CN110300742B - 制备冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇制剂的方法 - Google Patents

制备冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇制剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种冻干2‑[(3‑氨基丙基)氨基]乙硫醇的制备方法，包括以下步骤：a)氨磷汀溶液与强酸反应，得到2‑[(3‑氨基丙基)氨基]乙硫醇溶液，和b)将2‑[(3‑氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液冻干，加入或不加入赋形剂。

Description

制备冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇制剂的方法
本发明涉及一种制备冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇制剂的方法，以及通过所述方法得到的相应冻干物。
氨磷汀是一种磷酸化的前药，在碱性磷酸酶的作用下，转化为游离的活性2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇(氨基硫醇)。目前，氨磷汀通过静脉递送，但重要的副作用与给药途径有关(低血压，恶心……)。氨磷汀的口服给药途径已经在动物和人中都进行了试验，但是研究表明，氨磷汀和氨基硫醇的吸收很差，主要是由于在胃肠道中的显著降解(KouvarisJR等人,Amifostine:the first selective-target and broad spectrumradioprotector.The Oncologist 2007；12:738-747)。
目前，氨磷汀在各国以
Figure BDA0002078240850000011
销售，
Figure BDA0002078240850000012
是一种静脉输液用无菌冻干粉，用于以下适应症：
-降低与晚期卵巢癌患者重复施用顺铂有关的累积肾毒性，和
-降低在经受用于头颈癌的术后放射治疗的患者中中度至重度口腔干燥症的发生率，其中所述放射端口包括腮腺的大量部分。
US 6,239,119公开了通过局部施用氨磷汀和相关化合物来治疗或保护粘膜组织免受与癌症的放射和/或化学治疗相关的损伤的方法。它还公开了通过局部施用氨磷汀和相关化合物来治疗和预防与粘膜炎有关的感染。
迄今为止，还没有包含氨磷汀或其衍生物的有效的用于治疗由放射引起的(radiation-induced)口腔粘膜炎的稳定的热凝胶制剂。
本发明的目的是制备用于化学-放射防护的稳定的局部制剂，其包含2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇，其粘附于粘膜或皮肤上。
本发明的另一个目的是在存在或不存在赋形剂的情况下，提供一种制备稳定的冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的方法。
本发明的另一目的是提供已配制于或待配制于用于治疗由放射引起的粘膜炎的热敏凝胶中的稳定的冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇。
本发明的另一目的是提供已配制于或待配制于用于治疗由放射引起的皮肤红斑的热敏凝胶中的稳定的冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇。
本发明涉及在存在或不存在赋形剂的情况下制备冻干的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇，特别是稳定的冻干的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的方法，所述方法包括以下步骤：
a)氨磷汀溶液与强酸反应，得到2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇溶液，和
b)将2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液冻干，加入或不加入赋形剂。
本发明还涉及一种在存在或不存在赋形剂的情况下制备冻干的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇制剂的方法，包括上述步骤。
本发明的制备方法具有提高所得冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的稳定性的优点。
优选地，在ICH(国际人用药物技术要求协调委员会)条件下储存给定时间后，所得冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇优选地含有相对于所述产品总重量小于5％、更优选地小于2％、还更优选地小于1％(面积％)的二硫化物(或任何其它杂质)。
优选地，冻干的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇(或氨基硫醇)为盐的形式。如下所示，使用强酸将氨磷汀转化为氨基硫醇得到盐。
特别地，当使用盐酸时，该转化步骤可以表示如下：
Figure BDA0002078240850000021
根据本发明，氨磷汀的溶液包含氨磷汀酸性溶液。
根据本发明，术语"强酸"是指在溶液中完全离子化的酸。在本申请中，它是指任何在药学领域中广泛使用的酸。优选地，本发明的强酸具有等于或小于2.0的pKa。
优选地，强酸选自：盐酸、磷酸、硫酸，及其混合物。最优选地，强酸为盐酸。
如上定义的步骤a)的目的是得到尽可能完全的转化以及最少量的杂质。因此，所得氨基硫醇溶液具有高纯度。
根据优选的实施方案，如上定义的步骤a)包括氨磷汀溶液与盐酸的反应。
根据优选的实施方案，步骤a)在50℃和90℃之间的温度下进行。
低于50℃时，转化过程太长(特别是超过24小时)，氨基硫醇的产率低于90％。高于90℃时，转化过程加速，但新的未知杂质形成。
优选地，步骤a)在50℃和70℃之间的温度下进行，且最优选地在等于60℃的温度下进行。
根据优选的实施方案，步骤a)进行30分钟至24小时。
少于30分钟，转化不完全，氨基硫醇的产率低于90％。超过24小时，新的未知杂质形成。
优选地，步骤a)进行1小时。
根据优选的实施方案，氨磷汀的浓度在80mg/ml和500mg/ml之间。
在氨磷汀浓度低于80mg/ml时，进行稀释步骤，特别是如下所述的稀释步骤a1)是有利的。
在氨磷汀浓度高于500mg/ml时，由于氨磷汀的溶解性，该方法难以实施。
优选地，氨磷汀的浓度等于500mg/ml。
根据优选的实施方案，酸的摩尔浓度(或其物质的量浓度)为1M至4M。
对于低于1M的酸的摩尔浓度，转化过程可能太长，氨基硫醇的产率低于90％。
对于高于4M的酸的摩尔浓度，所得热凝胶的最终pH将会太低(pH＜4.0)，因此热凝胶将不适于其施用。因此，有必要进行另一个调节pH的步骤。
优选地，酸的摩尔浓度等于4M。
根据一个实施方案，氨磷汀的量与酸的量之间的摩尔比在1：0.5和1：3之间，优选地在1：0.5和1：2之间.
当摩尔比小于1：0.5时，转化过程太长，氨基硫醇的产率低于90％。
当摩尔比高于1：3时，所得热凝胶的最终pH将会太低(pH＜4.0)，因此热凝胶将不适于其施用，并且应当向制备过程中加入另一个调节pH的步骤。
步骤b)是冷冻干燥步骤，也称为冻干或冷冻干燥。该步骤包括在存在或不存在赋形剂，如渗透增强剂、作为芳香剂和甜味剂的掩味剂、粘膜粘附剂、共溶剂、湿润剂、着色剂和其它功能赋形剂，如泊洛沙姆(poloxamer)的情况下，冷冻2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液，然后降低周围压力以使材料中的冷冻水直接从固相升华到气相。
优选地，对于该冷冻干燥步骤，要考虑几个参数：冷冻速率、搁板冷冻温度和初次干燥的搁板温度。
根据优选的实施方案，冷冻速率应该是高的。优选地，在40分钟的步骤期间，该冷冻速率为约1.6℃/分钟。这种高冷冻速率使得可以避免在冷冻过程中由被冰基质排除的酸性溶质的高浓度导致的在冻干物表面上"皮"(或"壳")的形成。
根据优选实施方案，所述搁板冷冻温度较低。优选地，搁板冷冻温度为约-60℃，以使在升华之前冷冻所有的酸性氨基硫醇溶液。
根据优选实施方案，初次干燥的搁板温度较低。优选地，为了避免产品融化，初次干燥的搁板温度低于-40℃。在初次干燥的第一步中，产物温度低于产物的融化温度。
本发明的方法还可在步骤a)之后和步骤b)之前包括步骤a1)，在溶液中加入或不加入赋形剂的情况下，稀释2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液。
步骤a1)优选地包括将包含水或至少一种泊洛沙姆的水溶液加入到2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液中。
优选地，步骤a1)包括将包含至少一种泊洛沙姆的水溶液加入到2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液中。
泊洛沙姆(商品名：
Figure BDA0002078240850000042
)是环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的非离子嵌段共聚物，其通过首先将环氧丙烷，然后将环氧乙烷依次加成到低分子量水溶性丙二醇上合成(Thermosensitive Self-Assembling Block Copolymers asDrug Delivery Systems.G.Bonacucina,M.Cespi,G.Mencarelli,G.Giorgiono andG.F.Palmieri.Polymers 2011,3,779-811)。
Figure BDA0002078240850000041
优选地，用于本发明的泊洛沙姆是泊洛沙姆407、泊洛沙姆188，及其混合物。
泊洛沙姆407是药物局部制剂中常用的共聚物。
泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的混合物因其热敏性被广泛用于药物应用中。两种等级的泊洛沙姆-407和188的组合允许实现若干种溶胶-凝胶温度转变。
在恒定的泊洛沙姆407浓度下，增加泊洛沙姆188浓度使溶胶-凝胶温度转变逐渐增加，先达到最大值，然后降低。
本发明还涉及易于根据上述方法得到的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的冻干物，特别是稳定的冻干物。
本发明还涉及制备2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的热凝胶组合物、特别是2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的稳定的热凝胶组合物的方法，包括用水溶液重构如上定义的冻干物。
根据本发明，热敏凝胶是一种原位形成体系，其在给药前，例如在室温或在5℃±3℃下为液体，并且在加热条件下成胶凝状。冷却后，该体系再次变成液体。
用于该重构步骤的水溶液可包含水和/或如上定义的泊洛沙姆。
优选地，当冷冻干燥的氨基硫醇通过包括实施上述步骤a1)的方法制备时，该水溶液由水构成，所述步骤a1)包括用包含至少一种泊洛沙姆的溶液稀释。
优选地，当冷冻干燥的氨基硫醇通过包括实施上述步骤a1)的方法制备时，该水溶液包含至少一种泊洛沙姆，所述步骤a1)包括仅用水稀释。
优选地，其它赋形剂可加入到该水溶液中，用于以下目的，但不限于此：渗透增强剂，例如
Figure BDA0002078240850000051
(二乙二醇单乙醚)、作为芳香剂和甜味剂的掩味剂、粘膜粘附剂、共溶剂、湿润剂、着色剂和其它功能赋形剂。
优选地，用于重构步骤的水溶液还包含芳香剂，例如薄荷香料和/或苦味掩蔽剂，和/或其它赋形剂，例如渗透增强剂。
例如，用于冷冻干燥的氨基硫醇的重构步骤的水溶液含有薄荷香料、苦味掩蔽剂和水，各自优选以下的量：4％、0.05％和95.95％重量/重量/重量。
本发明还涉及一种易于根据上述方法得到的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的热凝胶组合物。
本发明还涉及如上所述的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的热凝胶组合物，其用于治疗由放射引起的口腔粘膜炎。
本发明还涉及如上所述的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的热凝胶组合物，其用于治疗由放射引起的皮肤红斑。
本发明还涉及如上所述的2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的热凝胶组合物，其用于治疗或保护粘膜或皮肤组织免受与抗癌治疗，特别是与癌症的放射和/或化学治疗相关的损伤。
本发明还涉及一种通过应用上述热凝胶组合物治疗或保护粘膜或皮肤组织免受与抗癌治疗，特别是与癌症的放射和/或化学治疗相关的损伤的方法。
作为与癌症的放射治疗相关的损伤，可列举以下：口腔粘膜炎(头颈癌放射)、颈部上皮炎(头颈癌放射)、食管炎(肺部放射)、皮肤红斑(乳房放射)、肠炎(腹部放射)、阴道炎和阴道干燥(骨盆放射)、直肠炎(骨盆放射)、脱发(脑部放射)。
特别地，本发明涉及上述2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的热凝胶组合物，其用于治疗选自下组的损伤：颈部上皮炎、乳腺癌皮肤红斑和在照射脑部的情况下的脱发。
实施例
A-在溶液中氨磷汀向氨基硫醇的转化
实施例A-1：在1M盐酸或磷酸条件下
在1M盐酸或磷酸中制备350mg/ml的氨磷汀(从Shangai Boylechem Co.,Ltd购买的药品)溶液，并在50℃水浴中加热24小时。24小时后，用HPLC法分析溶液的组成。氨磷汀、氨基硫醇和二硫化物的面积百分比(％)在下表中给出。
Figure BDA0002078240850000061
Figure BDA0002078240850000071
氨磷汀在1M磷酸条件下的转化是完全的(并且在1M盐酸中几乎是完全的，几乎没有氨磷汀残留)，没有形成未知的杂质且仅有少量的二硫化物。
实施例A-2：在4M盐酸条件下
在4M盐酸中制备500mg/ml的氨磷汀溶液，并在50℃或60℃水浴中加热24小时。用HPLC方法，在1小时、3小时、6小时和24小时时分析溶液的组成。氨磷汀、氨基硫醇和二硫化物的面积百分比(％)在下表中给出。
Figure BDA0002078240850000072
氨磷汀在4M盐酸条件下的转化在50℃下6小时后完成，而在60℃下仅1小时，且没有未知杂质产生。
实施例A-3(对比)：在柠檬酸条件下
在1M柠檬酸(弱酸)中制备350mg/ml的氨磷汀溶液，并在50℃水浴中加热24小时。24小时后，用HPLC法分析溶液的组成。氨磷汀、氨基硫醇和二硫化物(WR-33278)的面积百分比(％)在下表中给出。
％氨磷汀 ％氨基硫醇 ％二硫化物 ％其它杂质
0.0％ 65.1％ 1.3％ 33.6％
氨磷汀在柠檬酸条件下转化完全，但由于形成大量新的未知杂质而不适于使用。
该对比实施例表明，使用非本发明强酸的柠檬酸不适于将氨磷汀转化为氨基硫醇。
实施例A-4(对比)：在乙酸条件下
在1M乙酸中制备350mg/ml的氨磷汀溶液，并在50℃水浴中加热24小时。24小时后，用HPLC法分析溶液的组成。氨磷汀、氨基硫醇和二硫化物的面积百分比(％)在下表中给出。
％氨磷汀 ％氨基硫醇 ％二硫化物 ％其它杂质
3.1％ 79.3％ 1.1％ 16.4％
氨磷汀在乙酸条件下的转化是不完全的，其保留未转化的残留氨磷汀。而且形成了大量新的未知杂质。
该对比实施例表明，使用非本发明强酸的乙酸不适于将氨磷汀转化为氨基硫醇。
B-冷冻干燥条件的实施例
实施例B-1：以1M盐酸为基质的冷冻干燥
根据实施例A-1，首先将氨磷汀溶液在1M盐酸中转化为氨基硫醇。转化后，将溶液在水中稀释，以得到50mg/ml的由氨基硫醇表示的最终溶液，将2ml分配在玻璃小瓶中以进行冻干。
冻干方案的实施例：
Figure BDA0002078240850000081
Figure BDA0002078240850000091
冷冻干燥后，所得块状物外观良好。为了重构，加入2ml含有泊洛沙姆407/188 19/6重量/重量的安慰剂凝胶，以得到50mg/ml的最终的氨基硫醇热敏凝胶，其胶凝温度在25℃和30℃之间。
实施例B-2：以4M盐酸和泊洛沙姆21/4为基质的冷冻干燥
首先，在60℃下，1小时内，将500mg/ml的氨磷汀溶液在4M盐酸中完全转化为氨基硫醇(根据实施例A-2)。转化后，将溶液稀释到泊洛沙姆P407/P188 21/4重量/重量中，以得到50mg/ml的由氨基硫醇表示的最终凝胶。然后将2ml分配到玻璃小瓶中以进行冻干。
冻干方案的实施例：
Figure BDA0002078240850000092
冷冻干燥后，所得块状物具有良好的外观。
为了重构，加入1.4ml水，以得到50mg/ml的WR-1065的最终热敏凝胶，其胶凝温度在28℃和30℃之间。
实施例B-3：以4M盐酸和泊洛沙姆18/6为基质的冷冻干燥
首先，在60℃下，1小时内，将500mg/ml的氨磷汀溶液在4M盐酸中完全转化为氨基硫醇(根据实施例A-2)。转化后，将溶液稀释到泊洛沙姆P407/P188 18/6重量/重量中，以得到50mg/ml的由氨基硫醇表示的最终凝胶。然后将2ml分配到玻璃小瓶中以进行冻干。
所用的冻干方案与上述实施例B-2相同。
冷冻干燥后，所得块状物具有良好的外观。
为了重构，加入1.4ml水，以得到50mg/ml的最终的氨基硫醇热敏凝胶，其胶凝温度在65℃和70℃之间。
实施例B-4：以1M盐酸和泊洛沙姆20/4为基质的冷冻干燥
首先，在60℃下，6小时内，将350mg/ml氨磷汀溶液在1M盐酸中完全转化为氨基硫醇。转化后，将溶液稀释到泊洛沙姆P407/P188 20/4重量/重量中，以得到50mg/ml的由氨基硫醇表示的最终凝胶。然后将2ml分配到玻璃小瓶中以进行冻干。
所用的冻干方案与上述实施例B-2相同。
冷冻干燥后，所得块状物具有良好的外观。
为了重构，加入1.5ml水，以得到50mg/ml的WR-1065的最终热敏凝胶，其胶凝温度在30℃和35℃之间。
实施例B-5：以1M盐酸和聚山梨醇酯80为基质的冷冻干燥
根据实施例A-1，首先将氨磷汀的溶液在1M盐酸中转化为氨基硫醇。转化后，将溶液稀释到含有0.2％作为冷冻保护剂的聚山梨醇酯80的水中，以得到50mg/ml的由氨基硫醇表示的最终溶液。将2ml分配在玻璃小瓶中以进行冻干。
所用的冻干方案与上述实施例B-2相同。
在冷冻干燥过程中，所得块状物已经坍塌，从而使块状物具有融化的外观。为了重构，加入2ml含有泊洛沙姆407/188 19/6重量/重量的安慰剂凝胶，以得到50mg/ml的最终的氨基硫醇热敏凝胶，其胶凝温度在25℃和30℃之间。
实施例B-6：以4M盐酸为基质的冷冻干燥
根据实施例A-2，首先将氨磷汀溶液在4M盐酸中完全转化为氨基硫醇。转化后，将溶液在水中稀释，以得到50mg/ml的由氨基硫醇表示的最终溶液，将2ml分配在玻璃小瓶中以进行冻干。
冻干方案的实施例：
Figure BDA0002078240850000111
在冷冻干燥过程中，所得块状物已经坍塌，从而使块状物具有融化的外观。
为了重构，加入2ml含有泊洛沙姆407/188 19/6重量/重量的安慰剂凝胶，以得到50mg/ml的最终的氨基硫醇热敏凝胶，其胶凝温度约为30℃。
实施例B-7：以4M盐酸和氢氧化钠为基质的冷冻干燥
根据实施例A-2，首先将氨磷汀的溶液在4M盐酸中完全转化为氨基硫醇。转化后，加入10M氢氧化钠将溶液的pH调节至pH＞6.0。然后，将调节后的溶液在水中稀释，以得到50mg/ml的由氨基硫醇表示的最终溶液，将2ml分配在玻璃小瓶中以进行冻干。
所用的冻干方案与上述实施例B-1相同。
在冷冻干燥过程中，所得块状物显著地坍塌，从而使块状物具有融化的外观。为了重构，加入2ml含有泊洛沙姆407/18819/6重量/重量的安慰剂凝胶，以得到50mg/ml的最终的氨基硫醇热敏凝胶，其胶凝温度约为30℃。
C-氨基硫醇凝胶的制备
实施例C-1：用泊洛沙姆凝胶重建冻干粉末，以得到50mg/ml的氨基硫醇凝胶
为了制备50mg/ml的氨基硫醇凝胶，向如实施例B-1(1M HCl于冻干基质中)或实施例B-5(1M HCl+PS80于冻干基质中)所述得到的冻干产物中加入2ml P407/P18819/6重量/重量。最终配制的凝胶具有25-30℃的胶凝温度。
实施例C-2：用泊洛沙姆凝胶重建冻干粉末，以得到50mg/ml的氨基硫醇凝胶
为了制备50mg/ml的氨基硫醇凝胶，向如实施例B-6(4M HCl于冻干基质中)或实施例B-7(4M HCl+NaOH于冻干基质中)所述得到的冻干产物中加入2ml P407/P18819/6重量/重量。最终配制的凝胶具有约30℃的胶凝温度。
实施例C-3：用水溶液重构冻干粉末，以得到50mg/ml的氨基硫醇凝胶
为了制备50mg/ml的氨基硫醇凝胶，向如实施例B-2所述得到的冷冻干燥粉末中加入1.4ml含有例如薄荷香料/苦味掩蔽剂/水4％/0.05％/95.95％重量/重量/重量的溶液。最终配制的凝胶具有约27℃-29℃的胶凝温度。
实施例C-4：用水溶液重构冻干粉末，以得到50mg/ml的氨基硫醇凝胶
为了制备50mg/ml的氨基硫醇凝胶，向如实施例B-4所述得到的冷冻干燥粉末中加入1.5ml水。最终配制的凝胶具有约30℃-35℃的胶凝温度。
实施例C-5：用水溶液重构冻干粉末，以得到50mg/ml的氨基硫醇凝胶
为了制备50mg/ml的氨基硫醇凝胶，向如实施例B-3所述得到的冷冻干燥粉末中加入1.4ml水。最终配制的凝胶具有约65℃-70℃的胶凝温度。
D-氨基硫醇(WR-1065)冻干粉末的稳定性
进行稳定性研究以比较以下稳定性：
-WR-1065，其通过在酸性条件下(分别为1M HCl或4M HCl)转化氨磷汀(350mg/ml或500mg/ml)，在水中或在P407/P188混合物中稀释，然后冻干(基于部分A和部分B中描述的实施例)而得到，和
-WR-1065盐酸盐结晶粉末。
稳定性通过分析在25℃/60％RH下在氩气环境下储存的样品来评价。氩气的目的是在相同的稳定条件下提供两种材料。
Figure BDA0002078240850000131
根据得到的稳定性结果：
-在25℃/60％RH下，1个月后，在所有测试的氨基硫醇制剂中检测到小于2％的杂质，并且该值保持稳定；以及
-在酸性条件下氨磷汀转化得到的冻干WR-1065与WR-1065盐酸盐具有相同的稳定性。
E-尝试开发稳定的氨磷汀活性代谢物凝胶治疗
实施例E-1：氨基硫醇的稳定化
最初，氨基硫醇热凝胶形成的可能性被评估，以得到在冷冻条件下至少具有6个月稳定性的稳定的即用型制剂。
氨基硫醇凝胶制剂在5℃或室温下储存时不稳定。在储存期间，氨基硫醇在氧化杂质(二硫化物WR-33278)中显着降解。
例如，在5℃下储存15天后，50mg/ml的氨基硫醇凝胶显示出二硫化物杂质从3.6％增加到13.8％(面积％)。
Figure BDA0002078240850000141
不同的参数被测试以提高氨基硫醇在溶液中的稳定性：
-防腐剂的添加剂，如抗氧化剂和/或螯合剂(焦亚硫酸钠，EDTA，酒石酸，柠檬酸，N-乙酰半胱氨酸，α-硫辛酸，盐酸半胱氨酸，抗坏血酸，二硫苏糖醇DTT)，
-氮气惰化，或
-药物浓度(50mg/ml，220mg/ml)。
例如，一个月后，在5℃±3℃下，在50mg/ml的氨基硫醇凝胶上进行稳定性研究。首先，通过转化在1M HCl中加热的350mg/ml的氨磷汀溶液制备氨基硫醇溶液(基于实施例A-1)。然后将溶液在不同的抗氧化剂溶液中以50mg/ml(以氨基硫醇表示)稀释，并在5℃±3℃下稳定。
Figure BDA0002078240850000151
无论测试的添加剂(抗氧化剂、螯合剂)如何，氨基硫醇溶液在5℃下都不够稳定，并且不能防止二硫键的形成。此外，N-乙酰半胱氨酸加速氨基硫醇的降解，产生一种重要的新杂质。因此，氨基硫醇稳定化的这种选择是不合适的。
其中，通过0.5％的DTT制剂得到了最好的稳定性。它在5℃下稳定至少一个月，但0.5％的DTT量不适于预期用途。
实施例E-2：氨磷汀快速转化为氨基硫醇
由于氨基硫醇不稳定，本发明人评估了开发氨磷汀的热凝胶的可能性，该热凝胶在给药前立即转化为氨基硫醇(WR-1065)。为了开发商业上合适的产品，目的是找到合适的条件，以在少于30分钟内得到完全转化(＞90％)。
在下列实验中，将氨磷汀结晶粉末加入到不同的安慰剂凝胶中，并测量转化为氨基硫醇WR-1065的转化率和产率。
不同的参数被测试：
-酸(盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、硫酸、高氯酸)，
-氨磷汀浓度(20-80mg/ml)，或
-温度(37℃或室温)。
例如，将氨磷汀结晶粉末以40mg/ml的浓度直接掺入安慰剂凝胶中，所述安慰剂凝胶包含14％w/w泊洛沙姆P407和26％w/w P188，以及15％或30％v/v 1M HCl的混合物。在37℃下30分钟后和在室温下30分钟至3小时监测转化率。
Figure BDA0002078240850000161
在室温或37℃下30分钟后，无论被测试的参数如何(所得的最大值为≈30％)，氨基硫醇的转化率都非常低。
实施例E-3：二硫化物快速转化为氨基硫醇
由于氨磷汀在30分钟内难以转化为氨基硫醇，因此制剂的另一种选择被评估，即在给药前将二硫化物WR-33278转化为氨基硫醇WR-1065。
在含有高二硫化物含量(37.7％面积)的凝胶制剂上测试二硫化物向氨基硫醇的转化。为了还原二硫键，强还原剂二硫苏糖醇(DTT)在不同浓度下被测试。
首先，通过转化在1M HCl中加热的350mg/ml氨磷汀溶液制备氨基硫醇溶液(基于实施例A-1)。然后将溶液以50mg/ml(以氨基硫醇表示)在水中稀释，并在室温下储存几天，以通过降解得到二硫化物的高形成率。几天后，DTT被最终加入凝胶中，该凝胶在室温下与DTT培养30分钟后进行分析。
加入DTT 30分钟后的纯度分布
Figure BDA0002078240850000171
通过使用DTT，二硫化物在室温下30分钟内可被显着还原为氨基硫醇，但所需DTT的浓度高于毒理学反应允许的量。
F-临床前评估根据本发明的预防放射相关口腔粘膜炎的含氨基硫醇的热凝胶
实施例F-1：用于功效研究的凝胶制剂的制备
如下所述，下列制剂用于功效研究。在功效研究的前一天制备制剂，在5℃下储存，并在给药当天进行分析。
考虑所用氨磷汀批料的纯度。对于氨基硫醇制剂，以mg/ml表示的浓度表示为氨磷汀的当量浓度。通过使用分子比，80mg/ml氨磷汀相当于50mg/ml氨基硫醇。
所有凝胶制剂都用亮蓝着色，以便更好地观察应用。
Figure BDA0002078240850000181
凝胶n°1具有与根据本发明的热凝胶组合物(对应于根据本发明的重构冻干物)相同的组成。
实施例F-2：实施例F-1的凝胶制剂的功效研究
本实施例的目的是，评估实施例F-1的含有氨磷汀的热凝胶组合物在体内抗放射性口腔粘膜炎的功效。
雌性C57BL/6小鼠(12周龄)购自Janvier CERT(Le Genest St.Isle，法国)在7天的适应时间后使用。他们可以自由地进食(SAFE reference R0340，Augy，法国)和饮水。它们被置于室温22℃±2℃和相对湿度55％±15％的明/暗循环下12小时。
用X-射线Varian NDI 226管(200kV，15mA，0.2mm Cu)以1.33Gy/min的剂量率进行局部辐射，身体的其余部分用铅屏蔽保护。当体重减轻超过初始体重的20％达24小时以上，或在临床征兆严重(伦理终点)的情况下，对小鼠实施安乐死。
下列实验通过使用口腔粘膜炎的模型进行，该模型在Mangoni,M.,Vozenin,M.C.,Biti,G.,and Deutsch,E.(2012).Normal tissues toxicities triggered by combinedanti-angiogenic and radiation therapies:hurdles might be ahead.Britishjournal of cancer,107,308-314.中描述。
两个参数被监测：体重和帕金森评分。这代表了由帕金森和共同工作者设计的随机评分系统，其具有通过肉眼观察评估的水肿和红斑的独立评分(帕金森,C.S.,Fowler,J.F.,and Yu,S.(1983).A murine model of lip epidermal/mucosal reactions to X-irradiation.Radiotherapy and oncology:Journal of the European Society forTherapeutic Radiology and Oncology 1,159-165)。实际上，唇部表皮/粘膜反应在高剂量照射下被观察，该反应在照射后大约5天开始，大约10-13天达到峰值。它们主要由水肿和红斑组成。帕金森评分表示水肿评分和红斑评分的总和。
如下计算帕金森评分："帕金森评分"＝水肿评分+红斑评分。
Figure BDA0002078240850000191
Figure BDA0002078240850000201
实验部分
将单剂量辐射递送至小鼠鼻口部。这诱导了唇部粘膜/表皮反应，该反应通过肉眼观察和评分监测。
进行盲试验以确定含或不含活性物质的凝胶对口腔粘膜炎的严重性和持续性的影响。三种凝胶被评估：安慰剂凝胶(凝胶n°3)，含有80mg/ml氨磷汀的凝胶(凝胶n°2)和含有50mg/ml氨磷汀硫醇(相当于80mg/ml氨磷汀)的凝胶(凝胶n°1)。小鼠在凝胶应用前10分钟被麻醉(腹膜内注射75mg/kg的氯胺酮+1mg/kg的盐酸美托咪啶)。将凝胶涂抹到口中(每面颊5μl)，并涂抹到唇部(40μl)。因此，50μl的总体积覆盖小鼠粘膜，相当于每只小鼠4mg氨磷汀。在使用20Gy单份(single fraction)应用凝胶30分钟后(剂量率1.33Gy/分钟)，照射小鼠鼻口部。在注射麻醉剂混合物后1小时注射阿替美唑盐酸盐。将这些小鼠与在照射前30分钟接受静脉内(IV)注射氨磷汀(每只小鼠4mg，即相当于静脉内注射200μg的20mg/ml氨磷汀溶液)的小鼠和仅接受20Gy局部照射的对照组小鼠进行比较。
总之，将30只小鼠分配到5组，然后照射：
-对照
-安慰剂凝胶
-氨磷汀凝胶(80mg/ml，4mg氨磷汀/小鼠)
-氨基硫醇凝胶(50mg/ml，对应于80mg/ml氨磷汀或4mg氨磷汀/小鼠)
-氨磷汀静脉内给药(IV)(20mg/ml，4mg氨磷汀/小鼠)
图1中显示了描述帕金森评分和体重随时间的演变的图。在图1中，曲线
Figure BDA0002078240850000202
对应对照，曲线(■)对应安慰剂凝胶，曲线(◆)对应氨磷汀凝胶，曲线(▲)对应氨磷汀硫醇凝胶，以及曲线(×)对应氨磷汀IV。
在腹侧位置以20Gy剂量照射小鼠鼻口部诱导了严重的表型，其特征在于显著的体重减轻和总体健康状态的恶化。所有对照小鼠必须在第14天和第20天之间处死。在安慰剂凝胶组中，因为它们必须稍早一点处死，小鼠表现出朝向甚至更差表型的趋势。平均存活时间分别为16天，与之相对的是，安慰剂凝胶和对照组为19天。然而，必须注意到，该差异不是统计学上显著的(对数-等级检验)。令人惊讶的是，由于小鼠随时间的推移表现出与对照组小鼠相似的表型，所以在凝胶中氨磷汀的存在对粘膜炎的发展和强度没有显著的影响。相反，静脉内注射氨磷汀导致中等强度的粘膜反应。一到照射后第20天，水肿和红斑就完全消失，并且该组没有观察到第二峰值(愈合期)(图1)。有趣的是，使用氨磷汀硫醇凝胶时，小鼠显示出中间表型。即使检测到已形成粘膜炎，在急性反应期间(第10至15天)，它们的体重也不会减轻。这些小鼠没有到达导致处死的终点，并且在实验结束时所有小鼠仍然存活，这与氨磷汀凝胶组的小鼠的命运形成了明显的对比。
对于氨磷汀凝胶组和氨磷汀硫醇凝胶组观察到的相反表型，以及当氨磷汀被包含在凝胶中并应用于鼻口部时，氨磷汀凝胶明显功效的缺乏提示它没有转化或没有有效地转化为氨磷汀硫醇。因此，游离的活性化合物氨磷汀硫醇必须直接递送以至少部分地预防放射性粘膜炎的发展。
实施例F-3：用于第二功效研究的凝胶制剂的制备
如下所述，下列制剂用于功效研究。在功效研究的前一天制备制剂，在5℃下储存，并在给药当天进行分析。
所用氨磷汀批料的纯度被考虑，以及以mg/ml表示的浓度表示为氨磷汀的当量浓度。
Figure BDA0002078240850000211
Figure BDA0002078240850000221
凝胶n°4、n°5和n°6具有与根据本发明的热凝胶组合物(对应于根据本发明的重构冻干物)相同的组成。
实施例F-4：实施例F-3的凝胶制剂的功效研究
第二功效实验的目的是，确认第一实验中关于氨磷汀硫醇对放射性粘膜炎的影响，并建立关于剂量-响应关系的数据。由于用含有80mg/ml氨磷汀(对应于50mg/ml氨磷汀硫醇)的凝胶观察到了中间效应，因此，令人感兴趣的是，测试更浓缩的凝胶以确定我们是否能够更彻底地改善口腔粘膜对电离放射的保护。
该实验用含有20、40或80mg/ml氨磷汀(分别对应于12.5、25或50mg/ml氨磷汀硫醇)的凝胶进行。将较低剂量的辐射(18Gy的单份辐射)递送到鼻口部，使所有小鼠可以保持存活直到实验结束。将不同量的化合物为小鼠给药(每只小鼠1、2或4mg)。
使用与实施例F-2相同的实验步骤。简言之，将小鼠麻醉，10分钟后，氨磷汀或氨磷汀硫醇被递送或不被递送取决于组(凝胶施用或静脉注射)，在给予氨磷汀或氨磷汀硫醇30分钟后，以18Gy剂量对小鼠进行背部照射，20分钟后将其唤醒。
将40小鼠分为6组：
-对照(小鼠n＝6)；
-安慰剂凝胶(小鼠n＝6)；
-氨磷汀硫醇20mg/ml凝胶(1mg氨磷汀/小鼠，小鼠n＝6)；
-氨磷汀硫醇40mg/ml凝胶(2mg氨磷汀/小鼠，小鼠n＝6)；
-氨磷汀硫醇80mg/ml凝胶(4mg氨磷汀/小鼠，小鼠n＝6)；以及
-氨磷汀静脉内给药(IV)(20mg/ml)(4mg氨磷汀/小鼠，小鼠n＝5)。
每组中，根据组评估5或6只小鼠的口腔粘膜炎的发展。18Gy的辐射剂量诱导的表型与在第一功效实验中使用的20Gy的辐射剂量相比是不太严重的。体重减轻是可控制的，并且所有小鼠在实验结束时仍然存活。
图2中显示了描述帕金森评分和体重随时间的演变的图。在图2中，曲线(◆)对应对照，曲线
Figure BDA0002078240850000231
对应安慰剂凝胶，曲线(▲)对应凝胶n°4，曲线(■)对应凝胶n°5，曲线(×)对应凝胶n°6，以及曲线(●)对应氨磷汀IV。
如预期的，在第13天，在对照组中，照射诱导粘膜反应的峰值，如图2所示。随后是从第18天延长到第30天的愈合期，如已在实施例F-2中由氨磷汀硫醇凝胶组所观察到的。对于氨磷汀IV组，在第12天也观察到粘膜反应的急性峰，但其强度低于由对照凝胶所观察到的(分别为2.2对3.6的评分)。如在实施例F-2中已经注意到的，在该组中愈合期几乎不存在。对于其它组，峰值评分为4.1、3.2、2.8和2.4分别对应安慰剂凝胶，以及20mg/ml、40mg/ml和80mg/ml氨磷汀凝胶(分别对应于12.5、25或50mg/ml氨磷汀硫醇)。在愈合期间，对照、安慰剂凝胶、20mg/kg和40mg/kg氨磷汀硫醇凝胶的曲线几乎不能彼此区分。20mg/kg的氨磷汀硫醇凝胶的施用没有改变粘膜炎峰的强度，并且在愈合期间记录的评分与对照组的评分相当。使用40mg/ml的氨磷汀硫醇凝胶，观察到粘膜炎峰强度的降低。这种情况在80mg/ml的氨磷汀硫醇凝胶中得到进一步增强，这也导致在愈合期间记录的评分降低。
实施例F-5：通过用水溶液重构冻干粉制备凝胶制剂用于第三功效研究
如下所述，使用下列制剂进行分级照射的功效研究。在功效研究的前一天重构冷冻干燥的热凝胶，在5℃下储存，并在给药当天分析。
考虑所用氨磷汀批料的纯度，以mg/ml表示的浓度表示为氨磷汀的当量浓度。
Figure BDA0002078240850000241
在重构后，根据本发明，最终制剂凝胶n°8和n°9具有与冻干前相同的组成。
实施例F-6：实施例F-5的凝胶制剂的功效研究
第三功效实验的目的是，确认第一实验中有关氨磷汀硫醇对放射性粘膜炎在一系列分级照射方案中的影响，以及使用重组冷冻干燥热凝胶的结果。
该实验用安慰剂凝胶和含有40mg/ml氨磷汀(对应于25mg/ml氨磷汀硫醇)的凝胶进行。四个8Gy的级分连续四天(从第0天到第3天每天；第0天对应于治疗的第1天)被递送到鼻口部。选择4个8Gy的级分的分级方案，因为它在生物学上等价于1个18Gy的级分(生物学有效剂量：BED～120Gy)。在每次照射级分之前，对小鼠施用相同量的化合物(相当于每只小鼠2mg氨磷汀)。因此，化合物被连续四天施用4次。
每天使用与实施例F-2类似的实验方法。简言之，将小鼠麻醉，10分钟后，氨磷汀或氨磷汀硫醇递送或不被递送取决于组(凝胶应用或静脉注射)，在给予氨磷汀或氨磷汀硫醇30分钟后，以8Gy剂量对小鼠进行背部照射，20分钟后将其唤醒。连续4天重复相同的实验步骤。
将24只小鼠分为4组：
-无凝胶照射(小鼠n＝6)；
-有氨磷汀硫醇凝胶(25mg/ml，对应于2mg氨磷汀或1.25mg氨磷汀硫醇/小鼠/天)照射(小鼠n＝6)；
-有安慰剂凝胶照射(小鼠n＝4)；
-静脉内注射氨磷汀(2mg氨磷汀/小鼠)照射(IV)(小鼠n＝6)。
每组中，从第3天至第60天，每天(6天/周)分析口腔粘膜炎和体重的发展变化。图3中显示了描述帕金森评分和体重随时间的演变的图。在图3中，曲线(◆)对应对照，曲线
Figure BDA0002078240850000251
对应安慰剂凝胶，曲线(▲)对应凝胶n°9，曲线(■)对应氨磷汀IV。
如在单一部分照射后已经观察到的，在对照组中，在第一部分照射后15天诱导粘膜反应的峰值。愈合期延长至照射后60天。在第12-16天可观察到明显的，且与粘膜炎的峰值相关的体重减轻。如所预期的，安慰剂凝胶在粘膜炎的发展、强度和持续时间方面没有显示出任何效果。对于氨磷汀IV组，在第15天左右也观察到粘膜反应的急性峰值，但其强度较低(氨磷汀IV组的评分为2.6，而对照组为6.4)，小鼠在第30天从粘膜炎中恢复。有趣的是，对于氨磷汀硫醇凝胶组，观察到与氨磷汀IV组相同的结果：峰值评分为2.6，并且在第30天后，小鼠没有显示出任何粘膜炎迹象。因此，局部施用氨磷汀硫醇凝胶保护了小鼠免受放射性粘膜炎。使用该凝胶，粘膜炎具有较低的强度和持续时间。
G-临床前评估根据本发明的含氨基硫醇的热凝胶对辐射相关皮肤红斑的预防
实施例G-1：通过用水溶液重构冻干粉制备凝胶制剂用于功效研究
如下所述，使用下列制剂进行分级照射的功效研究。在功效研究的前一天重建冷冻干燥的热凝胶，在5℃下储存，并在给药当天分析。
考虑所用氨磷汀批料的纯度，以mg/ml表示的浓度表示为氨磷汀的当量浓度。
Figure BDA0002078240850000261
在重构后，根据本发明，最终制剂凝胶n°10和n°11具有与冻干前相同的组成。
实施例G-2：实施例G-1的凝胶制剂的功效研究
本实施例的目的是评价实施例G-1的含有氨磷汀的热凝胶组合物在体内抗辐射诱导的皮肤红斑的功效。
雌性C57BL/6小鼠(12周龄)购自Janvier CERT(Le Genest St.Isle，法国)在7天的适应时间后使用。他们可以自由地进食(SAFE Reference R0340，Augy，法国)和饮水。它们被置于室温22℃±2℃和相对湿度55％±15％的明/暗循环下12小时。
用X-射线XRAD320管(320kV，12.5mA)以1.08Gy/min的剂量率进行局部辐射，身体的其余部分用铅屏蔽保护。只有小鼠背部的皮肤被照射。在临床征兆严重或实验结束(伦理终点)的情况下，当体重减轻超过初始体重的20％达24小时以上时，对小鼠实施安乐死。
在高剂量照射时，观察到表皮反应(红斑、脱皮、溃疡……)，其开始于照射后约15天，并在照射后约20天达到峰值。使用随机的评分系统来评估放射性皮肤红斑的发展。
计分量表
Figure BDA0002078240850000271
实验部分
该功效实验的目的是，评估在一系列分级照射方案中和使用重构的冷冻干燥热凝胶时，氨磷汀硫醇对放射性皮肤红斑的影响。
该实验用安慰剂凝胶和含有40mg/ml氨磷汀(对应于25mg/ml氨磷汀硫醇)的凝胶进行。四个12Gy的级分连续四天(从第1天到第4天每天；第1天对应于第一天的治疗)被递送到小鼠背部的皮肤。在每次照射级分之前，对小鼠施用相同量的化合物(相当于每只小鼠4mg氨磷汀)。因此，化合物被连续四天施用4次。
每天使用类似的实验程序。简言之，将小鼠麻醉，10分钟后，氨磷汀硫醇凝胶或安慰剂凝胶在小鼠背部的脱毛皮肤上直接施用或不施用取决于组(凝胶的最终体积＝100μl)。1小时后，用以水浸泡的敷布除去凝胶。然后以12Gy剂量照射小鼠，10分钟后将其唤醒。连续4天重复相同的实验步骤。
将10只小鼠分成3组：
-无凝胶照射(小鼠n＝4)；
-用氨磷汀硫醇凝胶(凝胶n°11)(25mg/ml，对应于4mg氨磷汀或2.5mg氨磷汀硫醇/小鼠/天)照射(小鼠n＝3)；
-用安慰剂凝胶(凝胶n°10)照射(n＝3小鼠)；
对于每组，从第3天到第50天，每天(6天/周)分析皮肤红斑和体重的发展。通过肉眼观察和评分监测表皮反应。图4中显示了描述红斑评分演变的图。对照组、安慰剂凝胶(凝胶n°10)组和凝胶n°11组的个体曲线分别描绘于图4A、4B和4C中。
在我们的实验中，照射小鼠皮肤诱导严重的脱皮，表皮反应在第20天左右达到峰值。脱皮到达平台，并且在观察期结束时脱皮仍然存在。在实验过程中没有观察到体重减轻。如所预期的，安慰剂凝胶在表皮反应的发展、强度和持续时间方面没有显示出任何效果。有趣的是，在用氨磷汀硫醇凝胶处理的小鼠组中，3只中的2只小鼠红斑的发展延迟，以及在该组中，一只小鼠从皮肤反应中痊愈，并且在第50天从红斑中恢复(在第50天的得分为0.5)。因此，局部应用氨磷汀硫醇凝胶看起来可以保护小鼠免受放射诱导的红斑。

Claims (16)

1.一种冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的制备方法，所述冻干2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇用于制备热凝胶组合物，所述方法包括以下步骤：
a)氨磷汀溶液与pKa等于或小于2.0的强酸反应，得到2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇溶液，
a1)通过加入包含至少一种泊洛沙姆的水溶液稀释2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液，和
b)将2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的溶液冻干，加入或不加入赋形剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中强酸选自：盐酸、磷酸、硫酸及其混合物。
3.根据权利要求2的所述方法，其中强酸为盐酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤a)在50℃和90℃之间的温度下进行。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤a)进行30分钟至24小时。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中氨磷汀的浓度在80mg/ml至500mg/ml之间。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中酸的摩尔浓度为1M至4M。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中氨磷汀的量与酸的量之间的摩尔比在1:0.5和1:3之间。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆选择为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188或其混合物。
10.一种2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的冻干物，其用于制备热凝胶组合物，所述2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的冻干物易于根据权利要求1-9中任一项所述的方法得到，所述冻干物包含至少一种泊洛沙姆。
11.根据权利要求10所述的冻干物，其中所述泊洛沙姆选择为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188或其混合物。
12.一种包含2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇的热凝胶组合物，其用于治疗或保护粘膜或皮肤组织免受与抗癌治疗有关的损伤，所述热凝胶进一步包含至少一种泊洛沙姆。
13.根据权利要求12所述的热凝胶组合物，其用于治疗或保护粘膜或皮肤组织免受与癌症的放射和/或化学治疗有关的损伤。
14.根据权利要求13所述的热凝胶组合物，其用于治疗辐射引起的口腔粘膜炎。
15.根据权利要求13所述的热凝胶组合物，其用于治疗辐射引起的皮肤红斑。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的热凝胶组合物，其中所述泊洛沙姆选择为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188或其混合物。
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