CN110305203A - 一种用于制备水凝胶的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于制备水凝胶的新型多肽,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。编码多肽的基因,其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明所提供的多肽用于制备水凝胶。本发明所提供的多肽用于制备水凝胶。该多肽在短时间内自聚合成胶,其合适的孔径大小和机械性能在软组织修复,药物缓释和3D细胞支架等方面具有较大的应用潜力。

Description

一种用于制备水凝胶的多肽
技术领域
本发明属于多肽筛选技术领域,具体涉及一种用于制备水凝胶的多肽。
背景技术
水凝胶是由亲水的聚合物链在水中发生交联后形成的一种新型高分子功能材料,因其具备结构稳定、高含水量、组织相容性良好等众多优势,在伤口敷料、药物缓释载体、软骨组织修复、口腔防护等领域有重大作用。目前,功能性水凝胶材料来源广泛,其中多糖类(壳聚糖、透明质酸、纤维素、海藻酸钠)和多肽类(明胶、丝素蛋白、聚L-赖氨酸)由天然亲水性高分子组成,其细胞相容性优异,种类繁多,但是机械性能受到限制;同时,合成亲水性高分子包括醇、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸,聚丙烯酰胺)形成的水凝胶结构可控,力学性能乐观,但在细胞相容性、药物缓释方面存在诸多不足。因此,对形成水凝胶的高分子进行定向改性使其不断满足应用的需要是今后研究的主流。
天然蛋白基水凝胶结构稳定,与其它作用材料融合性能优良,可以较好地模拟生物体各功能组织,并且由蛋白酶介导降解产生的多肽可以由细胞完全代谢,对人体无毒副作用。如今,海洋资源的开发与利用成为全球瞩目的焦点,通过分析海洋生物庞大的基因组和蛋白质组可以极大地促进生物仿生材料的制备。Hl-TSR-like是潮间带海洋粘附生物纵条矶海葵足盘中显著高表达的蛋白,同时也是细胞外基质常见组分之一,它在特定条件下自发聚集形成蛋白分子球,并进一步组装形成具有三维网状结构的水凝胶。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备水凝胶的新型多肽,从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的多肽,包含有:
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽;
2)在1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有1)中多肽活性的,由1)所衍生的多肽;
编码上述多肽的基因,其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2;
本发明所提供的多肽用于制备水凝胶;
本发明还提供一种水凝胶,是使用上述的多肽制备的;
所提供的水凝胶可用于软组织修复,药物缓释或3D细胞支架等领域。
本发明所提供的多肽用于制备水凝胶。该多肽在短时间内自聚合成胶,其合适的孔径大小和机械性能在软组织修复,药物缓释和3D细胞支架等方面具有较大的应用潜力。
附图说明
图1:Hl-TSR-like 3’RACE琼脂糖凝胶电泳检测图,其中1为第一次PCR电泳检测,2为巢式PCR电泳检测;
图2:Hl-TSR-like 5’RACE琼脂糖凝胶电泳检测图,其中1为第一次PCR电泳检测,2为巢式PCR电泳检测;
图3:重叠PCR琼脂糖凝胶电泳检测图,其中1为Hl-TSR-like 5’RACE,2为Hl-TSR-like 3’RACE,3为Hl-TSR-like RACE全长;
图4:Hl-TSR-like包涵体纯化后SDS-PAGE检测图;
图5:形态各异的蛋白水凝胶,其中a为于矩形模具(10*20mm)中自聚合的水凝胶,b为于2mL注射器中自聚合的水凝胶;
图6:水凝胶形貌观察图;
图7:蛋白水凝胶的应力-应变曲线;
图8:蛋白水凝胶的压缩强度和压缩模量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1:多肽的筛选
1.1:Hl-TSR-like组学信息
基于发明人课题组构建的纵条矶海葵足盘和柱体的转录组数据库对比,发现Hl-TSR-like基因片段是足盘中显著上调表达的基因,将其进行局部序列比对,将其归类为凝血酶致敏蛋白-1 1型重复(TSR)类的的蛋白。
Hl-TSR-like在海葵柱体的表达量(FPKM)为50.51,在足盘的表达量(FPKM)为11497.97,属于在海葵足盘中差异表达的基因。粘附蛋白的质谱数据显示,对于Hl-TSR-like识别出6个肽段,其中四个肽段为Hl-TSR-like所特有。
1.2:Hl-TSR-like的RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术
RNA-Seq中由于基因拼接得到Hl-TSR-like的序列,为了验证其基因序列的真实性,使用RACE技术来扩增基因全长。以RNA-Seq得到的序列为参考设计3’RACE和5’RACE的扩增引物。
表1:RACE所需引物信息表
1.2.1:Hl-TSR-like 3′RACE
第一次PCR(20μL体系):
PCR温度设置:运用touch down程序。反应结束后运用琼脂糖凝胶电泳检测。
巢式PCR(20μL体系):
PCR温度设置:运用touch down程序。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。图1显示巢式PCR后有较为清晰的条带,将PCR产物进行胶回收。
1.2.2:Hl-TSR-like 5’RACE
5’RACE PCR扩增体系同1.2.1,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果如图2所示。结果显示巢式PCR后有较为清晰的条带,将PCR产物进行胶回收。将胶回收产物加A,置于PCR仪中72℃20min。将加A产物用回收试剂盒进行纯化。纯化后的目的基因与pMD19-T载体连接,将连接产物转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞中。挑取单克隆进行菌落PCR验证,并选取目的片段插入成功的阳性单克隆进行测序。将测序结果与RNA-Seq结果进行比对,两个序列几乎完全匹配,说明基因序列可信。
1.2.3:Hl-TSR-like RACE全长
Hl-TSR-like的5′RACE与3′RACE有94bp的重复序列,选用重叠PCR将两端序列粘合在一起,其中重叠PCR引物信息如下。
上游引物:5’-GAACAGCAGTCAGTGAGCAGTCTTG-3’
下游引物:5’-GACTTGATAATACCACCGTGCGG-3’
PCR体系中先不加上下游引物进行5个循环,再添加引物进行30个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示。
将得到的RACE全长加A,连接到pMD19-T载体上,转化到TOP10感受态细胞中。挑取单克隆进行菌落PCR并选取目的片段插入成功的阳性单克隆进行测序,将RACE测序结果与RNA-Seq结果进行比对,比对结果吻合。
最终以纵条矶海葵cDNA文库为模板,对Hl-TSR-like进行克隆,获得了Hl-TSR-like全长序列,全长由189个氨基酸组成,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1,编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
>SEQ ID NO:1
CPIHGGYGSYGPYGKCSKTCGGGYQTCYRKCDNPAPLYGGNPCSGPASRTRACNVNVHCPVPGGWSPWSSYGKCSKPCGGGICYRTRTCTNPAPQYGGKDCEGPSKSSKSCNSECCKVNGGYGAWSKWSPCSITCRATPYAVGHQKRTRKCNKPYPACHGAKCYGPEYETKTCTPYAACPVYTPPPPAY
>SEQ ID NO:2
TGTCCAATTCATGGAGGATACGGATCTTACGGACCCTACGGTAAATGTAGCAAGACCTGCGGAGGTGGTTATCAGACGTGCTACAGAAAGTGTGACAACCCAGCTCCACTTTATGGTGGTAATCCTTGTAGTGGACCAGCCAGCAGGACAAGAGCTTGTAATGTCAATGTACATTGTCCAGTTCCCGGAGGATGGTCACCATGGAGTTCATATGGTAAATGTTCTAAGCCATGCGGTGGCGGCATATGTTATAGGACACGTACCTGTACCAACCCCGCACCACAATACGGCGGGAAAGATTGTGAAGGACCATCCAAGAGCTCCAAATCCTGCAACTCTGAATGTTGTAAAGTCAACGGTGGTTATGGTGCATGGTCCAAGTGGTCCCCATGCAGTATCACGTGCCGTGCCACGCCCTACGCAGTAGGCCACCAGAAGAGAACACGTAAATGCAATAAACCCTACCCAGCCTGCCATGGTGCTAAGTGTTATGGACCAGAATATGAGACGAAGACGTGCACTCCATATGCAGCATGTCCAGTCTATACACCTCCTCCACCAGCCTACTAA
实施例2:构建Hl-TSR-like-pET28a重组表达系统
通过构建含有六聚组氨酸标签的表达系统Hl-TSR-like-pET28a,在大肠杆菌中进行重组表达。在3′末端加入终止密码子TAA后,从5′端和3′端分别设计正向引物和反向引物。正向引物中含有限制性内切酶BamH I酶切位点(GGATCC),并且在BamH I酶切位点的上游添加保护碱基CG,从而提高限制性内切酶的酶切效率。同样的,反向引物中含有限制性内切酶Xho I酶切位点(CTCGAG)以及在上游加入表达护碱基CCG。扩增所需引物信息如下所示:
上游引物:5’-CGGGATCCTGTCCAATTCATGGAGGATACG-3’
下游引物:5’-CCGCTCGAGTTAGTAGGCTGGTGGAGGAGGTG-3’
将纯化后的PCR产物和pET28a载体分别利用限制性内切酶BamH I和XhoI进行双酶切,30℃酶切过夜。将酶切之后的产物用纯化试剂盒进行纯化,并将纯化后的基因片段和pET28a载体进行连接,16℃连接4h。将构建好的重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,将阳性克隆进行测序。测序结果显示插入的目的基因序列与预期一致。
2:Hl-TSR-like-pET28a蛋白表达与纯化
2.1:Hl-TSR-like-pET28a蛋白的原核表达
选择阳性克隆接种到含有卡那霉素抗性的5mL LB培养基中进行培养,将试管中培养的菌液作为种子液,接种于50mL LB培养基中,37℃,180rpm振荡培养。当菌液浓度达到OD600=0.6~0.8时加入0.2mM IPTG进行蛋白诱导,继续培养12h。在收集的菌体中加入1×PBS进行菌体重悬,利用超声波细胞破碎仪将菌体超声破碎,目标蛋白表达在包涵体中。
将活化后的菌种接种到1L LB培养基进行培养,诱导时加入0.2mM IPTG。培养结束后将菌液于4℃,3000g,离心30min,弃上清,收集菌体。加入25mL 1×PBS进行菌体重悬,洗涤除去培养基中的杂蛋白,然后将重悬后的菌体转移到50mL离心管中,4℃,5000g,离心10min,弃去上清,收集菌体。
2.2:Hl-TSR-like-pET28a蛋白包涵体纯化
(1)菌体沉淀加入20mL 1×PBS缓冲液重悬,冰水浴下超声破碎细胞,作用2s,间隔4s,功率60%,超声时间25min。12000g,4℃离心25min,弃上清,留沉淀。
(2)再次加入20mL 1×PBS缓冲液重悬,冰水浴下超声破碎细胞,作用2s,间隔4s,功率60%,超声时间12min。12000g,4℃离心20min,弃上清,留沉淀。
(3)用20mL洗涤液(1M尿素,1%甘油,1%TritonX-114,1mM EDTA)重悬沉淀,超声条件同(2),弃上清,留沉淀。再重复洗涤一次。
(4)沉淀使用15mL(8M尿素,10mM DTT,1mM EDTA,20mM Tris-HCl,pH 8.5)变性缓冲液室温溶解。12000g,25℃离心15min,留取上清。最终将蛋白溶液稀释至1mg/mL。
(5)透析复性:使用3500Da透析袋,在2.5L透析液(20mM Tris-HCl,pH 8.5)中透析过夜。将复性后的蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳检测,检测结果如图4所示;Hl-TSR-like-pET28a理论分子量为23.6KD,等电点为9.18,电泳结果显示蛋白得到正确表达,且纯度较高。
实施例3:Hl-TSR-like多肽的性质表征
3.1:水凝胶的制备
将在pH 8.5、20mM Tris-HCl中透析复性后Hl-TSR-like蛋白浓度调整为高于25mg/ml,浓缩后的蛋白溶液转移到模具中,16℃静置72h,蛋白即可自聚合成水凝胶,所得水凝胶形状如图5所示。
蛋白水凝胶形状可控,在不同材料的模具中凝胶条件不变,可以按照需求制造形态各异的样品。水凝胶另一个显著的特点是自聚合能力较强,如图5(a)中所示,水凝胶被截成两段后,在5min内即可恢复原样,这归因于蛋白内部之间强大的相互作用力。
3.2:水凝胶表面形貌观察(SEM)
70mg/ml蛋白在16℃静置72h形成水凝胶,使用扫描电子显微镜(HitachiS-4800)观察水凝胶孔径形态和大小。湿凝胶在-80℃冷冻,在样品完全冻干之后利用真空喷镀法在水凝胶表面镀一层铂金,之后进行形态观察,计算孔径大小。
图6结果表明Hl-TSR-like蛋白水凝胶微观结构呈规则多孔的海绵状,孔径约40μm,这满足制作3D细胞支架的要求(20-125μm可用做成年哺乳动物皮肤再生)。
3.3:水凝胶力学性质检测
将70mg/ml蛋白溶液置于2.0ml无菌注射器中,16℃静置72h形成圆柱形水凝胶(直径10mm,高12mm)。利用质构仪(TMS-PRO)进行水凝胶压缩性能的测定,压缩速度10mm/min,起始感应力为0.3N,绘制应力-应变曲线(图7),并且进一步计算其压缩强度和压缩模量。每组检测3个样品。
结果表明Hl-TSR-like水凝胶压缩强度为~22.65±2.14KPa,压缩模量为~109.60±4.26KPa(图8),相对于其它蛋白基水凝胶其机械强度较高,为后续应用奠定了基础。
综上所述,本发明的多肽浓度高于25mg/ml时,即可自聚合为水凝胶,蛋白浓度越高,凝胶速度越快。蛋白水凝胶内部由于存在强大的相互作用力,显示出自愈合的性能。SEM观察到蛋白水凝胶呈现规则多孔的海绵状结构,孔径约40μm,并且水凝胶的压缩模量达到109.60±4.26KPa,为其应用到细胞支架、药物载体等方面奠定了基础。
序列表
<110> 中国海洋大学 青岛卫辽医用生物材料有限公司
<120> 一种用于制备水凝胶的多肽
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Pro Ile His Gly Gly Tyr Gly Ser Tyr Gly Pro Tyr Gly Lys Cys
1 5 10 15
Ser Lys Thr Cys Gly Gly Gly Tyr Gln Thr Cys Tyr Arg Lys Cys Asp
20 25 30
Asn Pro Ala Pro Leu Tyr Gly Gly Asn Pro Cys Ser Gly Pro Ala Ser
35 40 45
Arg Thr Arg Ala Cys Asn Val Asn Val His Cys Pro Val Pro Gly Gly
50 55 60
Trp Ser Pro Trp Ser Ser Tyr Gly Lys Cys Ser Lys Pro Cys Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ile Cys Tyr Arg Thr Arg Thr Cys Thr Asn Pro Ala Pro Gln Tyr
85 90 95
Gly Gly Lys Asp Cys Glu Gly Pro Ser Lys Ser Ser Lys Ser Cys Asn
100 105 110
Ser Glu Cys Cys Lys Val Asn Gly Gly Tyr Gly Ala Trp Ser Lys Trp
115 120 125
Ser Pro Cys Ser Ile Thr Cys Arg Ala Thr Pro Tyr Ala Val Gly His
130 135 140
Gln Lys Arg Thr Arg Lys Cys Asn Lys Pro Tyr Pro Ala Cys His Gly
145 150 155 160
Ala Lys Cys Tyr Gly Pro Glu Tyr Glu Thr Lys Thr Cys Thr Pro Tyr
165 170 175
Ala Ala Cys Pro Val Tyr Thr Pro Pro Pro Pro Ala Tyr
180 185
<210> 2
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtccaattc atggaggata cggatcttac ggaccctacg gtaaatgtag caagacctgc 60
ggaggtggtt atcagacgtg ctacagaaag tgtgacaacc cagctccact ttatggtggt 120
aatccttgta gtggaccagc cagcaggaca agagcttgta atgtcaatgt acattgtcca 180
gttcccggag gatggtcacc atggagttca tatggtaaat gttctaagcc atgcggtggc 240
ggcatatgtt ataggacacg tacctgtacc aaccccgcac cacaatacgg cgggaaagat 300
tgtgaaggac catccaagag ctccaaatcc tgcaactctg aatgttgtaa agtcaacggt 360
ggttatggtg catggtccaa gtggtcccca tgcagtatca cgtgccgtgc cacgccctac 420
gcagtaggcc accagaagag aacacgtaaa tgcaataaac cctacccagc ctgccatggt 480
gctaagtgtt atggaccaga atatgagacg aagacgtgca ctccatatgc agcatgtcca 540
gtctatacac ctcctccacc agcctactaa 570

Claims (6)

1.一种多肽,其特征在于,所述的多肽包含有:
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽;
2)在1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有1)中多肽活性的,由1)所衍生的多肽。
2.一种基因,其特征在于,所述的基因编码权利要求1所述的多肽。
3.如权利要求2所述的基因,其特征在于,所述的基因的的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.权利要求1所述的多肽在制备水凝胶中的应用。
5.一种水凝胶,其特征在于,所述的水凝胶是使用权利要求1所述的多肽制备的。
6.权利要求5所述的水凝胶在制备软组织修复制品,药物缓释或3D细胞支架中的应用。
CN201910645175.0A 2019-07-17 2019-07-17 一种用于制备水凝胶的多肽 Active CN110305203B (zh)

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