CN110295196A

CN110295196A - 一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用

Info

Publication number: CN110295196A
Application number: CN201910521066.8A
Authority: CN
Inventors: 郝碧芳; 陈凯; 黄金山; 沈兴家
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Dalian Orange Technology Co ltd
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2039-06-17
Also published as: CN110295196B

Abstract

本发明公开了一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用，该方法敲除家蚕核型多角体病毒的gp64基因，在此基础上回复截短了18个氨基酸的gp64基因，构建的重组病毒半数致死时间较对照延长了32小时，达到显著差异，但是重组病毒的一步生长曲线和对照没有显著差异。本发明制备用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒，可以有效延迟感染家蚕幼虫的死亡时间，不影响病毒的增值。本发明的重组杆状病毒为利用家蚕杆状病毒表达系统在虫体内制备外源蛋白提供了更长时间。本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。

Description

一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用

技术领域

本发明属于病毒学领域以及蛋白质表达系统领域，具体涉及一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用。

背景技术

杆状病毒是一类具有囊膜的双链DNA病毒，自然界中主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。自Smith等人首次利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)作载体成功表达人β-干扰素以来，至今已用杆状病毒表达的蛋白有千种(Acharya A,Sriram S&Saehrawat S.Bombyx mori nucleopolyhedrovirusmolecular biology and biotechnological applications for large-scale synthesisof recombinant proteins.Curr Sci 2002,83:455–465.)，目前应用的昆虫杆状病毒表达系统主要有AcMNPV和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)。由于杆状病毒具有强大多角体启动子及P10启动子，表达的外源蛋白具有较好的修饰加工，因此具有良好的生物学活性，而且其基因组可以插入较大片段外源DNA等特点，昆虫杆状病毒表达系统已被公认为是优良的真核表达系统。近年来，利用重组杆状病毒生产的药物及疫苗已经上市，例如利用杆状病毒表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(Cervarix^TM，葛兰素史克)，取得非常好的免疫效果。

BmNPV的宿主域较窄，仅感染家蚕这种昆虫。家蚕是重要的经济昆虫，家蚕在幼虫期体长和体重迅速增加，到5龄期是家蚕生长旺盛时期，日变化非常明显，体重每头可达5-7克，家蚕体积大，可以用来大量生产外源蛋白，但是蚕体感染核型多角体病毒后，由于核型多角体病毒发变快，致死率高，死亡时间短，导致病毒在蚕体内复制时间有限，如果虫体的死亡时间显著延后，这样为利用杆状病毒在蚕体内表达外源蛋白提供了更充足的宿主营养环境，可以产生更多的病毒及外源蛋白，为利用虫体生产外源蛋白表达量提供借鉴。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法，该方法可以有效的延长家蚕幼虫感染杆状病毒的死亡时间，但不影响病毒的复制，为利用家蚕幼虫生产外源蛋白提供了更长的时间。

本发明还提供一种用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒方法及其和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法，所述方法构建敲除家蚕核型多角体病毒gp64基因，在此基础上回复缺失了N端18个氨基酸的gp64基因，转染和感染家蚕细胞，收获病毒，注射家蚕幼虫，调查半数致死时间，能显著延长幼虫的死亡时间。

其中，所述在此基础上回复缺失了N端18个氨基酸的gp64基因为将gp64基因截短18个氨基酸，所述18个氨基酸其序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1:MLLVNQSYQGFDKKHTSE

其中，所述18个氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2:

atgctactagtaaatcagtcaacccaaggcttcgataagaaacacacaagcgag

本发明所述的用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建敲除gp64基因的重组Bacmid

以BmNPV的Bac-to-Bac系统BmBacJS13为基础，构建敲除gp64基因的重组Bacmid-BmBacΔgp64；

(2)在Bacmid-BmBacΔgp64的基础上构建回复截短了N端18个氨基酸的gp64基因(gp64M)的重组Bacmids；

根据BmNPV基因组中gp64序列设计引物，PCR扩增gp64M(gp64M为缺失18个氨基酸)片段，插入pFast-egfp载体，筛选重组转移载体pFast-egfp-gp64M；

将转移载体pFast-egfp-gp64M转化含有有Bacmid-BmBacΔgp64和辅助质粒(表达转座酶)的DH10B感受态细胞中；SOC培养基中37℃培养4h，然后在含有Kanamycin，Gentamicin和IPTG、X-gal的平板上筛选重组Bacmid，重组Bacmid经PCR进一步鉴定，命名为BmBacΔgp64-gp64M(简称vGP64M)；

(3)制备重组病毒

提取鉴定正确的重组Bacmid-BmBacΔgp64-gp64M DNA，转染BmN细胞，转染后收集上清，继续感染健康BmN细胞，大量扩增病毒，重组病毒命名为BmBacΔgp64-gp64M(简称vGP64M)，测定滴度，4℃避光保存备用。

制备的重组病毒一步法生长曲线的绘制：

相同感染复数的重组及对照病毒感染细胞，不同时间点取样，用终点稀释法测定样品的滴度，绘制一步生长曲线。

半数致死时间测定：

用相同剂量的重组病毒与对照病毒注射五龄第一天的家蚕，待蚕发病，开始统计家蚕的死亡个数，记录死亡时间，每8h统计一次，计算半数致死时间。

其中，步骤(2)所述pFast-egfp载体由pEGFP-N1(clotech公司)质粒上XhoI和XbaI(补平)酶切egfp基因，克隆入经XhoI和KpnI(补平)酶切的pFastBacDUAL(Invitrogen)，构建质粒pFast-egfp载体。

其中，步骤(3)所述引物为

SEQ ID NO.3：GP64M-F：GGCAGGCCTATGGTAGGCGCTATTGTTTTAT

SEQ ID NO.4：GP64M-R：GCGCTGCAGTTAATATTGTCTACTATTACGGTTTC。

本发明所述的用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒的制备方法所制备的重组杆状病毒。

所述重组杆状病毒的核苷酸序列为：家蚕核型多角体病毒基因组序列(NCBI登录号NC-001962)中的第101383到第101436个核苷酸序列缺失。

本发明所述的用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒在延迟感染家蚕幼虫的死亡时间，不影响病毒的增殖中的应用。

本发明所述的用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒在虫体内制备外源蛋白中的应用。

家蚕是重要的经济昆虫，家蚕在幼虫期体长和体重迅速增加，到5龄期，体重每头可达5-7克，可以用家蚕杆状病毒表达载体在家蚕幼虫体内大量生产外源蛋白。本发明一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法，具体步骤是敲除家蚕核型多角体病毒的gp64基因，在此基础上回复截短了18个氨基酸的gp64基因，构建的重组病毒半数致死时间较对照延长了32小时，达到显著差异，但是重组病毒的一步生长曲线和对照没有显著差异。本发明的公开为利用家蚕杆状病毒表达系统在虫体内制备外源蛋白提供了更长时间。

本发明涉及家蚕杆状病毒gp64基因N端54个核苷酸序列(18个氨基酸)，将这段序列缺失后，不影响病毒复制特性，但是可以显著延迟感染家蚕幼虫的死亡时间，可以为利用家蚕杆状病毒系统在虫体内生产外源蛋白做借鉴。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次公布了一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法，该方法构建的截短了gp64 N端18个氨基酸的重组家蚕核型多角体病毒较对照病毒能显著延长幼虫死亡时间，但是不影响病毒的增值，即病毒的一步生长曲线和对照无差别。家蚕幼虫体积大，虫体重，可以无菌饲养，广泛用来表达外源蛋白，本发明的延长家蚕感染核型多角体病毒的死亡时间，为利用杆状病毒表达系统在幼虫体内表达外源蛋白提供了更充足时间，为提高表达量作为借鉴。

本发明构建的重组病毒半数致死时间较对照延长了32小时，达到显著差异，但是重组病毒的一步生长曲线和对照没有显著差异。本发明公开为利用家蚕杆状病毒表达系统在虫体内制备外源蛋白提供了更长时间。本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。

附图说明

图1为利用本发明中所述方法构建的重组病毒和对照病毒一步生长曲线比较图；取10⁵的对数生长期的BmN细胞传代入6孔板(每个待测病毒3个重复)；贴壁后，用感染复数为5的vGP64M及对照vGP64，分别感染BmN细胞；感染1h后，去除感染液，用培养基清洗细胞两次，加入2mL的新鲜培养基，27℃培养箱中正常培养；以加入2mL的新鲜培养基的时间点定为0时，在0h，12h，24h，48h，72h，依次取出病毒样品60μl，4℃保存；取样结束后，对所有的时间点取样的病毒样品，进行滴度测定，绘制病毒的生长曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的穿梭载体Bacmid[Huang JS etal.Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx moriNucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3)：218-225]，储存于大肠杆菌DH10B中，用于以下本实施例所述方法。

以杆状病毒Bac-to-Bac(Bacmids)系统的pFastBacDual(Bac-to-Baculovirus Expression Systems,Invitrogen^TM)为基础，构建供体质粒。

从pEGFP-N1(clotech)质粒上XhoI和XbaI(补平)酶切egfp基因，克隆入经XhoI和KpnI(补平)酶切的pFastBacDUAL(Invitrogen)，常规分子生物学方法构建质粒，命名为pFast-egfp。

取0.2ug的pFast-egfp质粒DNA，转化含有家蚕杆状病毒Bacmid(BmBacJS13)及辅助质粒(表达转座酶)的DH10B感受态细胞，在含有卡那霉素、四环素、庆大霉素及IPTG和x-gal的平板上筛选白色菌落，进一步PCR鉴定，筛选正确重组Bacmid，命名为BmBacJS13-egfp(本实施例为了方便表示，简称为vGP64)，作为本专利中的对照病毒。

实施例2

1、构建敲除gp64基因的重组Bacmid-BmBacΔgp64

设计一对引物

SEQ ID NO.5：ΔGP64F：

5’-AACAAAAAAGCAATCTCATAACCACCATGGAGAACACCAAGTTTGGCGGCGCACCAATAACTGCCTTAA-3’

SEQ ID NO.6：ΔGP64R:5’-CTATACAATTTTTTTTATTACAAATAATGATACAATTTTTATTATTACATCTGTCCTTCCTGTGCGA-3’

以含有氯霉素抗性基因的质粒pBC-SK(SnapGene)为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离后，凝胶回收试剂盒回收PCR片段。

将过夜培养的含有BmBacJS13和pKD46(HOU Songwang,CHEN Xinwen,WANGHanzhong&HU Zhihong.An efficient method of constructing homologousrecombinant baculovirus with PCR-amplified fragments.SCIENCE IN CHINA(SeriesC),2003,46(4):431-437.Huang JS et al.Construction of the Bac-to-Bac System ofBombyx mori Nucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3)：218-225)的BW25113大肠杆菌，按体积比1:100转接于3ml无盐LB液体培养基中，30℃摇至菌液浓度为OD₆₀₀ 0.4-0.6时，加入L-阿拉伯糖，使为终浓度1mM，30℃诱导1h后放入预冷的4℃离心机中，4000rpm 5min，弃上清收集菌体沉淀，用10％甘油重悬菌体沉淀，4000rpm 5min，弃上清收集菌体沉淀，用100ul 10％甘油重悬菌体放置于电转杯中，并加入1ug上述回收的PCR片段，混合均匀，冰上放置5min复苏后，8000rpm 1min，弃上清大约剩余150ul，重悬后，涂布于Kana，Chl，Tet的平板上，37℃过夜培养。

将平板上长出来的菌稀释于20ul无菌水中，100℃煮5分钟，取5ul做为模板，进行PCR鉴定，筛选重组的Bacmid-BmBacΔgp64。

2、在BmBacΔgp64的基础上回复截短gp64基因的重组Bacmids

根据BmNPV gp64基因组序列设计一对引物，扩增缺失18个氨基酸的gp64片段(gp64M)：

SEQ ID NO.3：GP64M-F：GGCAGGCCTATGGTAGGCGCTATTGTTTTAT

SEQ ID NO.4：GP64M-R：GCGCTGCAGTTAATATTGTCTACTATTACGGTTTC。

1％的琼脂糖凝胶电泳之后胶回收获得目的基因，用StuΙ和PstΙ分别酶切gp64M和pFast-egfp，酶切之后进行胶回收，连接，构建重组质粒pFast-egfp-gp64M。

设计一对引物扩增gp64基因启动子：

SEQ ID NO.7：GP64P-F:GGCGTATACGACAGATATTTAAATAAGCCAAA

SEQ ID NO.8：GP64P-R:GGCAGGCCTTGAGGCATCTTATATACCCGA

PCR扩增该片段，1％的琼脂糖凝胶电泳之后胶回收获得目的基因，用Bst1107I和StuΙ酶切片段和pFast-egfp-gp64M，酶切之后进行胶回收，连接，构建重组质粒pFast-egfp-p-gp64M。

将0.2μg pFast-egfp-p-gp64M转移载体转化含有BmBacΔgp64和辅助质粒(转座酶)的DH10B感受态细胞。SOC培养基中37℃培养4h。然后在含有Kanamycin，Gentamicin和IPTG、X-gal的平板上筛选重组Bacmid。重组Bacmid经PCR进一步鉴定分析，命名为BmBacΔgp64-gp64M(本实施例为了方便表示，简称为vGP64M)。

3、制备重组病毒

提取重组Bacmid(即Bacmid-BmBacΔgp64-gp64M)及对照Bacmid(即Bacmid-BmBacJS13)的DNA，转染BmN细胞，转染后96h收集上清，继而感染BmN细胞大量扩增病毒，重组病毒命名为vGP64M，对照命名为vGP64，终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存备用。

实施例3

一步法生长曲线的绘制

取10⁵的对数生长期的BmN细胞传代入6孔板(每个待测病毒3个重复)。贴壁后，取上述两种病毒，vGP64M(实施例2)及对照vGP64(实施例1)，以感染复数5的剂量分别感染BmN细胞(加入病毒后，用新鲜培养基补足，确保总体积一致，减少误差)。感染1h后，去除感染液，用培养基清洗细胞两次，加入2mL的新鲜培养基，27℃培养箱中正常培养。以加入2mL的新鲜培养基的时间点定为0时，在0h，12h，24h，48h，72h依次取出病毒样品60μl，4℃保存。对所有的时间点取样的病毒样品，用终点稀释法测定滴度，绘制病毒的生长曲线，结果见图1，图1统计分析说明两种病毒的产量无明显差异。

实施例4

半数致死时间测定

取五龄第一天的家蚕，将vGP64M(实施例2)及对照vGP64(实施例1)分别按10⁴半数组织培养细胞感染剂量(取相应量病毒后，用新鲜培养基补足，确保总体积一致，减少误差)皮下注射家蚕，每种病毒注射100头，25℃正常培养，待蚕发病，开始统计家蚕的死亡个数及时间，每8h统计一次，计算半数致死时间，结果见表1。

表1

由表1结果可知，对照病毒半数致死时间为128小时，重组病毒的半数致死时间为160小时，重组病毒显著的延长了感染幼虫的死亡时间，死亡时间可以延长30多个小时，统计结果表明，两者有显著差异。

最后应当说明的是：以上所述的实施例和实施方式中所述构建重组病毒的方法，仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在分子生物学水平也可以利用其他重组方法截短gp64基因的18个氨基酸，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围，并被包括在本申请的精神和范围之内。

序列表

<110> 江苏科技大学

<120> 一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> gp64(N端18个氨基酸N端18个氨基酸)

<400> 1

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser Tyr Gln Gly Phe Asp Lys Lys His Thr

1 5 10 15

Ser Glu

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> gp64(N端18个氨基酸N端18个氨基酸)

<400> 2

atgctactag taaatcagtc aacccaaggc ttcgataaga aacacacaag cgag 54

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcaggccta tggtaggcgc tattgtttta t 31

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgctgcagt taatattgtc tactattacg gtttc 35

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacaaaaaag caatctcata accaccatgg agaacaccaa gtttggcggc gcaccaataa 60

ctgccttaa 69

<210> 6

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatacaatt ttttttatta caaataatga tacaattttt attattacat ctgtccttcc 60

tgtgcga 67

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcgtatacg acagatattt aaataagcca aa 32

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcaggcctt gaggcatctt atatacccga 30

Claims

1.一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法，其特征在于，所述方法首先构建敲除家蚕核型多角体病毒gp64基因，在此基础上回复缺失了N端18个氨基酸的gp64基因，转染和感染家蚕细胞，收获病毒，注射家蚕幼虫，调查半数致死时间，能显著延长幼虫的死亡时间。

2.根据权利要求1所述的延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法，其特征在于，所述在此基础上回复缺失了N端18个氨基酸的gp64基因为将gp64基因截短18个氨基酸，所述18个氨基酸其序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法，其特征在于，所述18个氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建敲除gp64基因的重组Bacmid

根据BmNPV基因组中gp64序列设计引物，PCR扩增gp64M片段，插入pFast-egfp载体，筛选重组转移载体pFast-egfp-gp64M；

将转移载体pFast-egfp-gp64M转化含有Bacmid-BmBacΔgp64和辅助质粒(表达转座酶)的DH10B感受态细胞中；然后筛选重组Bacmid，重组Bacmid经PCR进一步鉴定，命名为BmBacΔgp64-gp64M；

(3)制备重组病毒

提取鉴定正确的重组Bacmid-BmBacΔgp64-gp64M DNA，转染BmN细胞，转染后收集上清，继续感染健康BmN细胞，大量扩增病毒，重组病毒命名为BmBacΔgp64-gp64M，测定滴度，4℃避光保存备用。

5.根据权利要求4所述的用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述pFast-egfp载体优选由pEGFP-N1质粒上XhoI和XbaI(补平)酶切egfp基因，克隆入经XhoI和KpnI(补平)酶切的pFastBacDUAL，构建质粒pFast-egfp载体。

6.根据权利要求4所述的用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为

SEQ ID NO.3：GP64M-F：GGCAGGCCTATGGTAGGCGCTATTGTTTTAT

SEQ ID NO.4：GP64M-R：GCGCTGCAGTTAATATTGTCTACTATTACGGTTTC。

7.一种权利要求4所述的用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒的制备方法所制备的重组杆状病毒。

8.一种用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒在延迟感染家蚕幼虫的死亡时间，不影响病毒的增值中的应用。

9.一种用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒在虫体内制备外源蛋白中的应用。