CN110302194B - 一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学研究领域，公开了一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂，包括桉叶素和糖皮质激素，所述桉叶素的浓度为0.5％～5％，所述糖皮质激素的浓度为0.01～2.5％。本发明初次将桉叶素与糖皮质激素联合使用以治疗皮肤疾病，本发明的复方制剂除了既有糖皮质激素抗炎抗过敏的效应外，加入的桉叶素还可减轻因激素使用不当而引起的皮肤屏障损伤，可减少因激素外用不当导致的激素依赖性皮炎的发生，提高治疗水平。

Description

一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素 的复方制剂

技术领域

本发明涉及生物医学研究领域，具体涉及一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，对外界病原体变应原和物理损伤提供了保护性屏障，而且具有免疫监视、感觉器官的作用。细胞外基质(Extracellular matrix，ECM) 是表皮和真皮的重要组成部分，对维持正常的生理结构至关重要。ECM作为正常稳态过程的一部分，ECM的重塑始终参与机械刺激、血管生成和伤口愈合的过程。此外，ECM还与其他ECM组织、免疫细胞和血管细胞相互作用，以调节细胞增殖、分化和细胞内信号传导。

完整的皮肤屏障功能包括角质层结构完整、表皮足够涵养水份的能力以及抵抗外界刺激的能力，表皮水合作用的失衡将导致角质层分化异常、结构缺陷和屏障功能下降，临床出现干燥、瘙痒和皮肤敏感。

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是水、甘油和其他小溶质通过细胞膜的选择性通道，在上皮细胞和内皮细胞中表达，其中AQP3也是AQPs中的一种； Caspase-14是角质形成细胞(Kerotinocyte，KC)激活角化过程中的一种蛋白酶，一方面在KC的角化和角质层的形成起重要作用；另一方面，Caspase-14可以直接裂解Pro-FLG，将中间丝聚合蛋白(Filaggrin，FLG)降解为天然保湿因子 (Natural moisturizing factors，NMFs)，对维持角质层的含水量和屏障功能具有重要作用；FLG与其他几种蛋白一起交联成一个机械坚固的角化包膜，为细胞外脂质基质提供支架，FLG可通过多种机制影响皮肤屏障；骨膜素蛋白(Periostin， Per)是一种ECM蛋白，与Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白直接相连，参与ECM网状结构的形成，此外还作为整合素受体的配体直接作用于各种细胞，并可能与皮肤老化、伤口愈合和特应性皮炎的炎症过程有关；基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)又称明胶酶B，可由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞以及KC表达，可破坏基底膜的完整性，从而促使组织发生炎症、延迟愈合等改变，同时，MMP-9也是调节细胞生长、迁移、浸润、炎症及血管生成的关键信号之一；透明质酸(Hyaluronan，HA)是皮肤ECM中含量丰富的成分，HA具有吸水及锁水、润滑、调节渗透压等作用，在细胞增生和分化、组织重塑、血管形成、创伤愈合、肿瘤生长及转移、预防光老化、保护正常细胞免受毒性细胞及自由基等的侵袭中发挥着重要的生物学意义，在维持KC、表皮和真皮结构弹性和水结合力的功能中发挥重要作用。

外用糖皮质激素(Topical glucocorticoids，TGCs)因其抗炎、抗增殖作用，是皮肤科中重要的治疗手段。但长期使用糖皮质激素会出现一系列皮肤屏障破坏的问题，表现为皮肤变薄，弹性下降、血管扩张、紫癜、毳毛增多和痤疮样皮损，并伴有不同程度的瘙痒、灼热等自觉症状。目前的激素依赖性皮炎就是由于外用含糖皮质激素制剂后原有皮肤病皮损和症状显著好转，一旦停药就会导致原有症状、体征复发、甚至加重，而迫使患者再次外用糖皮质激素的一种亚急性炎症性皮肤病。研究发现糖皮质激素对伴有表皮屏障功能异常的炎症性皮肤病可改善其屏障功能，早期可因其抗炎作用修复皮肤屏障，长期使用可通过破坏KC及其结构蛋白、角质层脂质等影响皮肤屏障功能。

倍他米松(Betamethasone，BT)是糖皮质激素类药物中的一种。

研究认为，激素依赖性皮炎与长期超剂量、超浓度、超范围外用糖皮质激素制剂有关。

桉树脑(Eucalyptol)，又名1，8-桉叶素(1,8-cineole，Cin)，是一种单萜类化合物，在桉树叶、巴豆、紫花苜蓿、山香属、蔷薇属、鼠尾草属等芳香植物中天然存在。桉树脑已被广泛用于治疗呼吸道疾病，包括支气管炎、鼻窦炎、支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病。目前研究表明，桉树脑具有抗微生物、抗炎、抗氧化、保湿、抗肿瘤、抗组胺、促进伤口愈合、促渗透、抗焦虑等作用。

桉树脑在皮肤科的应用较少，但其强大的生物活性可能对皮肤屏障有修复作用。因此，本发明欲研发一种可减少激素依赖性皮炎的桉叶素和糖皮质激素的复方制剂。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂，以通过该复方制剂减少激素依赖性皮炎。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂，包括桉叶素和糖皮质激素，所述桉叶素的浓度为0.5％～5％，所述糖皮质激素的浓度为0.01～2.5％。

进一步的，所述糖皮质激素的浓度为0.05％～0.1％。

进一步的，所述糖皮质激素为倍他米松。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明初次将桉叶素与糖皮质激素联合使用以治疗皮肤疾病，本发明的复方制剂除了既有糖皮质激素抗炎抗过敏的效应外，加入的桉叶素还可减轻因激素使用不当而引起的皮肤屏障损伤，可减少因激素外用不当导致的激素依赖性皮炎的发生，提高治疗水平。

附图说明

图1为本发明的实施例中的HA标准品稀释示意图；

图2为本发明的实施例的研究方法的框架图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂，包括桉叶素、糖皮质激素和必要的常规复方制剂中的赋形剂和基质，桉叶素的浓度为0.5％～5％，糖皮质激素的浓度为0.01～2.5％，在本实施例中，所用的糖皮质激素的浓度为0.05％～0.1％，本实施例中所用的糖皮质激素为倍他米松。

为了验证桉叶素与糖皮质激素联合使用可减少激素依赖性皮炎的发生，本实施例在实验室内进行了如下研究：

S1：细胞培养

(1)细胞复苏

A.用紫外灯照射生物安全柜30min，用70％酒精棉球擦拭桌面、移液枪、离心管以及拿进生物安全柜的物品，并将完全培养液预热至37℃；

B.从-80℃冰箱取出装有细胞的冻存管，并迅速放置于37℃水浴锅中轻轻摇动约1min，使其尽快完全解冻；

C.吸取冻存管中的细胞悬液，转移至含有的完全细胞培养液的15mL离心管中提前加入预热的含10％FBS的培养液3mL，1000r/min，5min，用负吸泵吸弃上清，注意勿吸到细胞沉淀；

D.加入1mL10％FBS的完全培养基，轻轻重悬细胞，均匀滴入10cm细胞培养皿，十字摇匀法摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，隔天换液；

(2)细胞传代

A.在显微镜下观察细胞融合至70％-80％时进行细胞传代。

B.紫外灯照射消毒生物安全柜30min，70％酒精棉球擦拭桌面移液枪、离心管、以及拿进生物安全柜的物品。预热完全培养基、PBS、胰蛋白酶/EDTA至37℃。

C.吸弃培养皿中的培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2次(勿直接冲打细胞)，吸除PBS；

D.消化：培养皿中加入适量的0.25％EDTA-胰蛋白酶，以没过培养皿底为宜，在显微镜下观察细胞变圆、细胞间隙变大；或者肉眼见皿底见白色流沙样物质脱落，则消化完全(HaCaT细胞约3-5min)，加入含有10％胎牛血清培养基后终止消化；

E.轻轻敲打细胞培养皿侧壁使细胞脱落，加入至新的15mL离心管，配平后以1000r/min，5min离心；

F.吸弃上清，加入1mL完全培养基重悬，轻轻吹打混匀，按1:2-1:3传至新的培养皿，10cm培养皿加入7mL左右的完全培养基，镜下观察细胞密度。放入37℃、5％CO2培养箱中，隔天换液；

S2：通过CCK-8法细胞增殖活性检测确定实验用桉叶素及倍他米松的最佳浓度

(1)不同浓度的桉叶素和倍他米松分别对HaCaT细胞活性的影响

配置用于培养HaCaT细胞的完全培养基，完全培养基的配置方法如下：90％高糖DMEM，10％胎牛血清，1％双抗；

用完全培养基配置浓度分别为0.01％、0.001％、0.0001％和0.00001％的桉叶素溶液，同时用完全培养基配置浓度分别为0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L 和10μmol/L的倍他米松溶液；

桉叶素溶液的配制方法如下：先用DMSO配制10％桉叶素储存液，经0.22 μm滤膜除菌后用完全培养基再稀释成0.01％、0.001％、0.0001％和0.00001％ (v/v)的桉叶素溶液；

倍他米松溶液的配置方法如下：倍他米松以DMSO溶解，配制成10^-2mol/L 的储存液，经0.22μm滤膜除菌后用完全培养基稀释成使用时稀释成0.01μ mol/L、0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L的倍他米松溶液；

将实验分为11组，包括8组实验组、一组正常对照组、一组空白组和一组阴性对照组，其中8组实验组分别含有上述0.01％桉叶素溶液、0.001％桉叶素溶液、0.0001％桉叶素溶液、0.00001％桉叶素溶液、10μmol/L倍他米松溶液、1μ mol/L倍他米松溶液、0.1μmol/L倍他米松溶液和0.01μmol/L倍他米松溶液，正常对照组为含有HaCaT细胞的完全培养基，空白组为未含HaCaT细胞的完全培养基，阴性对照组加有0.1％DMSO；

将步骤S1中的HaCaT细胞传至第3代后，将HaCaT细胞制成1×104个/mL 的细胞悬液，并在96孔板中选择55孔用于接种，上述11组均设有5孔，每孔均加入100μL上述HaCaT细胞悬液，反复混匀细胞，余边缘空白孔用100μLPBS 填充，细胞贴壁后弃去原培养基，并用PBS洗涤2次，随后按上述分组再加入相应的新鲜的培养基100μL；将上述96孔板置于培养箱中培养12h、24h和36h 后，弃去原培养基，再将新鲜的培养基与CCK8按10:1的比例配置，混匀后向 96孔板中每孔加入100μL，并继续培养1h后终止培养，在酶联免疫检测仪OD 450nm处测量各孔的吸光值，并按以下公式计算细胞活性：细胞活性＝(实验组- 空白组)/(正常对照组-空白组)；

(2)桉叶素和倍他米松联合使用对HaCaT细胞活性的影响

用完全培养基配置浓度分别为0.01％和0.001％的桉叶素溶液，同时用完全培养基配置浓度分别为1μmol/L和10μmol/L的倍他米松溶液；

将实验分为7组，包括四组实验组、一组正常对照组、一组空白组和一组阴性对照组，四组实验组分别加有如下溶液：0.01％桉叶素和10μmol/L倍他米松混合液、0.01％桉叶素和1μmol/L倍他米松混合液、0.001％桉叶素和10μmol/L 倍他米松混合液、0.001％桉叶素和1μmol/L倍他米松混合液，正常对照组加有含有HaCaT细胞的完全培养基，空白组加有未含HaCaT细胞的完全培养基，阴性对照组加有0.1％DMSO；

将步骤S1中的HaCaT细胞传至第3代后，将HaCaT细胞制成1×104个/mL 的细胞悬液，并在96孔板中选择35孔用于接种，上述7组均设有5孔，每孔均加入100μL上述HaCaT细胞悬液，反复混匀细胞，余边缘空白孔用100μLPBS 填充，细胞贴壁后弃去原培养基，并用PBS洗涤2次，随后按上述分组再加入相应的新鲜的培养基100μL；将上述96孔板置于培养箱中培养12h、24h和36h 后，弃去原培养基，再将新鲜的培养基与CCK8按10:1的比例配置，混匀后向 96孔板中每孔加入100μL，并继续培养1h后终止培养，在酶联免疫检测仪OD 450nm处测量各孔的吸光值，并按以下公式计算细胞活性：细胞活性＝(实验组- 空白组)/(正常对照组-空白组)；

S3：通过qRT-PCR法检测HaCaT细胞中的AQP3、FLG、Per、Caspase-14、 MMP-9和GAPDH等6个基因的表达情况

(1)通过步骤S2确定的桉叶素溶液和倍他米松溶液的最佳浓度将实验分为五组实验组和一组正常对照组，五组实验组分别加有0.01％桉叶素溶液、0.001％桉叶素溶液、10μmol/L倍他米松溶液、0.01％桉叶素和10μmol/L倍他米松混合液、0.001％桉叶素和10μM倍他米松混合液，正常对照组只含有正常完全培养基；

(2)抽提RNA；

实验前的准备：氯仿、TRIZOL、异丙醇、75％酒精(无Rnase灭菌水配制)、DEPC水、无Rnase灭菌枪头和1.5mLEP管、PBS，操作前用75％酒精喷擦台面；

1)从6孔细胞培养板上吸走培养液，加1mL PBS清洗2遍，吸除PBS；

2)每孔108～109细胞加入1mL TRIZOL，并用枪头把细胞从培养板上小心的刮下来；

3)吹打混匀(动作不可太剧烈以免打断基因组DNA)，转移至干净的1.5mLEP 管中，冰上孵育5min；

4)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，使体系成粉红色乳浊状，冰上孵育 5min，于4℃低温离心机中12000rpm离心15min；

5)此时分三层，RNA在上层水相层，小心移取最上层水相至新的1.5mL管中，并计算体积(切勿将水相层下的蛋白质层吸走，以免影响RNA纯度)；

6)加入等体积的异丙醇(600μL)，充分混匀，-20℃助沉45min后，4℃， 12000rpm离心15min；

7)彻底弃上清，加入冰1mL 75％RNA专用乙醇(DEPC水配制)，轻弹管底使沉淀悬浮起来，以洗涤RNA沉淀中的盐离子，4℃，12000rpm离心10分钟；

8)在室温下静置10-15min，使RNA适度干燥(白色沉淀转变成透明半固体即可)；

9)加入适量DEPC水(10-20μL)溶解后取2μL测定浓度。(测定仪器 OneDrop微量分光光度仪)；

10)电泳：取1μL样品RNA、1μL 10×loading buffer和8μL DEPC ddH2O补齐10μL上样。100V电泳15min；

(3)逆转录合成cDNA；

1)去基因组反应体系如下：

2)逆转录体系：

(4)qPCR反应

1)引物合成

2)扩增条件

PCR体系：

PCR反应条件：

(5)分析数据：采用2-△△Ct分析各组实验的同一基因的表达差异；

S4：利用Western Blot法检测HaCaT细胞中的AQP3、FLG、Per、Caspase-14、 MMP-9、GAPDH的蛋白表达情况

(1)步骤S4的分组情况与步骤S3中的(1)相同；

(2)提取总蛋白

细胞接种至6孔板/6cm细胞培养皿/10cm细胞培养皿中，贴壁后，向各组实验中加入培养基，于5％CO2，37℃培养箱继续培养36h；

1)实验前准备：细胞刮、2mL EP管、96孔板、BCA溶液、超净水、PBS 溶液、RIPA细胞裂解液+PMSF+磷酸酶抑制剂+蛋白酶抑制剂，所有试剂和耗材均需要提前预冷；

2)全蛋白提取试剂盒配置细胞裂解液(每1mL的Lysis Buffer中加入10 μL100mMPMSF、10μL磷酸酶抑制剂、1μL蛋白酶抑制剂)，放置冰上备用；

3)6孔板中细胞总蛋白提取

a.将移除培养液的6孔板中，各孔加入适量预冷的PBS 1mL，用预冷的细胞刮刮除细胞，尽可能刮除干净，将PBS细胞悬液收集入预冷的2mL的EP管中；

b.重复以上步骤；

c.将收集好的细胞悬液EP管于4℃预冷的离心机中5000g，10min离心；小心吸弃上清；

d.于有细胞沉淀的EP管中入已经配好的细胞裂解液100-200μL，冰上裂解15min，于4℃摇床上摇15min，如果不变性处理应放-80℃冰箱保存；

e.12000g 4℃离心20min，吸取蛋白上清于预冷新的离心管中；

(1)利用BCA蛋白浓度检测法测定蛋白浓度；

1)实验前准备：枪头、移液器、96孔板、蛋白标准液、BCA液；

2)根据所测样品数配置BCA溶液(A液：B液体积比为50:1)

根据以下表格加入(μL)

3)每个样本重复3个复孔，每孔加入现配的BCA工作液200μL；

4)摇床摇匀30sec，37℃恒温箱30min，酶标仪562nm波长下比色；

5)样品浓度(μg/μL)＝[样品对应的蛋白含量/样品稀释总体积(20μL)]×样品稀释倍数；

6)按1:4加入5×loading buffer，煮沸10min，存储于-20℃冰箱；

(4)制备10％SDS-PAGE胶并完成电泳

1)用刷子轻柔刷洗玻璃板，用超纯水冲洗玻璃板，烘箱烘干后冷却至室温；

2)配胶：按以下表格配置10％分离胶，混匀后快速注入玻璃板间，灌至短玻璃板下3cm，后缓慢匀速注入超纯水压胶，静置约20-30min后出现明显分界线，倒去胶上的超纯水，用吸水纸吸干；按同下表格配置浓缩胶，混匀后注入玻璃板间，并平行插入梳子，室温静置30min；

3)上样：电泳槽中加入1×电泳液，在电泳液中垂直拔梳子，将蛋白依次加入样孔，边孔加入3μLMarker；

4)上样完毕后，按正负极盖好电泳槽盖子，恒压80V，约20-30min，当 Marker分离以及溴酚蓝指示带被压缩成一条线进入分离胶后，恒压120V，约1 h，直至溴酚蓝带至凝胶下部即可停止电泳；

(5)通过湿转法转膜

1)裁剪PVDF膜稍大于凝胶，用切角的方式标记凝胶和PVDF膜，用镊子把PVDF膜夹进甲醇中浸泡15s；

2)夹心制备：夹板黑色面朝下，浸泡于电转液中，从下到上按照顺序以下顺序小心放置：海绵-3层滤纸-胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵，用左手固定滤纸，一边浸湿，一边右手用试管轻轻压走气泡，夹好电转印夹；

3)按黑色对黑色面，白色对红色面放入电转槽，加满1×电转液，放入冰盒，

恒压100V，90min；

(6)封闭及抗体孵育

1)封闭：将蛋白面朝上，PVDF膜浸没在5％脱脂牛奶/5％BSA中，在室温下摇床上封闭约1-2h；

2)配置一抗，用5％BSA溶液稀释，4℃孵育过夜；

3)吸掉一抗后放置于适量的1×TBST中，洗膜3次(10min)；

4)配置二抗(用1:6000)，室温孵育1h-2h；

5)吸掉二抗后放置于适量的1×TBST中，洗膜3次(10min)；

(7)通过ECL发光法测定并分析结果

1)ECL显色液配置：避光配置，现用现配，将A液与B液等体积混合；

2)将显色液滴入含有蛋白面的PVDF膜上，将膜放入发光仪中曝光；

3)采用Image J对结果进行灰度分析，多组间比较采用LSD单因素方差分析，P小于0.05有统计学意义；

S5：通过ELISA法检测不同实验中的透明质酸的表达情况

1)样品收集

A.将HaCaT细胞复苏传代至3代备用；

B.分组情况与步骤S3中的(1)相同，按上述分组处理细胞36h；

C.收集细胞培养液于EP管中，5000g，5min离心，收集上清液，于-20℃冰箱保存。

2)试剂准备

A.1×洗涤缓冲液：若25×洗涤缓冲液有结晶，放置室温，轻轻混匀，直至结晶完全溶解；25×洗涤缓冲液20mL加入纯水配成500mL；

B.透明质酸标准品：按标签加入校准样品稀释液，混匀保证完全溶解；

C.底物显色剂：显色剂A与显色剂B应在使用前15min内混合，避光保存。

D.所有试剂和样品在使用前应放置室温，恢复至室温。

3)实验步骤：

A.标准品稀释：标准品用校准样品稀释液按图1所示的方式进行稀释；以未稀释的HA标准品(40ng/mL)作为最高浓度，校准样品稀释液作为最低浓度(0 ng/mL)；

B.样品稀释：用校准样品稀释液10倍稀释样品，混匀；

C.在包被HA一抗的96孔板中，用排枪每孔加入50μL检测稀释液，再分别加入各浓度的标准品及样品，重复2孔，覆盖上封膜纸，室温下在水平摇床下孵育2h；

D.吸除每孔液体后，每孔加入100μL 1×洗涤缓冲液，轻轻敲打侧壁3次后，反转倒出，重复3次，最后一次反转于干净的草纸上，轻敲去除多余的液体；

E.用排枪每孔加入100μL HA结合物，覆盖上封膜纸，室温下在水平摇床下孵育2h；

F.重复步骤4；

G.显色剂A与显色剂B等体积混匀，避光保存，用排枪每孔加入显色剂AB 混合物100μL，避光30min，于平台上孵育；

H.每孔加入100μL终止液，轻轻敲打侧壁，以充分混合，在30min内用酶标仪测450nm和540nm的吸光度；

I.结果分析：450nm OD值减去540nm OD值为校正后的数据，用Excel做线性回归，得出线性方程后，以样品的浓度乘以稀释倍数(10倍)则为样品终浓度；

S6.数据的统计分析

采用SPSS16.0进行统计分析，实验结果以±S表示，多组间比较采用LSD 单因素方差分析或重复测量方差分析，P<0.05有差异有统计学意义。

本发明的实施例的研究结果显示：

1.不同浓度的桉叶素和倍他米松单独对HaCaT细胞增殖活性的影响：

研究显示：0.01％桉叶素溶液和0.001％桉叶素溶液均能明显提高细胞活性 (均P＜0.05)，1μmol/L倍他米松溶液和10μmol/L倍他米松溶液均可明显提高细胞活性(均P＜0.05)，故本实施例在经过步骤S2后选择0.01％桉叶素溶液、 0.001％桉叶素溶液、1μmol/L倍他米松溶液和10μmol/L倍他米松溶液进行下一步实验；

2、不同浓度的桉叶素和倍他米松联合使用对HaCaT细胞增殖活性的影响：

研究显示：与正常对照组相比，除了0.01％桉叶素溶液和1μM倍他米松溶液混合组孵育HaCaT细胞36h明显抑制细胞活性外(P＜0.05)，桉叶素溶液和倍他米松溶液混合组处理不同时间(12h、24h、36h)对于细胞增殖活性无差异(F＝0.009，P>0.05)，桉叶素溶液和倍他米松溶液混合组的作用浓度和时间未显示对HaCaT细胞生长有交互作用(F＝0.22，P>0.05)，因此分别选择0.01％桉叶素溶液和10μmol/L倍他米松溶液组合和0.001％桉叶素溶液和10μmol/L倍他米松溶液组合以及最适孵育浓度36h进行后续实验；

3、不同分组对AQP3 mRNA和蛋白的影响

研究显示：与正常对照组相比，0.01％桉叶素溶液和0.001％桉叶素溶液可显著增加AQP3的mRNA的转录和蛋白的表达(分别均P＜0.05)，且0.01％桉叶素溶液的促转录和促表达效应比0.001％桉叶素溶液强(均P＜0.05)，即与浓度呈正相关；但与正常对照组相比，10μmol/L倍他米松溶液明显下调AQP3的 mRNA转录及其蛋白表达(均P＜0.05)；而与10μmol/L倍他米松溶液单独孵育相比，0.01％桉叶素溶液和0.001％桉叶素溶液分别联合10μmol/L倍他米松溶液共同孵育HaCaT后，虽然均可以增加AQP3的mRNA的转录和AQP3蛋白表达(均P＜0.05)，但AQP3蛋白表达水平低于正常对照组(均P＜0.05)；

4、不同分组对Caspase-14的mRNA和蛋白的影响

研究显示：与正常对照组相比0.01％桉叶素溶液显著上调Caspase-14的 mRNA的转录，10μmol/L倍他米松溶液下调Caspase-14的mRNA的转录，具有统计学意义(均P＜0.05)；而与10μmol/L倍他米松溶液相比，0.01％桉叶素溶液和10μmol/L倍他米松溶液的混合液也显著上调Caspase-14的mRN的转录，且具有统计学意义(均P＜0.05)；但各组Caspase-14蛋白表达无明显的统计学差异(P>0.05)；

5、不同分组对Pro-FLG mRNA和FLG蛋白的影响

研究显示：与正常对照组相比，0.01％桉叶素溶液、0.001％桉叶素溶液、10 μmol/L倍他米松溶液、0.01％桉叶素溶液与10μmol/L倍他米松溶液的混合液、 0.001％桉叶素溶液和10μmol/L倍他米松溶液的混合液(均P＜0.05)均能显著下调Pro-FLG mRNA的转录，且差异具有统计学意义，而有趣的是，与正常对照组，0.001％桉叶素溶液、10μmol/L倍他米松溶液、0.01％桉叶素溶液与10 μmol/L倍他米松溶液的混合液上调FLG蛋白，具有统计学意义(均P＜0.05)；相比于倍他米松溶液单独处理组，0.01％桉叶素溶液、0.001％桉叶素溶液与10 μmol/L倍他米松溶液的混合液下调FLG蛋白表达，差异具有统计学意义(均P ＜0.05)；

6、不同分组对Per mRNA和蛋白的影响

研究显示：与正常对照组相比，除了0.001％桉叶素溶液组，其余组别均明显下调Per mRNA的转录，且差异具有统计学意义(均P＜0.05)；但所有组别均下调Per蛋白的表达，且差异具有统计学意义(P＜0.05)；

7、不同分组对MMP-9 mRNA和蛋白的影响

研究显示：与正常对照组相比，各组均能显著下调MMP-9mRNA基因的转录(均P＜0.05)，且具有统计学意义；而与10μmol/L倍他米松溶液组相比，0.01％桉叶素溶液、0.001％桉叶素溶液分别联合10μmol/L倍他米松溶液组均显著下调 MMP-9 mRNA的转录效果更明显(均P＜0.05)，差异具有统计学意义；而在翻译水平显示，相比于正常对照组，0.01％桉叶素溶液和10μmol/L倍他米松溶液组明显下调MMP-9蛋白的表达(均P＜0.05)，而0.001％桉叶素溶液和10 μmol/L倍他米松溶液混合组对MMP-9蛋白的表达无影响(P>0.05)。

8、不同分组对细胞上清HA蛋白的影响

研究显示：与正常对照组相比，10μmol/L倍他米松溶液下调HA水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)；0.01％桉叶素溶液和10μmol/L倍他米松溶液混合组、0.001％桉叶素溶液与10μmol/L倍他米松溶液的混合组均可逆转单独10 μmol/L倍他米松溶液组对HA的作用，上调HA水平(均P＜0.05)，但不能达到正常对照组的水平(均P＜0.05)。

综上所述，本发明的研究结果表明倍他米松溶液可下调HaCaT细胞中的 AQP3、Per和MMP-9的mRNA和蛋白的表达，同时可下调HA和Caspase-14 的mRNA以及Pro-FLG的mRNA的表达，并上调FLG蛋白的表达；桉叶素溶液可上调HaCaT细胞的AQP3的mRNA和蛋白的表达，同时可上调Caspase-14 的mRNA，并可下调Pro-FLG的mRNA和FLG蛋白的表达，下调Per和MMP-9的mRNA和蛋白的表达；另外，桉叶素溶液可转变倍他米松溶液下调HaCaT细胞中的AQP3的mRNA和蛋白的表达、Caspase-14的mRNA的表达以及HA。

本发明表明桉叶素可通过调节部分细胞外基质、蛋白、基因mRNA转录和蛋白表达水平来参与皮肤屏障的保护作用，并可联合糖皮质激素制成复方制剂以应用于临床，以减轻目前因不适当的使用激素制剂而导致的皮肤屏障的损伤的发生。

本发明的复方制剂目前正在开展动物实验，桉叶素单方制剂已经进行临床试验注册(临床试验注册号ChiCTR1900020865)，并在临床开展随机对照实验，相关数据将在适当时候论文发表。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂，其特征在于，包括桉叶素和糖皮质激素，所述桉叶素的浓度为0.5％～5％，所述糖皮质激素的浓度为0.01～2.5％。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗炎和皮肤屏障保护作用的桉叶素联合糖皮质激素的复方制剂，其特征在于，所述糖皮质激素为倍他米松。

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