CN110331156B - 抗Mical2多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗Mical2多克隆抗体及其制备方法。该抗Mical2多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：构建含有Mical2基因的重组表达载体，所述Mical2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得Mical2蛋白抗原；将所述Mical2蛋白抗原免疫动物，获得抗血清，然后分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体。该制备方法得到的抗Mical2多克隆抗体可以检测Mical2的蛋白水平，还可以用来检测Mical2的组织类型或细胞类型特异性，在细胞或组织中准确定位Mical2的表达位置。

Description

抗Mical2多克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗Mical2多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

Mical2(calponin and LIM domain containing 2)是一个肿瘤标志物蛋白，其含量被认为与肿瘤的发生发展有关，但是其蛋白组织表达特异性并不清楚，因此有必要开发一种能够用来检测其组织及细胞定位的抗体，以便通过抗体进一步研究Mical2的功能，或用于临床诊断。

目前市场在售的Mical2抗体可以做免疫印迹实验(immunoblot)，但是在组织切片中不能够识别目的蛋白的定位，因此现有技术有待改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗Mical2多克隆抗体及其制备方法，旨在解决现有Mical2抗体在组织切片中不能够识别目的蛋白的定位的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种抗Mical2多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

构建含有Mical2基因的重组表达载体，所述Mical2基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得Mical2蛋白抗原；

将所述Mical2蛋白抗原免疫动物，获得抗血清，然后分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体。

本发明另一方面提供一种抗Mical2多克隆抗体，所述抗Mical2多克隆抗体由本发明所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法制得。

本发明提供的抗Mical2多克隆抗体由本发明特有的制备方法制得，即通过将含有Mical2基因的重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得Mical2蛋白抗原，然后将该Mical2蛋白抗原免疫动物，将抗血清分离纯化就可以得到抗Mical2多克隆抗体，该制备方法得到的抗Mical2多克隆抗体一方面可以检测Mical2的蛋白水平，另一方面该Mical2多克隆抗体可以通过识别Mical2氮端多肽的序列，可以用来检测Mical2的组织类型或细胞类型特异性，在细胞或组织中准确定位Mical2的表达位置。

附图说明

图1为本发明实施例1中Mical2基因序列的限制性酶切图谱；

图2为本发明实施例1中含有Mical2基因序列的重组载体的结构图；

图3为本发明实施例1中SDS-PAGE分析Mical2蛋白于BL21(DE3)中表达情况结果图；

图4为本发明实施例1中SDS-PAGE分析Mical2蛋白上清纯化结果图；

图5为本发明实施例1中SDS-PAGE分析包涵体中Mical2蛋白纯化结果图；

图6为本发明实施例1中Mical2蛋白WB检测和SDS-PAGE对比图；

图7为本发明实施例2中抗Mical2多克隆抗体纯化后SDS-PAGE电泳图；

图8为本发明实施例3中抗Mical2多克隆抗体免疫荧光和免疫组化鉴定Mical2的结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种抗Mical2多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

S01：构建含有Mical2基因的重组表达载体，所述Mical2基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示；

S02：将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得Mical2蛋白抗原；

S03：将所述Mical2蛋白抗原免疫动物，获得抗血清，然后分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体。

本发明提供的抗Mical2多克隆抗体由本发明特有的制备方法制得，即通过将含有Mical2基因的重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得Mical2蛋白抗原，然后将该Mical2蛋白抗原免疫动物，将抗血清分离纯化就可以得到抗Mical2多克隆抗体，该制备方法得到的抗Mical2多克隆抗体一方面可以用于通过酶联免疫吸附和免疫印迹等方法检测Mical2的蛋白水平，另一方面该Mical2多克隆抗体可以通过识别Mical2氮端多肽的序列，可以用来检测Mical2的组织类型或细胞类型特异性，在细胞或组织中准确定位Mical2的表达位置。

Mical2基因的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1所示，在一实施例中，构建含有Mical2基因的重组表达载体的步骤包括：用NdeI内切酶和HindIII内切酶分别双酶切所述Mical2基因和载体pET30a，然后将酶切产物连接得到所述重组表达载体。最终，得到的所述重组表达载体的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.2所示；诱导表达获得的所述Mical2蛋白抗原的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.3所示。

在一实施例中，将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达的步骤包括：将所述重组表达载体转化到BL21(DE3)感受态细胞中，涂布到LB固体平板上培养，然后挑选单克隆菌落接种到LB液体培养基中培养，待培养至OD₆₀₀为0.5-0.8(该条件下感受态细胞处于指数生长期，其生长状态最好)，加入IPTG诱导表达。

在一实施例中，将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，利用Ni-IDA树脂亲和层析纯化得到所述Mical2蛋白抗原。

在一实施例中，所述Mical2蛋白抗原免疫的动物为新西兰白兔，免疫剂量为400ug/次，免疫间隔周期为1次/(2-3周)；间隔太长或计量过低会影响免疫效果导致动物不能产生抗体，间隔太短或计量太大则可能会使动物产生过强的免疫反应，不利于后续饲养；免疫次数可以为3-4次。进一步具体地，将所述Mical2蛋白抗原免疫新西兰白兔，当所述抗血清针对Mical2蛋白的效价大于1：50000，再分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体。该效价能保证抗体用于试验检测的质量。

在一实施例中，所述分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体的步骤包括：将Mical2蛋白抗原与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，然后将所得抗血清上样。

本发明实施例另一方面提供一种抗Mical2多克隆抗体，所述抗Mical2多克隆抗体由本发明实施例所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法制得。

具体地，上述制备方法得到的抗Mical2多克隆抗体的纯度大于85％；抗Mical2多克隆抗体的效价在1：128000以上；最终制得的抗Mical2多克隆抗体用含20％甘油的PBS缓冲液储存。

在本发明实施例中，通过限制性酶切位点Nde I和Hind III将Mical2基因插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终在大肠杆菌系统中表达与纯化：分别转到Top10克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株中，通过IPTG诱导表达Mical2蛋白，之后通过亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化Mical2蛋白。并以Mical2蛋白作为抗原，免疫新西兰白兔，经过3次免疫之后，使用抗原亲和纯化的方法获得针对Mical2蛋白的特异性多克隆抗体，并对纯化抗体进行ELISA效价、纯度、浓度检测，下面进行详细介绍。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1 Mical2蛋白在大肠杆菌系统中表达与纯化

1.1重组表达载体构建

首先合成Mical2基因序列(如序列表SEQ ID No.1所示)，并选择克隆位点：NdeI-HindIII；用NdeI\HindIII内切酶分别酶切Mical2基因序列(限制性酶切图谱如图1所示)和表达载体pET30a(+)(载体抗性：卡那霉素Kanamycin)，然后将酶切后的产物连接，即完成Mical2基因插入到表达载体pET30a中得到重组表达载体，并通过测序确认最终重组表达载体的准确性，重组载体的序列如序列表SEQ ID No.2所示，结构图如图2所示(其中，图中DT2199的位置即为Mical2基因序列的位置)。

1.2重组表达载体转化及诱导表达

将构建好的含有Mical2基因的重组表达载体转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆菌落，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。通过大肠杆菌表达系统表达Mical2蛋白融合N-His标签。

1.3 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果

取诱导表达后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清SDS-PAGE电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰，结果如图3所示：图中，M：蛋白marker；0：对照组；1：15℃诱导过夜组；2：37℃诱导过夜组。

1.4 Mical2蛋白放大培养

培养6L的表达菌，生长至OD₆₀₀＝0.8时(处于指数生长期，其生长状态最好)，加终浓度0.1mM IPTG，37℃诱导4h后收集菌体(如果当天不做纯化操作，将菌体冻于-20℃)。

1.5 Mical2蛋白纯化

上清中亲和层析纯化Mical2蛋白(整个纯化过程在低温下操作)：全菌采用50mMTris(pH8.0)，150mM NaCl含1％Triton X-100，1μg/mL Pepstatin A(胃蛋白酶抑制剂A)，1μg/mL Leupeptin(亮肽素)超声裂解，同时以50mMTris(pH8.0)，150mM NaCl缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测，分析结果见图4：图中，M：蛋白marker；1：全菌破菌离心后上清；2：上清同Ni-IDA孵育后流出液；3-4：50mM咪唑的洗脱组分；5-8：500mM咪唑的洗脱组分；经Ni-IDA亲和层析纯化分析，Mical2蛋白表达在包涵体中。

包涵体通过亲和层析纯化Mical2蛋白：包涵体采用50mM Tris(pH8.0)，150mMNaCl含1％Triton X-100，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，2mM DTT(二硫苏糖醇)洗涤后，以50mMTris(pH8.0)，150mM NaCl，8M Urea(尿素)，20mM Imidazole(咪唑)缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图5，图中，M：蛋白marker；1：包涵体溶解离心后上清；2：上清同Ni-IDA孵育后流出液；3：50mM咪唑的洗脱组分；4-8：300mM咪唑的洗脱组分。

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane 5-6(图5中的5-6)，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH 7.8)，4mM还原型谷胱甘肽GSH，0.4mM氧化型谷胱甘肽GSSG，2mM EDTA，0.4M精氨酸L-Arginine，2M Urea]中复性，复性后Mical2蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.8)溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

1.6 Mical2蛋白质检

Mical2蛋白稳定性测试(冻融实验)：取一支分装后冻于-80℃的Mical2蛋白，放置于冰水混合物中待其缓慢融化，融化后无异常现象，说明Mical2蛋白冻融实验是正常的。

Mical2蛋白浓度测定：用BSA(牛血清白蛋白)做标准品，采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，测定Mical2蛋白浓度为0.347mg/ml。

Mical2蛋白WB(Western Blot，蛋白质印迹法)检测：WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著。结果如图6所示：图中，1：BSA(1.5μg)；2：Mical2蛋白(1.5μg)；M1：SDS-PAGE Marker；M2：Western Blot Marker(Using Anti-His antibody)。

通过考马斯亮蓝R250染色的SDS-PAGE胶可知：Mical2蛋白纯度>90％，最后，Mical2蛋白储存液：1XPBS，pH7.8；-80℃冰箱保存，避免反复冻融。该Mical2蛋白氨基酸长度(Length)＝630；分子量(MW)＝72042.5；等电点(pI)＝6.94。氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.3所示：

实施例2 Mical2多克隆抗体制备

2.1动物免疫

以实施例1制备的Mical2蛋白进行BCA蛋白浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400ug/次，2-3周免疫1次，免疫间隔相同。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对Mical2(1-624)蛋白的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。该效价能保证抗体可以用于Mical2的ELISA或western-blot检测，保证抗体质量。

2.2多克隆抗体纯化

抗原亲和纯化：将Mical2蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

2.3多克隆抗体鉴定

通过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定，得到浓度为1.00mg/ml；检测数据如表1和表2所示。通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。抗体纯度鉴定纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，如图7所示。抗体纯化后纯度在85％以上。

包被抗原：Mical2蛋白；包被浓度：5ug/ml,100ul/孔；包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)；二抗：山羊抗兔-HRP，1/5000。

表1

注：起始稀释度:1:500；效价即样品OD/空白OD>＝2.1的最高稀释度。

表2

通过ELISA检测效价得出，效价>1:128,000；S/C.O＝3.93(Standard S/C.O≥1)：效价：样品OD值/阴性对照OD值≥2.1的最大稀释度；N.C为阴性对照；S为样品OD值；C.O为Cut-Off OD值＝2.1*N.C。

最终，Mical2抗体效价在128K左右，纯度在85％以上，获得纯化抗体得率达到4.00mg。抗Mical2多克隆抗体的储存液为：1XPBS 20％甘油Glycero，pH7.4；免疫前血清已添加0.02％防腐剂。抗体或蛋白请分装成小包装(建议分装为每次使用量)后保存于-80摄氏度冰箱，并避免反复冻融。保存时间超过1年，使用前请先电泳检测蛋白是否降解。

实施例3抗Mical2多克隆抗体对Mical2的细胞和组织定位

通过免疫印迹鉴定抗Mical2多克隆抗体识别Mical2的准确性，并检测抗Mical2多克隆抗体可以用于免疫荧光和免疫组化鉴定Mical2。

免疫荧光：1、将小鼠脑组织冰冻切片用4％PFA浸没固定10min，然后用PBS洗3次，每次浸没5min。2、将小鼠脑组织冰冻切片用含0.1％Trion-100的PBS溶液浸没10min，使细胞膜具有更高的通透性，然后用PBS洗3次，每次浸没5min。3、将小鼠脑组织冰冻切片用含4％BSA的PBS溶液封闭30min，防止非特异性的蛋白结合位点结合一抗。4、在小鼠脑组织冰冻切片上滴加Mical2多克隆抗体(用PBS1:100稀释)，4摄氏度孵育过夜(约16h)。5、将小鼠脑组织冰冻切片用PBS洗3次，每次浸没5min。6、用荧光标记的抗兔IgG的二抗滴加在小鼠脑组织冰冻切片上，室温孵育30min。7、将小鼠脑组织冰冻切片用PBS洗3次，每次浸没5min，然后用甘油封片。

免疫组化：1、将小鼠脑组织石蜡切片浸没于二甲苯中脱蜡3次，每次3min；然后分别浸没于梯度浓度的乙醇中进行复水：100％乙醇，3min＊2，95％乙醇，3min；70％乙醇，3min；50％乙醇，3min。2、将小鼠脑组织石蜡切片浸没于柠檬酸缓冲液，在微波炉中高火处理10min，使固定组织时造成的蛋白交联得以恢复。3、将小鼠脑组织石蜡切片浸没于含0.1％Trion-100的PBS中5min，然后浸没于PBS洗3次，每次2min。4、将小鼠脑组织石蜡切片用含4％BSA的PBS封闭30min，防止非特异性的蛋白结合位点结合一抗。5、在小鼠脑组织石蜡切片上滴加Mical2多克隆抗体(用PBS1:100稀释)，4摄氏度孵育过夜(约16h)。6、将小鼠脑组织石蜡切片浸没于PBS洗3次，每次5min。7、用带有辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗滴加在小鼠脑组织石蜡切片上1h，然后用PBS洗3次，每次浸没2min。8、在小鼠脑组石蜡冻切片上滴加辣根过氧化物酶(HRP)，室温孵育30min,然后用PBS洗3次，每次浸没2min。8、在小鼠脑组石蜡冻切片上AEC显色液，反应5min，用水冲洗1min洗去多余的显色液。9、在小鼠脑组石蜡冻切片上滴加苏木素孵育1min，用来显示细胞核，然后浸没在PBS中1min，洗去多余苏木素。10、50％甘油封片。

结果如图8所示：其中，(a)是一抗用本发明实施例制备的抗Mical2多克隆抗体进行免疫组化染色的结果；(b)是免疫组化一抗用兔IgG做的阴性对照；(c)是一抗用本发明实施例制备的抗Mical2多克隆抗体进行免疫荧光染色的结果；(d)是免疫荧光一抗用兔IgG做的阴性对照。通过图可知：本发明实施例的抗Mical2多克隆抗体可以用于免疫荧光和免疫组化鉴定Mical2。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 抗Mical2多克隆抗体及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1905

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catatgcatc atcatcatca ccacggagag aatgaagatg agaagcaggc gcaggccagc 60

caggtcttcg agaactttgt gcaagctacc acatgcaaag ggaccctcca ggccttcaac 120

atcctcacct gcctcctgga cctagatccg ctggaccata ggaacttcta ctcccagctc 180

aagtccaagg tgaacacctg gaaggccaaa gccctgtggc acaaactgga taagcgcggc 240

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gtggtggaga agagggacac cttctcccgg aacaatgtcc tgcacctctg gcccttcact 420

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ggagtggagg tccacgtgaa tgtggagttt gtgagggtgc tggagcctcc tgaagaccaa 600

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<210> 2

<211> 7149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

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accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980

gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgca tcatcatcat caccacggag 5100

agaatgaaga tgagaagcag gcgcaggcca gccaggtctt cgagaacttt gtgcaagcta 5160

ccacatgcaa agggaccctc caggccttca acatcctcac ctgcctcctg gacctagatc 5220

cgctggacca taggaacttc tactcccagc tcaagtccaa ggtgaacacc tggaaggcca 5280

aagccctgtg gcacaaactg gataagcgcg gctcccacaa ggagtacaag cgaggaaaag 5340

cctgctcgaa cactaagtgt ctcatcgtcg gaggaggacc atgtggcttg cgcactgcca 5400

ttgaacttgc ctacctggga gccaaagtgg ttgtggtgga gaagagggac accttctccc 5460

ggaacaatgt cctgcacctc tggcccttca ctatccatga cctgcggggc ctgggggcca 5520

agaagttcta tgggaaattc tgtgctggct ccatcgacca catcagtatc cgacaactgc 5580

agcttatcct cttcaaggtg gccctgatgc tgggagtgga ggtccacgtg aatgtggagt 5640

ttgtgagggt gctggagcct cctgaagacc aagagaatca aaaagttgga tggcgggcag 5700

aattccttcc tgcagaccac gccctgtctg actttgagtt tgatgtcatc atcggtgctg 5760

acggtcacag gaacacgcta gaaggcttca ggaggaaaga gttccgaggg aagctggcca 5820

tcgccatcac cgccaacttc ataaacagga acagcacagc tgaggccaag gtggaggaga 5880

tcagtggtgt tgccttcatc ttcaaccaga agttcttcca ggacctgaag gaagaaacag 5940

ggattgatct cgagaacatt gtttactata aggacagtac ccactacttt gtcatgacag 6000

ccaagaagca gagcctgctg gacaagggcg tcatccttaa tgactacatt gacacagaga 6060

tgctgctgtg ttcggagaat gtgaaccagg acaacctgct ctcctacgcc agagaagccg 6120

ctgactttgc caccaactac cagctgccat ccttagactt tgccatcaat cacaacgggc 6180

agcctgacgt ggccatgttc gacttcacct ccatgtatgc ctcagagaac gcagctctga 6240

tgcgtgagcg ccaggcacac cagctgctcg tggctcttgt gggcgacagc ctgcttgagc 6300

cattttggcc catgggcaca ggctgtgccc gaggcttcct ggcagccttt gacacggcat 6360

ggatggtgaa gagctgggac cagggcaccc ctcccctgga ggtattagct gaaagagaga 6420

gtctttacag gctgttacct cagacaaccc cagagaacat caacaaaaat tttgagcagt 6480

acacattgga cccagccacg cggtacccaa acctcaacct gcactgcgtc aggcctcacc 6540

aggtgaagca tttgtacatc actaaggaga tggaccgctt ccctctcgag agatggggct 6600

cagtgaggag atctgtcagc ctctccaggc gggagtcaga catccggcct aacaagcttt 6660

taacctggtg ccagcagcag accaagggtt accagcacgt cagagtcact gacctgacca 6720

catcctggcg cagcggcttg gccctgtgtg ccatcatcca cagcttccgg ccagagctga 6780

tcaactttga ctcgctgaat gaagatgacg ctgtggagaa caaccaactg gcatttgatg 6840

tggccaagcg tgagtttggg atcctgcctg tgaccacagg caaagagatg gcatctaccc 6900

aggagccaga caagctcagc atggtcatgt acctctccaa gttctatgag ctcttccggg 6960

gcacttaatg aaagcttgcg gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg 7020

ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 7080

cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta 7140

tatccggat 7149

<210> 3

<211> 630

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met His His His His His His Gly Glu Asn Glu Asp Glu Lys Gln Ala

1 5 10 15

Gln Ala Ser Gln Val Phe Glu Asn Phe Val Gln Ala Thr Thr Cys Lys

20 25 30

Gly Thr Leu Gln Ala Phe Asn Ile Leu Thr Cys Leu Leu Asp Leu Asp

35 40 45

Pro Leu Asp His Arg Asn Phe Tyr Ser Gln Leu Lys Ser Lys Val Asn

50 55 60

Thr Trp Lys Ala Lys Ala Leu Trp His Lys Leu Asp Lys Arg Gly Ser

65 70 75 80

His Lys Glu Tyr Lys Arg Gly Lys Ala Cys Ser Asn Thr Lys Cys Leu

85 90 95

Ile Val Gly Gly Gly Pro Cys Gly Leu Arg Thr Ala Ile Glu Leu Ala

100 105 110

Tyr Leu Gly Ala Lys Val Val Val Val Glu Lys Arg Asp Thr Phe Ser

115 120 125

Arg Asn Asn Val Leu His Leu Trp Pro Phe Thr Ile His Asp Leu Arg

130 135 140

Gly Leu Gly Ala Lys Lys Phe Tyr Gly Lys Phe Cys Ala Gly Ser Ile

145 150 155 160

Asp His Ile Ser Ile Arg Gln Leu Gln Leu Ile Leu Phe Lys Val Ala

165 170 175

Leu Met Leu Gly Val Glu Val His Val Asn Val Glu Phe Val Arg Val

180 185 190

Leu Glu Pro Pro Glu Asp Gln Glu Asn Gln Lys Val Gly Trp Arg Ala

195 200 205

Glu Phe Leu Pro Ala Asp His Ala Leu Ser Asp Phe Glu Phe Asp Val

210 215 220

Ile Ile Gly Ala Asp Gly His Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Arg Arg

225 230 235 240

Lys Glu Phe Arg Gly Lys Leu Ala Ile Ala Ile Thr Ala Asn Phe Ile

245 250 255

Asn Arg Asn Ser Thr Ala Glu Ala Lys Val Glu Glu Ile Ser Gly Val

260 265 270

Ala Phe Ile Phe Asn Gln Lys Phe Phe Gln Asp Leu Lys Glu Glu Thr

275 280 285

Gly Ile Asp Leu Glu Asn Ile Val Tyr Tyr Lys Asp Ser Thr His Tyr

290 295 300

Phe Val Met Thr Ala Lys Lys Gln Ser Leu Leu Asp Lys Gly Val Ile

305 310 315 320

Leu Asn Asp Tyr Ile Asp Thr Glu Met Leu Leu Cys Ser Glu Asn Val

325 330 335

Asn Gln Asp Asn Leu Leu Ser Tyr Ala Arg Glu Ala Ala Asp Phe Ala

340 345 350

Thr Asn Tyr Gln Leu Pro Ser Leu Asp Phe Ala Ile Asn His Asn Gly

355 360 365

Gln Pro Asp Val Ala Met Phe Asp Phe Thr Ser Met Tyr Ala Ser Glu

370 375 380

Asn Ala Ala Leu Met Arg Glu Arg Gln Ala His Gln Leu Leu Val Ala

385 390 395 400

Leu Val Gly Asp Ser Leu Leu Glu Pro Phe Trp Pro Met Gly Thr Gly

405 410 415

Cys Ala Arg Gly Phe Leu Ala Ala Phe Asp Thr Ala Trp Met Val Lys

420 425 430

Ser Trp Asp Gln Gly Thr Pro Pro Leu Glu Val Leu Ala Glu Arg Glu

435 440 445

Ser Leu Tyr Arg Leu Leu Pro Gln Thr Thr Pro Glu Asn Ile Asn Lys

450 455 460

Asn Phe Glu Gln Tyr Thr Leu Asp Pro Ala Thr Arg Tyr Pro Asn Leu

465 470 475 480

Asn Leu His Cys Val Arg Pro His Gln Val Lys His Leu Tyr Ile Thr

485 490 495

Lys Glu Met Asp Arg Phe Pro Leu Glu Arg Trp Gly Ser Val Arg Arg

500 505 510

Ser Val Ser Leu Ser Arg Arg Glu Ser Asp Ile Arg Pro Asn Lys Leu

515 520 525

Leu Thr Trp Cys Gln Gln Gln Thr Lys Gly Tyr Gln His Val Arg Val

530 535 540

Thr Asp Leu Thr Thr Ser Trp Arg Ser Gly Leu Ala Leu Cys Ala Ile

545 550 555 560

Ile His Ser Phe Arg Pro Glu Leu Ile Asn Phe Asp Ser Leu Asn Glu

565 570 575

Asp Asp Ala Val Glu Asn Asn Gln Leu Ala Phe Asp Val Ala Lys Arg

580 585 590

Glu Phe Gly Ile Leu Pro Val Thr Thr Gly Lys Glu Met Ala Ser Thr

595 600 605

Gln Glu Pro Asp Lys Leu Ser Met Val Met Tyr Leu Ser Lys Phe Tyr

610 615 620

Glu Leu Phe Arg Gly Thr

625 630

Claims (8)

1.一种抗Mical2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建含有Mical2基因的重组表达载体，所述Mical2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得Mical2蛋白抗原，所述Mical2蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

将所述Mical2蛋白抗原免疫动物，获得抗血清，然后分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体；

所述构建含有Mical2基因的重组表达载体包括：用NdeI内切酶和HindIII内切酶分别双酶切所述Mical2基因和载体pET30a，然后将酶切产物连接得到所述重组表达载体。

2.如权利要求1所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达的步骤包括：将所述重组表达载体转化到BL21感受态细胞中，涂布到LB固体平板上培养，然后挑选单克隆菌落接种到LB液体培养基中培养，待培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，加入IPTG诱导表达。

3.如权利要求1所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，利用Ni-IDA树脂亲和层析纯化得到所述Mical2蛋白抗原。

4.如权利要求1所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述Mical2蛋白抗原免疫的动物为新西兰白兔，免疫剂量为400 μg /次，免疫间隔周期为2-3周1次。

5.如权利要求4所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将所述Mical2蛋白抗原免疫新西兰白兔，当所述抗血清针对Mical2蛋白的效价大于1：50000，再分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体。

6.如权利要求1所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述分离纯化获得抗Mical2多克隆抗体的步骤包括：将Mical2蛋白抗原与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，然后将所得抗血清上样。

7.一种抗Mical2多克隆抗体，其特征在于，所述抗Mical2多克隆抗体由权利要求1-6任一项所述的抗Mical2多克隆抗体的制备方法制得。

8.如权利要求7所述的抗Mical2多克隆抗体，其特征在于，所述抗Mical2多克隆抗体的纯度大于85％；

所述抗Mical2多克隆抗体的效价在1：128000以上；

所述抗Mical2多克隆抗体用含20％甘油的PBS缓冲液储存。

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