CN110325527B - 作为细胞外柠檬酸盐摄取的抑制剂的磺酰胺 - Google Patents

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Abstract

式(I)的磺酰胺，其中A、R1、和R2是如说明书和权利要求书所定义的，可用作用于治疗代谢疾病和/或心血管疾病的药剂。

Description

作为细胞外柠檬酸盐摄取的抑制剂的磺酰胺
技术领域
本发明涉及取代的1-(苯磺酰基)-哌啶-4-甲酸酰胺衍生物及其作为细胞外柠檬酸盐摄取的抑制剂的用途，涉及含有该衍生物的药物组合物，并且涉及使用它们作为用于治疗代谢疾病和/或心血管疾病的药剂的方法。
背景技术
由于已知柠檬酸盐是能量代谢中的关键中间体，因此对主要位于肝脏和脑中的钠偶联柠檬酸盐转运蛋白(例如SLC13A5(NaCT))的抑制引起了将其作为例如用于治疗代谢障碍和疾病的潜在治疗方法的兴趣(Pajor,Pflugers Arch-Eur J Physiol 2014,466,119–130)。
Huard等人公开了SLC13A5的有效的和选择性的抑制剂，其以二羧酸盐部分为特征(Sci.Rep.2015,5,17391；J.Med.Chem.2016,59,1165-1175)。Brachs等人报道的抑制剂享有相同的结构基序(Diabetologie und Stoffwechsel 2016；11-P163)。
已描述过将经取代的1-(苯磺酰基)-哌啶-4-甲酸酰胺衍生物用作可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂(Xie等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.2009,19,2354-2359；WO 2010/080183)。
在WO 2015/008872中公开了作为柠檬酸循环活性的刺激剂的氰基三唑化合物。
发明内容
在第一方面，本发明涉及式(I)的化合物
Figure BDA0002080815960000011
其中
R1和R2独立地选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-；
A是选自A-G1组，其由以下组成：
被R3取代并且任选地被R4取代的苯基、
任选地被R5取代的2-吡啶基、
任选地被R6取代的3-吡啶基和
任选地被R7取代的2-噻唑基；
其中R3、R4、R5、R6和R7独立地选自如上文定义的Ri-G1组；
或其盐。
在第二方面，本发明涉及药物组合物，其包含一种或多种如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在第三方面，本发明涉及一种用于治疗有需要的患者的一种或多种代谢和/或心血管疾病的方法，其特征
在于向患者给予如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本发明涉及如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其用在用于在有需要的患者中治疗一种或多种代谢和/或心血管疾病的方法中，该方法的特征在于将所述化合物给予该患者。
在另一方面，本发明涉及如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在有需要的患者中治疗一种或多种代谢和/或心血管疾病的药剂的用途，该方法的特征在于将所述化合物或其药学上可接受的盐给予该患者。
通过前面和后面的描述，本发明的其他方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
通用术语和定义
本文未具体定义的术语应当被给与本领域技术人员根据本公开内容和上下文向它们给出的含义。然而，如说明书中所使用的，除非有相反的说明，否则以下术语具有指示的含义并遵守以下惯例。
除非明确指出，贯穿整个说明书和所附权利要求书，给出的化学式或名称应包括互变异构体和所有立体异构体、光学异构体和几何异构体(例如对映异构体、非对映异构体、E/Z异构体等)及其外消旋体以及处于不同比例的单独的对映异构体的混合物、非对映异构体的混合物、或任何前述形式的混合物，其中存在这样的异构体和对映异构体，以及盐，包括其药学上可接受的盐和其溶剂化物，如例如水合物，包括游离化合物的溶剂化物或化合物的盐的溶剂化物。
本文采用短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合于与人和动物组织接触使用而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症并且与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐而被修饰。药学上可接受的盐的例子包括但不限于碱性残基如胺的矿物盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱性盐或有机盐；等等。
术语卤素通常表示氟、氯、溴和碘。
术语“C1-n-烷基”，其中n是整数，单独或与另一个基团组合，表示具有1至n个C原子的无环、饱和、支链或直链烃基。例如，术语C1-4-烷基包括自由基H3C-(Me)、H3C-CH2-(Et)、H3C-CH2-CH2-、H3C-CH(CH3)-、H3C-CH2-CH2-CH2-、H3C-CH2-CH(CH3)-、H3C-CH(CH3)-CH2-、H3C-C(CH3)2-。
如本文所用，术语“治疗(treatment和treating)”包括治疗性(即治愈性和/或姑息性)和预防性(preventive，即prophylactic)治疗。
治疗性治疗是指对已经以明显、急性或慢性形式发展了一种或多种所述病症的患者进行的治疗。治疗性治疗可以是对症治疗，以便减轻特定适应症的症状，或因果治疗，以便逆转或部分逆转适应症的状况或者停止或减缓疾病的进展。
预防性(preventive)治疗(“预防(prevention)”)是指对在疾病临床发作之前处于发展一种或多种所述病症的风险下的患者进行的以便降低所述风险的治疗。
术语“治疗(treatment和treating)”包括给予一种或多种活性化合物以便预防或延迟症状或并发症的发作和预防或延迟疾病、病症或障碍的发展和/或以便消除或控制疾病、病症或障碍，以及减轻与疾病、病症或障碍相关的症状或并发症。
术语“治疗有效量”意指本发明化合物的以下量，其(i)治疗或预防特定疾病或病症，(ii)减弱、改善或消除特定疾病或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病或病症的一种或多种症状的发作。
具体实施方式
本发明公开了钠偶联柠檬酸盐转运蛋白SLC13A5的新型抑制剂，其可用于治疗与细胞外柠檬酸盐摄取相关或受其调节的疾病和/或病症，包括但不限于治疗代谢疾病和/或心血管疾病。
在本发明的第一方面，发现式(I)的化合物
Figure BDA0002080815960000041
其中R1、R2和A是如上文或下文所定义的，是SLC13A5的有效的和选择性的抑制剂。
在对柠檬酸盐摄取的两种不同细胞系统即内源性表达人SLC13A5(hSLC13A5)的HepG2细胞或过表达hSLC13A5的HEK293Flp-In细胞进行的实验中，本发明的化合物揭示了意想不到的抑制活性。因此，这种作用归因于SLC13A5的抑制并且被认为在生理条件下是相关的。另外，通过用甘氨酸转运蛋白2(GlyT2，SLC6A5)进行的试验可以证明在SLC膜转运蛋白家族内抑制活性的选择性。在实施例和实验数据部分中更详细地描述了这些研究的结果。
因此，预期如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐可用于治疗与细胞外柠檬酸盐摄取相关或受其调节的疾病和/或病症，包括但不限于治疗代谢疾病和/或相关的心血管疾病。
因此，根据本发明的一个方面，提供了式(I)的化合物
Figure BDA0002080815960000051
其中R1、R2和A是如上文或下文所定义的，或其盐。
根据一个实施方案，R1选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-。
根据另一个实施方案，R1是选自R1-G2组，其由以下组成：
Cl、Br、甲基、甲氧基和乙氧基。
根据另一个实施方案，R1是选自R1-G3组，其由以下组成：
Cl、Br和乙氧基。
根据另一个实施方案，R1是选自R1-G4组，其由以下组成：
Cl、Br和甲基。
根据一个实施方案，R2选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-。
根据另一个实施方案，R2是选自R2-G2组，其由以下组成：
Cl、Br和甲基。
根据另一个实施方案，R2是选自R2-G3组，其由以下组成：
Cl和Br。
根据一个实施方案，A是选自A-G1组，其由以下组成：
被R3取代并且任选地被R4取代的苯基、
任选地被R5取代的2-吡啶基、
任选地被R6取代的3-吡啶基和
任选地被R7取代的2-噻唑基，
其中R3、R4、R5、R6和R7是如上文或下文所定义的。
根据另一个实施方案，A是选自A-G2组，其由以下组成：
被R3取代并且任选地被R4取代的苯基，其中
R3和R4是如上文或下文所定义的。
根据另一个实施方案，A是选自A-G3组，其由以下组成：
任选地被R5取代的2-吡啶基，其中
R5是如上文或下文所定义的。
根据另一个实施方案，A是选自A-G4组，其由以下组成：
任选地被R6取代的3-吡啶基，其中
R6是如上文或下文所定义的。
根据另一个实施方案，A是选自A-G5组，其由以下组成：
任选地被R7取代的2-噻唑基，其中
R7是如上文或下文所定义的。
根据一个实施方案，R3选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-。
根据另一个实施方案，R3是选自R3-G2组，其由以下组成：
卤素、CN、甲基和甲氧基。
根据另一个实施方案，R3是选自R3-G3组，其由以下组成：
F、Cl和CN。
根据一个实施方案，R4选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-。
根据另一个实施方案，R4是选自R4-G2组，其由以下组成：
F和甲基。
根据另一个实施方案，R4是选自R4-G3组，其由以下组成：
F。
根据一个实施方案，R5选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-。
根据另一个实施方案，R5是选自R5-G2组，其由以下组成：
卤素、甲基和乙基。
根据另一个实施方案，R5是选自R5-G3组，其由以下组成：
F和乙基。
根据一个实施方案，R6选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-。
根据另一个实施方案，R6是选自R6-G2组，其由以下组成：
Cl、甲基和甲氧基。
根据一个实施方案，R7选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-。
根据另一个实施方案，R7是选自R7-G2组，其由以下组成：
甲基。
根据一个实施方案，式(I)的化合物选自(I-5)和(I-10)
Figure BDA0002080815960000071
根据另一个实施方案，式(I)的化合物选自(I-20)和(I-61)
Figure BDA0002080815960000072
式(I)的化合物的进一步优选的子实施方案是如下表中的实施方案(I-a)至(I-f)所阐述的，其中使用上述取代基定义并且其中取代基R4、R5、R6和R7是任选的(如在取代基A的定义中所述)，即它们可能存在或不存在：
Figure BDA0002080815960000073
根据本发明的化合物及其中间体可以使用本领域技术人员已知的和有机合成文献中描述的合成方法获得。优选地，化合物以与下文更全面解释的一般和具体制备方法(特别是在实施例和实验数据部分中)类似的方式获得。在某些情况下，可以改变进行反应步骤的顺序。也可以使用本领域技术人员已知但未在此详细描述的反应方法的变体。
研究下文的方案，用于制备根据本发明的化合物的一般方法对于本领域技术人员而言将变得显而易见。起始材料可以通过文献或本文中描述的方法制备，或者可以以类似或相似的方式制备。可以使用常规保护基团保护起始材料或中间体中的任何官能团。可以使用本领域技术人员熟悉的方法在反应序列内的合适阶段再次裂解该保护基团。
Figure BDA0002080815960000081
式(I)的化合物可以通过标准酰胺化程序由式(II)的酸和式H2N-CH2-A的伯胺(其中A如上文或下文所定义)在碱(例如，DIPEA)存在下施加例如偶联剂HATU来制备。式(II)的化合物可以通过标准脱保护程序由式(III)的酯制备。式(III)的酯可以由式(IV)的磺酰氯和式(V)的酯(其中R’表示保护基团，例如甲基或乙基)在溶剂(像例如二氯甲烷)中在碱(例如，三乙胺)存在下制备。
取代基R1、R2和A可以通过本领域技术人员已知的有机合成程序进行修饰。因此，在这些修饰之前取代基R1、R2和A的含义可以偏离上文或下文中针对式(I)的化合物使用的定义。
根据本发明的化合物以本身已知的方式分离和纯化，例如通过在减压下蒸馏出溶剂并重结晶从合适的溶剂获得的残余物或使其经受常规纯化方法之一，如例如在合适的支持材料上进行柱色谱法。
根据本发明的化合物可有利地使用实施例和实验数据部分中描述的方法来获得，也可以为此目的将该方法与本领域技术人员从他/她的专业知识中已知的方法组合。同样，根据本发明的其他化合物(没有在上文或下文中明确描述其制备)可以与实施例类似或相似地制备。
本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由可以含有碱性部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离碱形式与足量的适当的酸在水中或在有机稀释剂像乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈或其混合物中反应来制备。例如，用于纯化或分离本发明的化合物(例如三氟乙酸盐)的除上述酸之外的其他酸的盐也是本发明的一部分。
在本发明的第二方面，描述了本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以用作药物组合物中的活性成分。
用于给予本发明的化合物的合适制剂对于本领域普通技术人员而言是显而易见的，并且包括例如片剂、丸剂、胶囊、栓剂、锭剂、糖锭剂、溶液、糖浆、酏剂、小袋、注射剂、吸入剂和粉末等。
合适的片剂可以例如通过将一种或多种根据式(I)的化合物与已知的赋形剂混合而获得，该赋形剂为例如惰性稀释剂、载剂、崩解剂、佐剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂。
在一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含至少一种如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂，优选地作为固体口服剂型，更优选地选自包衣和未包衣片剂。
在本发明的第三方面，由于其柠檬酸盐转运抑制活性，本发明的化合物可用在用于治疗代谢疾病和/或心血管疾病的方法中。
因此，本发明涉及用于上述治疗方法中的如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。本发明还涉及所述化合物或其药学上可接受的盐在制造用于上述治疗方法的药剂中的用途。
在另一方面，本发明涉及用于治疗上述疾病和病症的方法，该方法包括向人给予通式(I)的化合物，特别是治疗有效量的该化合物。
实际治疗有效量或治疗剂量将通常取决于本领域技术人员已知的因素，如患者的年龄和体重、给药途径和疾病的严重程度。在任何情况下，将按允许基于患者的独特病症递送治疗有效量的剂量和方式给予该化合物。
根据本发明的此方面，提供了用于治疗有需要的患者的一种或多种代谢疾病和/或心血管疾病的方法，其特征在于将治疗有效量的至少一种如上文或下文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐给予患者。
实施例和实验数据
以下实施例仅用于说明本发明的目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
上文和下文中使用了以下缩写：
ACN 乙腈
Aq. 水性
DCM 二氯甲烷
DIPEA 二异丙基-乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
ESI 电喷雾电离
h 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
min 分钟
r.t. 环境温度(约20℃)
RT 保留时间
TFA 三氟乙酸
(1)式(IV)的化合物的化学合成
在合成示例化合物时施加的磺酰氯是文献中已知的或是根据有机合成文献中已知的程序制备的。
Figure BDA0002080815960000101
Figure BDA0002080815960000111
(2)式(I)的化合物的化学合成
实施例(I-1)
Figure BDA0002080815960000112
步骤1：
向磺酰氯3,5-二氯苯磺酰氯(10.0g；40.7mmol)和DCM(100mL)的混合物中添加异哌啶酸甲酯(6.05mL；44.8mmol)和三乙胺(6.25mL；44.8mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。将混合物依次用水性HCl(1mol/L)和水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并在真空中去除溶剂。
C13H15Cl2NO4S ESI正离子+负离子(环注射)：[M+H]+352m/z
HPLC(RT):1.05min(HPLC方法B)
步骤2：
将从步骤1获得的中间体的混合物(14.9g；42.3mmol)、水性氢氧化钠(4mol/L；31.7mL；127mmol)和甲醇(100mL)在70℃搅拌3h。在冷却至室温后，将反应混合物添加到水性HCl(4mol/L；50mL)中，将沉淀物滤出并在50℃干燥。
C12H13Cl2NO4S ESI正离子+负离子(环注射)：[M+H]+338m/z
HPLC(RT):0.96min(HPLC方法B)
步骤3：
将从步骤2获得的中间体的混合物(1.00g；2.96mmol)、HATU(1.24g；3.25mmol)、DMF(2.50mL)和DIPEA(0.56mL；3.25mmol)在室温搅拌20min。添加胺4-氰基苄胺(0.36mL，2.96mmol)，并将所得混合物在室温搅拌2h。在搅拌下添加摩尔过剩的水性NaHCO3溶液并滤出沉淀物，并在50℃下干燥，得到标题化合物。
C20H19Cl2N3O3S ESI正离子+负离子(环注射)：[M+H]+452m/z
HPLC(RT):0.70min(HPLC方法A)
根据针对合成实施例(I-1)所述的方法，由如表中所示的相应的磺酰氯和相应的胺制备以下示例化合物。
在胺作为盐酸盐(或其他盐)施用的情况下，在步骤3中添加另外的摩尔当量的DIPEA。在不容易通过沉淀获得优质标题化合物的情况下，通过制备型HPLC纯化(在用例如DCM萃取后)。
Figure BDA0002080815960000121
Figure BDA0002080815960000131
Figure BDA0002080815960000141
Figure BDA0002080815960000151
Figure BDA0002080815960000161
Figure BDA0002080815960000171
Figure BDA0002080815960000181
Figure BDA0002080815960000191
Figure BDA0002080815960000201
*由ESI-MS[M+H]+得到
**由ESI正离子+负离子(环注射)得到[M+H]+
a)类似于WO 2013/30138中针对由2-氰基-5-甲基吡啶合成2-氨基甲基-5-甲基吡啶所述的程序，由2-氰基-5-乙基吡啶制备2-氨基甲基-5-乙基吡啶。
b)类似于WO 2009/15369中针对由2-羟基甲基-4-甲基噻唑合成2-氨基甲基-4-甲基噻唑所述的顺序，由2-羟基甲基-5-甲基噻唑制备2-氨基甲基-5-甲基噻唑。
(3)分析方法和制备型色谱法
通常，已经获得所制备的化合物的1H-NMR和质谱。给出的质量峰(例如[M+H]+)是指单一同位素分子量。
制备型HPLC：
固定相：XBridgeTM C18；10μm或SunFireTM C18；10μm(两者都来自Waters)
分析HPLC/MS方法
在以下参数下测量给出的HPLC保留时间。
HPLC方法A
Figure BDA0002080815960000211
HPLC方法B
Figure BDA0002080815960000212
HPLC方法C
Figure BDA0002080815960000213
HPLC方法D
Figure BDA0002080815960000214
Figure BDA0002080815960000221
HPLC方法E
Figure BDA0002080815960000222
HPLC方法F
Figure BDA0002080815960000223
(4)HepG2/14C-柠檬酸盐摄取测定
内源性表达hSLC13A5的HepG2细胞获得自Wistar Institute(Knowles等人,Science 1980,209,497-499)。
原理：
HepG2细胞内源性表达hSLC13A5转运蛋白，其负责将柠檬酸盐摄取到这些细胞中。14C-柠檬酸盐的摄取可以被特异性SLC13A5抑制剂完全阻断，并且信号可以与未标记的柠檬酸盐竞争。
使用Cytostar-T测定监测向HepG2细胞中的14C-柠檬酸盐摄取。该测定形式基于导入的放射性柠檬酸盐，其凭借细胞内的生物学过程与含在板底部内的闪烁材料接近。基于将闪烁基质整合到测定板中，将放射性衰变转换成光信号。
方法：14C-柠檬酸盐摄取测定
测试化合物稀释液：从100％DMSO中的10mM储备溶液开始，使用适当的稀释步骤将化合物在纯DMSO中稀释。在摄取测定之前，将400μL测定培养基+4.8μL化合物溶液(或用于未被抑制的对照孔的纯DMSO)混合(测定中的最终DMSO浓度：1％(v/v))
14C-柠檬酸盐工作溶液(每96孔所需的体积)：1.88mL测定培养基(50％DMEM+50％哈氏F-12+15mM HEPES(pH 7.4)(培养基含有15.5mM D(+)-葡萄糖)+21.2μL 14C-柠檬酸储备溶液(储备液：0.1mCi/mL＝111,000,000dpm/500μL；大约1mmol/L)。
将HepG2细胞在细胞培养基(EMEM+10％胎牛血清+1x NEAA和10mM L-谷氨酰胺)中培养。对于该测定，弃去汇合培养物的培养基，并用不含Mg2+不含Ca2+的DPBS洗涤细胞。通过每75cm2培养瓶添加在含有7.5mMEDTA的不含Mg2+不含Ca2+的DPBS中的1.0mL 2x胰蛋白酶，在37℃持续长达3分钟，将细胞分离，并重悬于10mL细胞培养基中。在细胞计数后，将100,000个细胞/孔以200μL的体积接种到Cytostar-T闪烁96孔微量培养板中。在37℃，5％CO2的潮湿细胞培养箱中孵育过夜后，小心吸出细胞培养基，并在实验前将细胞与每孔200μL预热的(37℃)测定培养基(50％DMEM+50％哈氏F-12+15mM HEPES(pH 7.4)(培养基含有15.5mM D(+)-葡萄糖)一起孵育至少1小时。
临摄取测定之前，小心地去除测定培养基并向每个孔中添加100μL测试化合物稀释液(n＝3)。
在细胞培养箱中在37℃孵育20min后，向每个孔中添加20μL 14C-柠檬酸盐工作溶液(每孔最终体积：120μL；最终14C-柠檬酸盐浓度为大约1.8μM/孔)。
在细胞培养箱中在37℃孵育过夜后，使用透明塑料箔将板在顶部密封，并使用白色塑料箔在底部密封。
在密封后，将板置于TopCount NXT HTS中并记录信号。
通过S形剂量反应(可变斜率)在IDBS XLfit中计算化合物的IC50值。
(5)重组hSLC13A5/14C-柠檬酸盐摄取测定
克隆过表达hSLC13A5转运蛋白的人胚肾293(HEK 293)-Flp-In细胞(293Flp-In-hSLC13A5)：在GeneArt合成含有hSLC13A5的起源质粒pcDNA3.1-hSLC13A5。使用具有添加的HindIII(N-末端)和XhoI(C-末端)限制性位点的引物，通过PCR扩增从该质粒中获取hSLC13A5的cDNA，并使用相应的限制酶在框内亚克隆到来自Invitrogen的pcDNA5/FRT中。使用pcDNA/FRT-hSLC13A5质粒以及pOG44质粒稳定共转染来自Invitrogen的HEK293 Flp-In细胞。
原理：
使用稳定地过表达hSLC13A5转运蛋白的HEK 293-Flp-In细胞，该转运蛋白负责将柠檬酸盐摄取到这些细胞中。14C-柠檬酸盐的摄取可以被特异性SLC13A5抑制剂完全阻断，并且信号可以与未标记的柠檬酸盐竞争。
使用WGA-PVT SPA(小麦胚芽凝集素-聚乙烯基甲苯闪烁接近测定)珠监测向293-In-hSLC13A5细胞中的14C-柠檬酸盐摄取，该珠由于其WGA-PVT表面而与293-In细胞结合。该测定形式基于导入的放射性柠檬酸盐，其凭借细胞内的生物学过程与SPA珠接近。放射性衰变被转换成可以使用例如TopCount读板器测量的光信号。
方法：14C-柠檬酸盐摄取测定
测试化合物稀释液(2倍浓缩)：从100％DMSO中的10mM储备溶液开始，使用适当的稀释步骤将化合物在纯DMSO中稀释。
在摄取测定之前，将200μL测定培养基(1x HBSS(含有Ca2+和Mg2+，不含酚红)，含有5.56mM D(+)-葡萄糖)+19.44mM D(+)-葡萄糖(D(+)-葡萄糖的终浓度为25mM))+4.8μL化合物溶液(或用于未被抑制的对照孔的纯DMSO)混合(测定中的DMSO终浓度：1％(v/v))。
在制备2倍浓缩的测试化合物稀释液后，将50μL移液到白色OptiPlates-96的每个孔中，并在培养箱中在37℃孵育。
14C-柠檬酸盐工作溶液(每96孔所需的体积)：2.1mL测定培养基+23.65μL 14C-柠檬酸储备溶液(储备液：0.1mCi/mL＝111,000,000dpm/500μL)。
将293-In-hSLC13A5细胞在细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清+100μg/mL潮霉素B)中培养。弃去汇合培养物的培养基，并用DPBS(不含Mg2+不含Ca2+)洗涤细胞。通过每75cm2培养瓶添加2.0mL Accumax，在37℃持续长达3分钟，将细胞分离，并重悬于10mL测定培养基中。在细胞计数后，将50,000个细胞/孔以50μL的体积给予到含有相应测试化合物浓度的白色OptiPlates-96中。在细胞培养箱中在37℃孵育20min后，向每个孔中添加20μL14C-柠檬酸盐工作溶液(每孔最终体积：120μL；最终14C-柠檬酸盐浓度：大约2μM/孔)。
在潮湿的细胞培养箱中在37℃孵育4小时并向每个孔中添加30μL WGA-PVT SPA珠(0.25mg/孔)后，使用透明塑料箔将板在顶部密封。将板在室温孵育1h并轻轻摇动。
在孵育后，将板置于TopCount NXT HTS中并记录信号。
测试化合物的性能如下计算：含有用1％DMSO孵育的细胞的孔仅提供未被抑制的向293-In-hSLC13A5细胞(100％CTL)中的14C-柠檬酸盐摄取的值。除14C-柠檬酸盐工作溶液外还接受30mM未标记的柠檬酸钾溶液的含有细胞的孔提供背景值(0％CTL)。
通过S形剂量反应(可变斜率)在IDBS XLfit中计算化合物的IC50值。
(6)重组人GlyT2/3H-甘氨酸摄取测定：
生成过表达人GlyT2转运蛋白的人胚胎肾293细胞克隆(HEK293-hGlyT2)(自Origene获得含有编码人GlyT2转运蛋白的cDNA的质粒pCMV6-XL5-hGlyT2，从该质粒取得GlyT2的cDNA并将其亚克隆到来自Invitrogen的pcDNA3.1zeo中。
原理：
使用稳定地过表达人GlyT2受体的人胚胎肾293(HEK 293)细胞，该受体负责将甘氨酸摄取到这些细胞中。3H-甘氨酸的摄取可以被特异性GlyT2抑制剂完全阻断，并且信号可以与未标记的甘氨酸竞争。
使用Cytostar-T测定监测向HEK 293 hGlyT2细胞中的3H-甘氨酸摄取。该测定形式基于导入的放射性甘氨酸，其凭借细胞内的生物学过程与含在板底部内的闪烁材料接近。基于将闪烁基质整合到测定板中，将放射性衰变转换成光信号。
方法：3H-甘氨酸摄取测定
将过表达hGlyT2的HEK 293细胞在细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清+100μg/mLZeocin)中培养。对于该测定，去除90％汇合培养物的培养基并用DPBS洗涤细胞。通过添加2mL AccuMax，将细胞分离，并重悬于10mL培养基中。将细胞悬浮液以1000U/min离心5min，去除上清液，并将细胞重悬于不含甘氨酸的表达培养基(MEM(不含甘氨酸的培养基)+10％胎牛血清)中至200,000个细胞/mL，并分配到Cytostar-T闪烁96孔微孔板中(40,000个细胞/孔；200μl/孔)。然后将盖上盖的MTP在37℃5％CO2下孵育24小时。
第二天，在37℃5％CO2孵育1h后，将细胞板用200μL HBSS/Ala缓冲液(HBSS 10x(+Ca，+Mg)，含有5mM丙氨酸，用NaOH调节至pH 7.4)洗涤一次，并且随后将100μL/孔的含有在1.2％DMSO中1.2x浓度的化合物的HBSS/Ala(最终测试范围：100μM-100nM)在37℃孵育20min。在HBSS/Ala(最终3H-甘氨酸浓度为100nM)中添加20μL/孔3H-甘氨酸并在37℃孵育2小时后，将测定板置于Topcount NXT HTS中并记录信号。
通过S形剂量反应(可变斜率)在IDBS XLfit中计算化合物的IC50值。
(7)示例化合物的测定结果
Figure BDA0002080815960000261
Figure BDA0002080815960000271
Figure BDA0002080815960000281

Claims (16)

1.一种式(I)的化合物
Figure FDA0003593280240000011
其中
R1和R2独立地选自Ri-G1组，其由以下组成：
卤素、CN、C1-3-烷基和C1-4-烷基-O-；
A选自
被R3取代并且任选地被R4取代的苯基、
任选地被R5取代的2-吡啶基、
任选地被R6取代的3-吡啶基和
任选地被R7取代的2-噻唑基；
并且其中R3、R4、R5、R6和R7独立地选自如上文所定义的Ri-G1组，
或其盐。
2.根据权利要求1的化合物，其中
R1选自
Cl、Br、甲基、甲氧基和乙氧基，
或其盐。
3.根据权利要求1至2中任一项的化合物，其中
R2选自
Cl、Br和甲基，
或其盐。
4.根据权利要求1至3中任一项的化合物，其中所述化合物选自(I-5)、(I-10)、(I-20)和(I-61)：
Figure FDA0003593280240000021
或其盐。
5.根据权利要求1至3中任一项的化合物，其中
A选自
被R3取代并且任选地被R4取代的苯基，
其中R3和R4是如权利要求1所定义的，
或其盐。
6.根据权利要求1至3中任一项的化合物，其中
A选自
任选地被R5取代的2-吡啶基，
其中R5是如权利要求1所定义的，
或其盐。
7.根据权利要求1至3中任一项的化合物，其中
A选自
任选地被R6取代的3-吡啶基，
其中R6是如权利要求1所定义的，
或其盐。
8.根据权利要求1至3中任一项的化合物，其中
A选自
任选地被R7取代的2-噻唑基，
其中R7是如权利要求1所定义的，
或其盐。
9.根据权利要求1至3和5中任一项的化合物，其中
R3选自卤素、CN、甲基和甲氧基，
或其盐。
10.根据权利要求1至3、5和9中任一项的化合物，其中
R4选自F和甲基，
或其盐。
11.根据权利要求1至3和6中任一项的化合物，其中
R5选自卤素、甲基和乙基，
或其盐。
12.根据权利要求1至3和7中任一项的化合物，其中
R6选自Cl、甲基和甲氧基，
或其盐。
13.根据权利要求1至3和8中任一项的化合物，其中
R7选自甲基，
或其盐。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项的至少一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求1至13中任一项的至少一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗一种或多种代谢疾病和/或心血管疾病的药物中的用途。
16.根据权利要求1至13中任一项的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在有需要的患者中治疗一种或多种代谢疾病和/或心血管疾病的药物中的用途。
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