露表面；
底部芯片，包括连接到第二电子透明构件的第二结构构件，所述第二结构构件包括一个或多个成像窗口，所述成像窗口延伸穿过所述第二结构构件到达所述第二电子透明构件的暴露表面；以及
间隔件，位于所述顶部芯片和所述底部芯片之间，其中所述间隔件连接所述顶部芯片和所述底部芯片，以在所述第一电子透明构件和所述第二电子透明构件之间限定通道；
其中所述顶部芯片进一步包括入口端口和出口端口，所述入口端口和所述出口端口延伸穿过所述第一结构构件和所述第一电子透明构件，使得所述入口端口、所述出口端口和所述通道流体连通。
2.如权利要求1所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述第一电子透明构件具有在2nm至20nm之间的厚度；以及
所述第二电子透明构件具有在2nm至20nm之间的厚度。
3.如权利要求1所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述第一电子透明构件包括晶格结构；以及
所述第二电子透明构件包括晶格结构。
4.如权利要求3所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述第一电子透明构件包括沉积在所述第一结构构件上的二氧化硅、氮化硅、碳化硅和石墨烯中的至少一种；以及
所述第二电子透明构件包括沉积在所述第二结构构件上的二氧化硅、氮化硅、碳化硅和石墨烯中的至少一种。
5.如权利要求1所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述第一结构构件包括硅；以及
所述第二结构构件包括硅。
6.如权利要求5所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述第一结构构件具有在10μm和200μm之间的厚度；以及
所述第二结构构件具有在10μm和200μm之间的厚度。
7.如权利要求6所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述第一结构构件包括多个梯形凹槽，所述凹槽延伸穿过所述第一结构构件以在所述第一电子透明构件的表面上形成第一成像窗口；以及
所述第二结构构件包括多个梯形凹槽，所述凹槽延伸穿过所述第二结构构件以在所述第二电子透明构件的表面上形成第二成像窗口。
8.如权利要求7所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述第一成像窗口具有在1μm2与20μm2之间的面积；以及
所述第二成像窗口具有在1μm2与20μm2之间的面积。
9.如权利要求1所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述间隔件包括氧化硅或铟。
10.如权利要求8所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述铟的导热性和导电性有利于成像期间的电荷耗散。
11.如权利要求9所述的可冷冻流体单元系统，其中：
所述间隔件具有在20nm和200nm之间的厚度。
12.一种使用低温电子显微镜成像生物样本的方法，所述方法包括：
(a)将生物样本沉积到权利要求1所述的可冷冻流体单元系统的所述入口端口中，其中所述生物样本填充所述通道内的总体积；
(b)将所述生物样本进行冷冻以产生玻璃化生物样本；以及
(c)引导电子束通过所述第一电子透明构件、所述玻璃化生物样本、以及所述第二电子透明构件以产生指示生物样本的图像。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(c)进一步包括：
(d)获取图像的集合；以及
(d)使用统计方法处理所述图像集合以产生所述玻璃化生物分子的三维图像。
14.如权利要求13所述的方法，其中：
所述统计方法包括主成分分析、多变量分析或协方差分析。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(c)进一步包括：
以相对于入射电子束的方向的不同倾斜度获取一系列图像；
通过成像滤波器处理所述图像；以及
计算地组合所述图像以产生所述玻璃化生物样本的断层图像和三维图像。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(c)进一步包括：
使用荧光显微镜获取一系列图像；
定位所述荧光生物样本的位置；以及
将来自所述荧光图像的数据与cryo-EM低温电子显微镜图像合并，其中所述荧光生物样本在所述cryo-EM低温电子显微镜图像内是可标识的。
17.如权利要求12所述的方法，其中：
所述生物样本由进一步包含一种或多种病毒、蛋白质分子、细菌或组织样本的水溶液组成。
18.一种制造用于低温电子显微镜的可冷冻流体单元系统的方法，所述方法包括：
(a)使顶部芯片图案化以形成入口端口、出口端口、和第一成像窗口，所述顶部芯片具有第一结构构件和连接到其上的第一电子透明构件，所述入口端口和所述出口端口延伸穿过所述第一结构构件和所述第一电子透明构件，所述第一成像窗口延伸穿过所述第一结构构件到达所述第一电子透明构件的暴露表面；
(b)使底部芯片图案化以形成第二成像窗口，所述底部芯片具有第二结构构件和连接到其上的第二电子透明构件，所述第二成像窗口延伸穿过所述第二结构构件到达所述第二电子透明构件的暴露表面；
(c)将所述顶部芯片与所述底部芯片耦合到一起以形成与所述入口端口和所述出口端口流体连通的通道。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，间隔件位于所述顶部芯片和所述底部芯片之间，并且耦合到所述顶部芯片和所述底部芯片两者。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括使所述间隔件沉积到所述第一电子透明构件和所述第二电子透明构件中的至少一者上以将所述间隔件与其耦合的步骤。
21.如权利要求19所述的方法，其中：
使用选自化学沉积或物理沉积的技术执行使所述间隔件沉积。
22.如权利要求18所述的方法，其中步骤(a-b)进一步包括：
在形成所述入口端口、所述出口端口、和所述第一成像窗口之前，将掩蔽剂沉积到所述第一结构构件的至少一部分上；以及
在形成所述第二成像窗口之前，将所述掩蔽剂沉积到所述第二结构构件的至少一部分上；以及
在将所述间隔物沉积到所述第一电子透明构件上之前移除所述掩蔽剂。
23.如权利要求18所述的方法，其中：
使用选自光刻、湿法蚀刻或干法蚀刻的技术执行图案化。
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