CN110305916A - 一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，涉及一种荧光材料。针对现有荧光材料生物安全性低、生产成本高、难以大批量制备等不足，提供一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，包括以下步骤：1)制备壳寡糖溶液；2)壳寡糖的美拉德反应；3)纯化，包括超滤纯化法、醇析纯化法和层析纯化法。制备的荧光材料具有水溶性好、生物安全性高、反应条件温和、生产成本低、荧光量子产率高的优点，无需特殊设备，生产过程绿色无污染，易于扩大化生产；利用温和的美拉德反应制备荧光材料，制得的荧光材料具有良好的水溶性和生物相容性以及优异的荧光发光性能，可在信息防伪、细胞成像、多色荧光纤维制备以及pH检测等方面应用。

Description

一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种荧光材料，具体是涉及一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法。

背景技术

具有生物相容性和水溶性的荧光材料在生物传感、生物检测和活体成像等领域有广阔的应用前景。传统的有机荧光材料存在光漂白以及生物毒性，而传统的半导体量子点存在合成条件苛刻、水溶性差、生物安全性低等问题。新型的有机量子点-碳点极大地改善了荧光材料水溶性和生物相容性，受到广泛关注。然而，碳点的商业化应用存在生产过程能耗高、纯化方法复杂、难以大规模生产等不足。例如，研究最为活跃的溶剂热法和水热法虽然可以一步合成碳点，但是往往需要在高温下反应，这对设备、能耗和生产安全均提出挑战。一些新型的方法，如微波法、超声法和电化学法等，也被应用于碳点的合成，这在一定程度上改善了合成条件，但是大型设备的投入增加了碳点类荧光材料生产成本。

美拉德反应(Maillard reaction)又叫非酶褐变反应，是发生在氨基化合物和羰基化合物之间的一系列复杂的反应的总称。美拉德反应具有反应条件温和、可操作性强的特点。在食品加工、储藏过程中，甚至在生物体内广泛发生。美拉德反应产物(Maillardreaction products，缩写MRPs)是在美拉德反应过程中形成的一系列复杂的混合物的总称。前驱体类型、反应体系pH、水分活度、温度、氧气等因素均会影响美拉德反应机理及其产物组成。目前，美拉德反应途径和产物组成的复杂性给美拉德反应机理和构效关系之间的研究带来巨大挑战。尽管如此，MRPs的优良性能引起广泛关注，其在食品增色、呈香、乳化、抗菌和抗氧化等方面的研究甚至应用颇为丰富。荧光产物是美拉德反应产物中的一个重要类别，具有水溶性好、生物安全性高、易于制备的特点。然而，针对MRPs中荧光产物的分离和结构鉴定的是当前研究的难点之一，而且MRPs类荧光材料的应用相关的报道不多。Dong等人以谷胱甘肽和抗坏血酸为前驱体，通过美拉德反应制备荧光探针，该荧光材料量子效率仅为18.2％，而且在细胞中不能长时间保持荧光特性(Jiang Xue Dong,Zi Li Wang,YueYang,et al.Bio-friendly Maillard reaction fluorescent products fromglutathione and ascorbic acid for the rapid and label-free detection of Fe³⁺inliving cells[J].Journal of Materials Chemistry B,2017,5(4):707-713)。

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，是一类丰富的可再生海洋资源。壳寡糖/低分子量壳聚糖是壳聚糖的不完全水解产物，具有生物相容性高、水溶性好、粘度低的特点。由于壳寡糖/低分子量壳聚糖同时含有氨基和醛基，分子间易于发生美拉德反应，伴随着荧光产物生成(Won-Kyo Jung,Pyo-Jam Park,Chang-Bum Ahn,Jae-Young Je.Preparation andantioxidant potential of maillard reaction products from(MRPs)chitooligomer[J].Food Chemistry,2014,145:173-178)。目前，在温和条件下通过壳寡糖/低分子量壳聚糖分子间的美拉德反应制备高量子产率的荧光材料还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有荧光材料生物安全性低、生产成本高、难以大批量制备等不足，提供一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，该荧光材料可用于生物成像、信息加密、荧光纤维和pH传感等方面。

本发明包括以下步骤：

1)制备壳寡糖溶液；

2)壳寡糖的美拉德反应；

3)纯化。

在步骤1)中，所述制备壳寡糖溶液的方法可为经过双氧水氧化-酶水解壳聚糖制备低分子量壳聚糖/酶混合溶液，或通过壳寡糖粉末直接配制的壳寡糖水溶液；所述壳寡糖溶液的体积百分浓度为5％～20％。

在步骤2)中，所述美拉德反应的初始pH值为4～8，反应的温度可为45～121℃，反应的时间可为0.5～240h。

在步骤3)中，所述纯化的方法包括超滤纯化法、醇析纯化法和层析纯化法；

所述超滤纯化法可用截留分子量为3～10kDa超滤膜截留呈色大分子，超滤液中即包含高量子产率的荧光产物；

所述醇析纯化法的具体步骤可为：在搅拌状态下加入2～6倍有机溶剂，混匀后，自然沉降，上清液通过有机滤膜过滤；所述有机溶剂可选自甲醇或乙醇等；

所述层析纯化法的具体步骤可为：将上述醇析上清液点样于层析系统，该层析系统固定相为含煅石膏粘合剂的硅胶，流动相组成为正丁醇、水、醋酸和氨水，正丁醇、水、醋酸和氨水的体积比为(10～30)︰(5～10)︰(5～10)︰1，收集水溶性荧光成分，加水溶解，离心，上清液进行真空冷冻干燥。

本发明利用温和的美拉德反应制备荧光材料，制得的荧光材料具有良好的水溶性和生物相容性以及优异的荧光发光性能，可在信息防伪、细胞成像、多色荧光纤维制备以及pH检测等方面应用。

与现有技术相比，本发明方法制得的荧光材料具有以下突出的优点：

1)反应条件温和、操作简单、无需特殊设备，生产成本低，生产过程绿色无污染，易于扩大化生产；

2)荧光材料具有优异的发光性能，量子效率高，可达40％；

3)水溶性好，生物毒性低；

4)用途广泛，可用于信息防伪、细胞成像、多色荧光纤维制备以及pH检测等方面。

附图说明

图1是实施例1制备的荧光材料在不同激发波长下的发射光谱图；

图2是实施例1制备的荧光材料的CCK-8毒性检测图(基于加入的壳聚糖原料浓度)；

图3是实施例1制备的荧光材料作用于Hela细胞的激光扫描共聚焦荧光图；

图4是实施例1制备的荧光材料用于荧光图案的绘制；

图5是实施例2制备的荧光材料用于疏水的光敏印章印制荧光图案；

图6是实施例1和2制备的荧光材料及原料的FT-IR谱图；

图7是实施例3制备的荧光材料在不同pH环境中的荧光强度。

具体实施方式

以下通过实施例将结合附图对本发明进行详细说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

在搅拌条件下将30g壳聚糖加入950mL去离子水中，分散均匀后，加入10mL冰醋酸，室温下搅拌溶解，再添加40mL 30％双氧水，于60℃下搅拌反应，在反应第5、15、25、35和45min时，均迅速补加10mL冰醋酸和30g壳聚糖，控制预处理总时间1h；添加2g过氧化氢酶，40℃反应15min，冷却后，用浓氨水调节pH值至5.6，加入36g纤维素酶，于55℃水浴锅中连续反应144h。产物经过离心后，留取上清液。

制备的美拉德反应产物在不同激发波长下的发射光谱如图1所示。结果表明，在220～460nm光激发下均能发射荧光，荧光发射呈现激发依赖特性，最大激发波长为340nm，最大发射波长440nm。

利用CCK-8测试，检测制备的美拉德反应产物对Hela细胞的毒性，结果如图2所示。结果表明制备的美拉德反应产物在较宽浓度范围内对Hela细胞无明显毒性。

制备的美拉德反应产物用于Hela细胞成像，如图3所示。荧光复合物主要分布在细胞核中，在细胞浆中有少量分布。

实施例2

实施例1中产物分别经过截留分子量为10kDa、5kDa和3kDa膜超滤处理，获得4种组分，分别为>10kDa,5～10kDa,3～5kDa以及<3kDa，其红外谱图如图6所示(原料壳聚糖及酶作为对照)。

由图6可知，实施例1和2产物中均保留了糖苷键相关的峰(1156、1078和896cm^-1)，而氨基(1598cm^-1)、酰胺Ⅰ键(1654cm^-1)和酰胺III键(1323cm^-1)对应的特征吸收带在反应后消失，同时在1630、1564和1407cm^-1处出现新的特征峰峰，归属为C-N和C＝N。说明壳聚糖水解产物上的氨基、乙酰氨基参与了美拉德反应，并且生成了西夫碱以及其它含氮产物。

<3kDa滤液的荧光量子产率高达30.4％，与1倍体积乙醇混合后，浸润光敏印章表面，印制的图案在凝胶成像系统的紫外灯下呈现明亮的荧光图案(如图4和5所示)，达到信息加密和防伪的目的。自然放置3个月后，图案仍然清晰、明亮。

实施例3

实施例1中产物经过3倍乙醇沉淀后，用薄层层析法分离，取15μL上清液点样于G型硅胶板上，所用展开剂为正丁醇、水、醋酸和氨水，体积比为10︰5︰5︰1。展开后，硅胶板自然风干后，取出有荧光部分的硅胶，用去离子水溶解后，13000rpm离心，获得的荧光产物呈现pH依赖型的荧光发射特性，荧光发射强度与pH值线性关系良好(如图7所示)。

实验证明：本发明的荧光材料具有水溶性好、生物安全性高、合成条件温和、成本低、荧光量子产率高、易于大批量制备的优势，在信息防伪、细胞成像、荧光纤维和pH检测等方面有潜在的应用。

Claims (10)

1.一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备壳寡糖溶液；

2)壳寡糖的美拉德反应；

3)纯化。

2.如权利要求1所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述制备壳寡糖溶液的方法为经过双氧水氧化-酶水解壳聚糖制备低分子量壳聚糖/酶混合溶液，或通过壳寡糖粉末直接配制的壳寡糖水溶液。

3.如权利要求1所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述壳寡糖溶液的体积百分浓度为5％～20％。

4.如权利要求1所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述美拉德反应的初始pH值为4～8，反应的温度为45～121℃，反应的时间为0.5～240h。

5.如权利要求1所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述纯化的方法包括超滤纯化法、醇析纯化法和层析纯化法。

6.如权利要求5所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于所述超滤纯化法是用截留分子量为3～10kDa超滤膜截留呈色大分子。

7.如权利要求5所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于所述醇析纯化法的具体步骤为：在搅拌状态下加入2～6倍有机溶剂，混匀后，自然沉降，上清液通过有机滤膜过滤。

8.如权利要求7所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于所述有机溶剂选自甲醇或乙醇。

9.如权利要求5所述一种基于壳寡糖美拉德反应的荧光材料的制备方法，其特征在于所述层析纯化法的具体步骤为：将醇析上清液点样于层析系统，该层析系统固定相为含煅石膏粘合剂的硅胶，流动相组成为正丁醇、水、醋酸和氨水，正丁醇、水、醋酸和氨水的体积比为(10～30)︰(5～10)︰(5～10)︰1，收集水溶性荧光成分，加水溶解，离心，上清液进行真空冷冻干燥。

10.如权利要求1所述制备方法制备的荧光材料在信息防伪、细胞成像、多色荧光纤维制备以及pH检测中的应用。