CN110291188A - 组织类器官 - Google Patents

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Abstract

公开了用于监测和治疗疾病以及改善个体健康的生理学定制的组织类器官。

Description

组织类器官
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的授权号R01AR063630的政府支持下完成的。政府对本发明具有某些权利。
发明背景
发明领域
本公开涉及能够非侵入性地报告在个体中感测的生化信号和/或向个体提供治疗剂以监测和/或治疗疾病或改善个体的健康的基因工程组织类器官。
相关领域描述
肥胖和糖尿病是急性和不断增长的全球健康问题的实例，需要仔细监测和治疗干预(参见Ahima,R.S.Digging deeper into obesity,J Clin Invest 121,2076-2079,2011)。特别是糖尿病通常需要每日监测血糖水平。然而，这种持续的血液监测可能是不方便的、耗时的并且是疼痛的。
此外，存在许多其他疾病，例如苯丙酮尿症、物质成瘾和心脏病等表现出特定疾病相关指标或血液因子(例如氨基酸、非法化学品、蛋白质、脂质、酶、代谢物等)的血液浓度升高。然而，虽然某些疾病(例如糖尿病)可能需要持续的指标监测(即血糖水平)，但另一些疾病可能只需要定期监测，例如每周一次或每月一次，或者甚至可能只需要零星的按需监测。
血液因子监测的最新进展为个体(例如需要监测血糖水平的糖尿病患者)提供了改进的选择。例如，可植入葡萄糖监测器使糖尿病患者能够使用兼容的智能设备远程持续监测血糖水平。实际上，生物整合的传感器可以通过持续传输各种生物信号(包括电生理学、生理学和生物化学信息)来解决医学中的各种监测挑战(参见Kim等人Flexible andstretchable electronics for biointegrated devices.Annual review of biomedicalengineering 14,113-128,2012)。
与一些个体需要血液检测相伴随的是需要接受治疗剂来对抗导致疾病相关指标浓度升高的潜在疾病。例如，糖尿病患者通常需要胰岛素补充。胰岛素补充通常通过注射来自我实施，其类似于血液监测，可能是不方便的、难以记忆的、耗时且疼痛的。幸运的是，随着血液监测技术的进步，新的生物整合装置变得可用，其为需要定期自我实施监测和治疗剂施用的个体提供更大的便利。例如，组合了葡萄糖监测器和胰岛素泵的装置可用于持续监测葡萄糖水平并根据需要通过导管定期递送速效或短效胰岛素。此外，正在开发“智能胰岛素贴剂(smart insulin patche)”，其将覆盖有针的薄聚合物平台与活β细胞整合。
还有其他疾病，其中蛋白质或代谢物无功能或表达水平不足，但不提高特定的指示性疾病相关指标的浓度。例如，血友病A和血友病B是遗传疾病，其中个体分别表达不足量的凝血因子VIII和IX。然而，可以通过用可从人血液中获得或重组制备的那些来代替这些缺失的凝血因子来治疗血友病患者。
尽管使用新型纳米材料的生物整合装置设计和制造的进步极大地加速了用于体内(包括脑、心脏和皮肤)应用的开发(参见Kim等人和Choi等人Recent Advances inFlexible and Stretchable Bio-Electronic Devices Integrated withNanomaterials.Advanced materials 28,4203-4218,2016)，但是这些装置所需的生物力学接口仍然存在问题。例如，来自植入装置的稳定性、生物相容性和潜在感染在技术上仍然对该领域具有挑战性。此外，目前的生物整合装置需要更换电池和/或治疗剂储库，和/或一旦达到其使用寿命就必须自行更换。
鉴于前述内容，需要用于持续监测疾病状态和/或施用治疗剂且可为特定个体进行生理学定制的改进的、稳定的和永久的装置。
发明内容
本文提供了生理学定制的组织类器官及其用于监测和治疗疾病的方法。
在第一方面，本发明提供了生理学定制的组织类器官，其包括多个基因工程细胞，所述多个基因工程细胞包含至少一种编码报告分子的重组基因。所述报告分子在与预定血液因子结合和/或接触时产生可检测信号。在一个实施方案中，组织类器官包含从取自个体的细胞生长成的分层的皮肤移植物。在另一个实施方案中，组织类器官包含从胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、表皮干细胞或角质形成细胞生长成的培养的皮肤移植物。在一个实施方案中，当组织类器官被生物整合到个体中时，组织类器官表达与个体血液中血液因子的浓度成比例的报告分子。在另一些实施方案中，血液因子包含细胞、酶、蛋白质、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸、糖、脂质、代谢物、合成化合物、天然存在的化合物、矿物质、金属、细菌、病毒、朊病毒、疾病指示物或其组合。在一个实施方案中，生理学定制的组织类器官被生物整合到个体中。个体可以是动物。
在第二方面，本发明提供了生理学定制的组织类器官，其包含多个基因工程细胞，所述多个基因工程细胞包含至少一种编码治疗剂的重组基因。当将治疗剂施用于有需要的个体时，治疗剂改善个体的健康。在一个实施方案中，治疗剂包含酶、蛋白质、凝血因子、维生素、肽、脂质、毒素或其组合。在另一个实施方案中，治疗剂的表达可由诱导因子诱导。诱导因子可以是以下的一种或多种：热、冷、光、蛋白质、激素、脂质、化学物质、代谢变化、电势或电场及其组合。在一个实施方案中，当诱导治疗剂的表达时，治疗剂被释放到个体的循环中。在另一个实施方案中，生理学定制的组织类器官可以生物整合到个体中。个体可以是动物。预定血液因子可以是葡萄糖。
在第三方面，本发明提供了生理学定制的组织类器官，其包含多个基因工程细胞，所述多个基因工程细胞包含至少一种编码报告分子的重组基因和至少一种编码治疗剂的重组基因。治疗剂作为报告分子的表达的函数表达。
在第四方面，本发明提供了监测血液因子的方法，其包括：将根据前述方面或实施方案中任一项的组织类器官生物整合到个体中，以及检测由组织类器官响应于血液因子而表达的报告分子所产生的可检测信号。可检测信号与个体中血液因子的浓度成比例。在所述方法的一个实施方案中，组织类器官通过移植或手术植入生物整合到个体中。在所述方法的另一个实施方案中，可检测信号由荧光计、色度计、生物发光监测系统和具有适当电极的电系统中的一种或多种检测。
在第五方面，本发明提供了治疗有此需要的个体的疾病的方法。所述方法包括将根据前述方面或实施方案中任一项的组织类器官生物整合到个体中以及向个体施用治疗剂。在一个实施方案中，个体是人。
在第六方面，本发明提供了生理学定制的组织类器官，其包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因。治疗剂包含mGLP1和hBChE中的至少一种，并且当将治疗剂施用于有需要的个体时，治疗剂改善个体的健康。在一个实施方案中，治疗剂通过减少个体对尼古丁、酒精、可卡因和苯丙胺中的至少一种的寻求和/或消耗来改善个体的健康。
在第七方面，本发明提供了治疗有需要的个体的可卡因成瘾的方法，所述方法包括：使组织类器官与个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含hBChE。在一个实施方案中，将组织类器官移植到个体中。在一个实施方案中，hBChE组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。在一个实施方案中，hBChE的表达水解个体的血液中的可卡因。在一个实施方案中，hBChE的表达使得个体的可卡因寻求和/或消耗降低。
在第八方面，本发明提供了治疗有需要的个体的AUD的方法，所述方法包括：使组织类器官与个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含mGLP1或其类似物。在一个实施方案中，将组织类器官移植到个体中。在一个实施方案中，mGLP1或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。在一个实施方案中，mGLP1或其类似物的表达使得所述个体的酒精寻求和/或消耗降低。
在第九方面，本发明提供了治疗有需要的个体的尼古丁成瘾的方法，所述方法包括：使组织类器官与个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含mGLP1或其类似物。在一个实施方案中，将组织类器官移植到个体中。在一个实施方案中，mGLP1或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。在一个实施方案中，mGLP1或其类似物的表达使得所述个体的尼古丁寻求和/或消耗降低。
在第十方面，本发明提供了治疗有需要的个体的苯丙胺成瘾的方法，所述方法包括：使组织类器官与个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含mGLP1或其类似物。在一个实施方案中，将组织类器官移植到个体中。在一个实施方案中，mGLP1或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。在一个实施方案中，mGLP1的表达使得所述个体的苯丙胺寻求和/或消耗降低。
在第十一方面，本发明提供了治疗有需要的个体的肥胖的方法，所述方法包括：使组织类器官与个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含肽酪氨酸酪氨酸(PYY)或其类似物。在一个实施方案中，将组织类器官移植到个体中。在一个实施方案中，PYY或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。在一个实施方案中，PYY的表达使得所述个体的食物寻求和/或消耗降低。
在第十二方面，本发明提供了治疗有需要的个体的衰老效应的方法，所述方法包括使组织类器官与个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含金属蛋白酶组织抑制物2(TIMP2)或其类似物。在一个实施方案中，将组织类器官移植到个体中。在一个实施方案中，TIMP2或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。在一个实施方案中，TIMP2的表达使得个体衰老的负面影响降低。在一个实施方案中，衰老的负面影响包括记忆丧失、血管响应降低和/或免疫响应降低。
从以下结合所附权利要求的详细描述中，将更全面地理解本发明的这些和其他特征和优点。应注意，权利要求的范围由其中的叙述限定，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论限定。
附图说明
图1.利用免疫活性宿主的小鼠-小鼠皮肤基因转移模型的开发。图1A：皮肤基因转移策略的图。从患者的皮肤活组织检查中分离并培养原代表皮干细胞。用基因组编辑技术对细胞进行遗传修饰，将所得细胞用于产生皮肤类器官并移植到同一患者体内进行临床应用。图1B：用等基因皮肤类器官移植的免疫活性小鼠(CD1品系或C57BL/6J品系)的图像，具有(左侧两个图)或不具有(右图，直接移植)用于移植的皮肤圆顶室的辅助。活体成像显示移植之后表达萤光素酶(Luc)的移植细胞的有效并入。Ctrl：对照。图1C：将具有移植的表达H2B-RFP的角质形成细胞的CD1皮肤切片用DAPI染色。虚线表示真皮-表皮边界。箭头表示移植皮肤和宿主皮肤之间的边界。比例尺＝50μm。Epi：表皮，Der：真皮，HF：毛囊。图D-F：用所示的不同抗体对移植皮肤和相邻宿主皮肤的切片进行免疫染色(Krt14：角蛋白14，Krt10：角蛋白10，Lor：兜甲蛋白，β4：β4-整联蛋白，CD104)。比例尺＝50μm。图1G：用针对磷光体-组蛋白H3的抗体通过免疫组织学染色来确定和定量皮肤移植后一周或四周宿主或移植皮肤中表皮细胞的增殖。在皮肤移植后，观察到细胞增殖随时间显著降低，最可能是由于皮肤伤口愈合。移植皮肤和相邻宿主皮肤之间的细胞增殖没有显著变化(P>0.05)。误差棒代表s.d.(标准偏差)，除非另有说明。样本量(n)＝7(7代表从每组3只不同动物获得的切片)。
图2.用CRISPR改造皮肤表皮干细胞。图2A：显示用于表达葡萄糖传感器GGBP的Rosa26靶向策略的图。靶向载体包含两个Rosa26同源臂，其在通过组成型启动子UbiC(泛素C启动子)的GGBP表达盒和选择标记(嘌呤霉素抗性基因，Puro)的两侧。GGBP和Puro由自切割(self-cleavable)肽T2A分开。图2B：通过PCR(左图)和DNA印迹(右图)验证靶向载体整合到Rosa26基因座中。阳性克隆显示预期大小的额外带。图2C：通过荧光成像确认靶细胞中GGBP传感器的表达。比例尺＝20μm。图2D：将FRET比率图像伪彩色化，以证明工程细胞中葡萄糖依赖性比率变化。红色表示高(H)FRET效率，蓝色表示低(L)效率。M：中等FRET效率，相对于整个细胞的比率的积分用于定量FRET比率变化。图2E：在不同浓度的多种单糖或寡糖存在下测定GGBP报告物的FRET比率变化。注意：仅葡萄糖和半乳糖导致显著的FRET比率变化(P<0.01)。n>6(单个细胞)。图2F：FACS(荧光激活细胞分选)显示WT(野生型)和表达GGBP的表皮干细胞的类似细胞周期谱。PI：碘化丙锭。图2G：钙移动(calcium shift)后WT和表达GGBP的细胞中早期(Krt10)和晚期(兜甲蛋白)分化标志物表达的蛋白质印迹分析。通过光密度测定法测定带强度，并且定量诱导倍数。n＝4(4次独立测试)。P>0.05。图2H：测试WT细胞或GGBP细胞在软琼脂中的锚定非依赖性生长。注意：WT或GGBP细胞没有生长，但从皮肤SCC(鳞状细胞癌)分离的肿瘤起始细胞可以容易地在软琼脂板中产生集落。n＝3。P<0.01(在WT和SCC或GGBP和SCC之间)。
图3.用电穿孔转染体内皮肤细胞。图3A：用编码萤光素酶的质粒DNA对CD1小鼠进行皮内电穿孔。在处理后两天通过生物发光成像测定萤光素酶的表达。图3B：用编码tdTomato的质粒DNA对CD1小鼠进行皮内电穿孔。用双光子显微镜通过活体成像确定红色荧光蛋白的表达。箭头表示皮肤中表达tdTomato的细胞。
图4.在体内用GGBP报告物监测血糖水平的变化。图4A：由对照或产生GGBP的细胞开发皮肤类器官，并移植到CD1小鼠中。图4B：用IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)在移植动物中诱导葡萄糖波动。使FRET比率图像伪彩色化，以证明移植皮肤中葡萄糖依赖性比率变化。红色表示高FRET效率，蓝色表示低效率。图4C和4D：在IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)时FRET比率与血糖浓度的相关性。n＝9(在每个时间点来自9个不同视野的积分化FRET值)。图4E和4F：胰岛素注射用于在移植动物中诱导低血糖。用移植皮肤进行的活体成像显示GGBP报告物的FRET比率与血糖浓度之间的相关性。n＝9(在每个时间点来自9个不同视野的积分化FRET值)。图4G：通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定细胞培养基中GLP1的分泌。n＝3(3次独立测试)。P<0.01。图4H：从不同的细胞培养物中收集条件培养基并用于处理饥饿的胰岛素瘤细胞。通过ELISA测定体外胰岛素的分泌。n＝4(4次独立测试)。P<0.01。图4I：用HFD(高脂肪饮食)饲喂的对照和GLP1动物的图像。图4J：从～10周龄开始测量的不同群组小鼠的体重变化。注意HFD在对照小鼠中诱导显著的肥胖(P<0.01，用正常饮食或HFD饲喂8-10周的对照小鼠之间)，但GLP1的表达抑制体重增加(P<0.05，8-10周的GLP1/HFD和对照/HFD组之间)。n＝5(动物)。图4K：对照和GLP1小鼠中IPGTT之后FRET比率与血糖浓度随时间的相关性。n＝9(在每个时间点来自9个不同视野的积分化FRET值)。图4L和4M：对照(L)和GLP1(M)小鼠中血糖浓度与GGBP FRET变化的相关性。n＝9(在每个时间点来自9个不同视野的积分化FRET值)。
图5.用CRISPR在人表皮干细胞中表达GGBP报告物。图5A：移植有器官型人皮肤培养物的裸鼠的图像。活体成像显示表达萤光素酶的移植细胞的有效并入。图5B：用所示的不同抗体对移植皮肤和相邻宿主皮肤的切片进行免疫染色。比例尺＝50μm。图5C：通过DNA印迹验证靶向载体整合到AAVS1基因座中。阳性克隆显示预期大小的额外带。图5D：用IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)在移植动物中诱导葡萄糖波动。使FRET比率图像伪彩色化，以证明移植皮肤中葡萄糖依赖性比率的变化。红色表示高FRET效率，蓝色表示低效率。图5E和5F：在IPGTT时FRET比率与血糖浓度的相关性。n＝9(在每个时间点来自9个不同视野的积分化FRET值)。
图6.利用免疫活性宿主的小鼠-小鼠皮肤基因转移模型的开发。图6A：显示体外皮肤器官型培养的程序的图。将表皮祖细胞接种在脱细胞(acellularized)真皮的上部，然后暴露于空气/液体间期以诱导如体内皮肤表皮一样的分化和分层。图6B和6C：皮肤移植后一(B)或四(C)周的移植皮肤和相邻宿主皮肤的H/E(苏木精和伊红)染色。比例尺＝50μm。图6D：用针对活性胱天蛋白酶3的抗体进行免疫组织学染色来确定和定量皮肤移植后一周或四周的宿主或移植皮肤中的表皮细胞的凋亡。误差棒代表s.d.(标准偏差)，除非另有说明。n＝4(4次独立测试)。P>0.05。
图7.用CRISPR改造产生GGBP的皮肤表皮祖细胞。图7A：显示用于表达GGBP的Rosa26靶向策略的图。编码cas9的D10A突变体和靶向Rosa26基因座的两个gRNA的表达载体用于在染色体DNA中产生切割并增强GGBP靶向载体的整合。图7B：对照(Ctrl)和表达GGBP的细胞的细胞增殖。对所有细胞类型，定量细胞数目的增加，n＝3(4次独立测试)。对于ctrl和GGBP组之间的每个时间点，P>0.05。图7C：对照或GGBP靶向表皮祖细胞可以在体外产生类似的皮肤类器官。比例尺＝50μm。
图8.表达GGBP的细胞的体内移植。图8A-8C：用所示的不同抗体对移植皮肤切片进行免疫染色(Krt14：角蛋白14，Krt10：角蛋白10，Lor：兜甲蛋白，β4：β4-整联蛋白，CD104)。虚线表示真皮-表皮边界。Epi：表皮；Der：真皮。比例尺＝50μm。图8D：用针对磷光体磷光体-组蛋白H3的抗体通过免疫组织学染色来确定和定量对照或GGBP皮肤移植物中表皮细胞的增殖。n＝7(从每组2只动物获得7个切片)。P>0.05。图8E：用针对活性胱天蛋白酶3的抗体通过免疫组织学染色确定并定量皮肤移植后一周或四周的宿主或移植皮肤中的表皮细胞的凋亡。n＝6(从每组2只动物获得6个切片)。P>0.05。图8F：显示用于同时表达GGBP和GLP1的Rosa26靶向策略的图。GGBP和GLP1的编码序列通过IRES(内部核糖体进入位点)分开。
图9.利用CRISPR在人表皮祖细胞中表达GGBP。图9A：显示用于表达GGBP的AAVS1靶向策略的图。编码cas9的D10A突变体和靶向AAVS1基因座的两个gRNA的表达载体用于在染色体DNA中产生切割并增强GGBP靶向载体的整合。图9B：FACS(荧光激活细胞分选)显示在多西环素处理之前和之后WT(野生型)和表达GGBP的表皮祖细胞的类似细胞周期谱。PI：碘化丙锭。图9C：钙移动后表达WT和GGBP的细胞中早期(C)和晚期(D)分化标志物表达的蛋白质印迹分析。通过光密度测定法测定带强度，并且定量诱导倍数。Krt10：角蛋白10；Lor：兜甲蛋白。n＝4(4次独立测试)。P>0.05。图9D和图9E：用所示的不同的抗体对移植皮肤的切片进行免疫染色。比例尺＝50μm，图9F和9G：分别用针对磷光体-组蛋白H3和活性胱天蛋白酶3的抗体通过免疫组织学染色来确定和定量对照或GGBP皮肤移植物中表皮细胞的增殖和凋亡。对于增殖，n＝7(从每组2只动物获得7个切片)。P>0.05。对于凋亡，n＝6(从每组2只动物获得6个切片)。P>0.05。
图10.用CRISPR改造产生GLP1的皮肤表皮干细胞。图10A：显示用于表达GLP1的Rosa26靶向策略的图。靶向载体包含在GLP1表达盒两侧的两个Rosa26同源臂。四环素诱导表达盒通过组成型启动子UbiC(泛素C启动子)驱动Tet3G(四环素反式激活因子)蛋白和选择标记(嘌呤霉素抗性基因，Puro)的表达。Tet3G和Puro由自切割肽T2A分开。GLP1融合蛋白的表达由TRE(tet-on)启动子控制。在TRE启动子前面包括转录终止信号(ST)以消除GLP1的渗漏表达(leakage expression)。图10B：通过PCR(左图)和DNA印迹(右图)验证靶向载体整合到Rosa26基因座中。阳性克隆显示预期大小的额外带。图10C：在用不同量的多西环素(Doxy)刺激后，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)确定细胞培养基中GLP1的分泌。图10D：从不同的细胞培养物中收集条件培养基并用于处理饥饿的胰岛素瘤细胞。通过ELISA测定体外胰岛素的分泌。图10E：FACS(荧光激活细胞分选)显示在多西环素处理后WT(野生型)和表达GLP1的表皮干细胞的类似细胞周期谱。PI：碘化丙锭。图10F和10G：钙移动后WT和表达GLP1的细胞中早期(F)和晚期(G)分化标志物表达的蛋白质印迹分析。通过光密度测定法测定带强度，并且定量诱导倍数。Krt10：角蛋白10；Lor：兜甲蛋白。图10H：测试用或不用多西环素处理的WT细胞或GLP1细胞在软琼脂中的锚定非依赖性生长。注意到WT或GLP1细胞没有生长，但从皮肤SCC(鳞状细胞癌)分离的肿瘤起始细胞可以容易地在软琼脂平板中产生集落。
图11.通过小鼠-小鼠皮肤移植在体内稳定递送GLP1。图11A：移植有用表达GLP1的细胞产生的同基因皮肤类器官的免疫活性小鼠(CD1品系)的图像。在移植前用编码萤光素酶的慢病毒感染细胞，并且活体成像显示移植细胞的有效并入。图11B：移植的GLP1皮肤和作为对照(Ctrl)的相邻宿主皮肤的组织学检查。比例尺＝50μm。Epi：表皮，Der：真皮，HF：毛囊。图11C-11E：用所示的不同抗体对移植皮肤和相邻宿主皮肤(ctrl)的切片进行免疫染色(Krt14：角蛋白14，Krt10：角蛋白10，Lor：兜甲蛋白，β4：β4-整联蛋白，CD104)。比例尺＝50μm。图11F：由对照或产生GLP1的细胞开发皮肤类器官，并移植到CD1小鼠。通过ELISA测定血液中GLP1的水平。含有多西环素的食物可以激活体内GLP1分泌。图11G：用对照或GLP1皮肤类器官移植CD1小鼠，并且用或不用多西环素处理。在移植后16周通过ELISA测定血液中GLP1的存在。
图12.表皮干细胞中GLP1的表达改善体重和体内葡萄糖稳态。图12A：用常规饮食或HFD(高脂肪饮食)饲喂的对照和移植动物的图像。图12B：白色脂肪组织组织学检查的代表性图像。比例尺＝100μm。图12C：从～10周龄开始测量的不同群组小鼠的体重变化。注意HFD在对照小鼠中诱导显著的肥胖，但是通过多西环素刺激的GLP1表达抑制体重增加。图12D-12E：对照(D)和GLP1移植(E)动物的IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)。在用HFD饲喂的表达GLP1的小鼠中，腹膜内注射葡萄糖后作为时间的函数的血糖浓度显示出改善的葡萄糖耐量。图12F和12G：ITT(胰岛素耐量试验)。在表达GLP1的小鼠中，腹膜内注射胰岛素后作为时间的函数的葡萄糖浓度(初始值的百分比)谱显示胰岛素抗性降低。
图13.用CRISPR在人表皮干细胞中表达GLP1。图13A：移植有器官型人皮肤培养物的裸鼠的图像。活体成像显示移植后表达萤光素酶的移植细胞的有效并入。图13B：用所示的不同抗体对移植皮肤和相邻宿主皮肤的切片进行免疫染色。比例尺＝50μm。图13C：通过DNA印迹验证靶向载体整合到AAVS1基因座中。阳性克隆显示预期大小的额外带。图13D：在用不同浓度的多西环素(Doxy)刺激后，通过ELISA测定培养基中GLP1的分泌。图13E：从对照和表达GLP1的细胞收集条件培养基，在存在和不存在Doxy的情况下培养，并用于处理饥饿的胰岛素瘤细胞。通过ELISA测定体外胰岛素的分泌。图13F：从对照或产生GLP1的人细胞开发并移植到裸鼠的皮肤类器官的H&E染色。图13G：在来自用标准食物或含多西环素的食物饲喂以激活体内GLP1分泌的对照和移植的裸鼠的血液中，通过ELISA测定GLP-1的水平。
图14.用CRISPR改造产生GLP1的皮肤表皮祖细胞，图14A：对照(Ctrl)和表达GLP1的细胞的细胞增殖。对于所有细胞类型，定量细胞数目的倍数增加。图14B：对照或GLP1靶向表皮祖细胞可在体外产生类似的皮肤类器官。比例尺＝50μm。
图15.通过小鼠-小鼠皮肤移植在体内稳定递送GLP1。图15A：用针对磷光体-组蛋白H3的抗体通过免疫组织学染色来确定和定量对照或GLP1皮肤移植物中的表皮细胞的增殖。图15B：用针对活性胱天蛋白酶H3的抗体通过免疫组织学染色确定和定量皮肤移植后一周或四周的宿主或移植皮肤中的表皮细胞的凋亡。
图16.用CRISPR在人表皮祖细胞中表达GLP1。图16A：显示了用于表达GLP1的AAVS1靶向策略的图。编码cas9的D10A突变体和靶向AAVS1基因座的两个gRNA的表达载体用于在染色体DNA中产生切割并增强GLP1靶向载体的整合。图16B：FACS(荧光激活细胞分选)显示在多西环素处理之前和之后WT(野生型)和表达GLP1的表皮祖细胞的类似细胞周期谱。PI：碘化丙锭。图16C和16D：钙移动后WT和表达GLP1的细胞中早期(C)和晚期(D)分化标志物表达的蛋白质印迹分析。通过光密度测定法测定带强度，并且定量诱导倍数。Krt10：角蛋白10；Lor：兜甲蛋白。图16E：用针对磷光体-组蛋白H3的抗体通过免疫组织学染色来确定和定量对照或GLP1皮肤移植物中的表皮细胞的增殖。图16F和16G：用所示的不同抗体对移植的皮肤切片进行免疫染色。比例尺＝50μm。
图17.CPP装置。图17示出了三隔室CPP装置，其包括具有不同颜色和地板纹理的两大条件化(conditioning)隔室。如先前所述(Yan等人，2013)，CPP装置(Med Associates,E.Fairfield,VT,USA)由被小室(7.2×12.7×12.7cm)分隔的两个大室(16.8×12.7×12.7cm)组成。每个室具有视觉和触觉特性的独特组合(一个大室具有黑色壁和杆状地板，另一个大室具有白色壁和网状地板，而中间室具有灰色壁和实心灰色地板)。每个隔室具有嵌入透明的有机玻璃铰链盖的灯。通过光束中断测量在每个室中花费的时间并记录。通过在药物配对侧花费的时间减去在盐水配对侧花费的时间，在试验日确定CPP。
图18.表达hBChE的细胞的移植可以减弱由可卡因诱导的CPP获取(acquisition)和复现(reinstatement)。图18A：移植后，GhBChE(移植表达hBChE的细胞)和GWT(移植野生型细胞)小鼠进行预试验(pretest)(第1天)、可卡因条件化(conditioning)(第2天至第5天)和CPP表现试验(CPP expression test)(第6天)。数据代表平均值±SEM(每组中n＝9，处理×天相互作用：F1,16＝4.94，P<0.05)。图18B：移植后，GhBChE小鼠和GWT小鼠进行预试验(第1天)、乙醇条件化(第2天至第5天)和CPP试验(第6天)。数据表示平均值±SEM(每组中n＝8，处理×天相互作用：F1,17＝0.07，不显著)。与预试验相比，**P<0.01(Fisher t检验)。图18C：小鼠在预试验、可卡因条件化和试验后获得类似水平的可卡因CPP，并在第7天进行移植手术。在恢复10天后，GhBChE小鼠和GWT小鼠经历消退(extinction)直至第31天。在第32天的复现期间，给予GhBChE小鼠和GWT小鼠可卡因注射并再次测量CPP。数据显示平均值±SEM(每组中n＝8，处理×天相互作用：F3,42＝12.34，P<0.001)。18D：小鼠在第1天至第6天的预试验、乙醇条件化和试验后获得类似水平的乙醇CPP，并且经历消退直至第20天。在第21天复现期间，给予乙醇注射并记录CPP(平均值±SEM)(每组n＝8，处理×天相互作用：F3,42＝0.05，不显著)。与最后消退相比，*P<0.05(Fisher t检验)。
图19.通过基因组编辑在皮肤表皮干细胞中表达工程化hBChE。图19A：用于表达工程化hBChE的靶向策略。靶向载体包含两个Rosa26同源臂，其在通过组成型启动子UbiC(泛素C启动子)的hBChE表达盒和选择标记(嘌呤霉素抗性基因，Puro)的两侧。hBChE和Puro由自切割肽T2A分开。gRNA：指导RNA。图19B：通过PCR(左图)和DNA印迹(右图)验证靶向载体整合到Rosa26基因座中。阳性克隆显示预期大小的额外带。图19C：用不同抗体通过免疫印迹确认靶细胞中的hBChE表达。图19D：通过ELISA确认工程化hBChE分泌到培养基中。图19E：体外可卡因水解活性。从hBChE或mBChE靶向的细胞收集细胞培养上清液。通过体外清除测试检查可卡因水解活性。图19F：细胞周期谱。对照(Ctrl)和表达hBChE的表皮干细胞的FACS(荧光激活细胞分选)。PI：碘化丙锭。
图20.用CRISPR改造产生hBChE的皮肤表皮祖细胞。20A：对照(Ctrl)和表达的hBChE细胞的细胞增殖。对于所有细胞类型，定量细胞数目的倍数增加。图20B：钙移动后WT和表达hBChE的细胞中早期(Krt10：角蛋白10)和晚期(Lor：兜甲蛋白)分化标志物表达的蛋白质印迹分析。通过光密度测定法测定带强度，并且定量诱导倍数。20C：测试WT细胞或hBChE细胞在软琼脂中的锚定非依赖性生长。注意WT或hBChE细胞没有生长，但从皮肤SCC(鳞状细胞癌)分离的肿瘤起始细胞可以容易地在软琼脂平板中产生集落。
图21.通过小鼠-小鼠皮肤移植在体内稳定递送工程化hBChE。图21A：对照或hBChE靶向表皮祖细胞可在体外产生类似的皮肤类器官。比例尺＝50μm。图21B：从用对照(GWT)或hBChE皮肤类器官(GhBChE)移植的小鼠收集移植皮肤。用针对磷酸-组蛋白3的抗体通过免疫组织学染色来测定和定量细胞增殖。21C：用针对活性胱天蛋白酶3的抗体通过免疫组织学染色来测定和定量对照或hBChE皮肤移植物中的表皮细胞的凋亡。
图22.移植表达hBChE的细胞可保护免于可卡因过量。图22A：从对照或产生hBChE的细胞开发皮肤类器官，并移植到宿主小鼠。在移植之前用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒感染细胞以允许皮肤移植物的活体成像。图22B：从用对照(GWT)或hBChE皮肤类器官(GhBChE)移植的小鼠收集的移植皮肤的组织学检查。比例尺＝50μm。图22C：用所示的不同抗体对移植皮肤切片进行免疫染色(Krt10：角蛋白10，早期表皮分化的标志物，Lor：兜甲蛋白，早期表皮分化的标志物，β4：β4-整联蛋白，CD104，皮肤基底膜的标志物)。虚线表示皮肤的基底。Epi：表皮，Der：真皮。比例尺＝50μm。22D：用对照或hBChE皮肤类器官移植小鼠。在植入后通过ELISA测定血液中hBChE的存在10周(每组n＝5只小鼠)。图22E：在GhBGhE和GWT小鼠中注射40、80、120、160mg/kg可卡因后的致死率(每组n＝8)。图22F：在GhBChE小鼠和GWT小鼠中注射34、68、100、160、mg/kg METH(甲基苯丙胺)后的致死率(每组n＝8)。
图23.用CRISPR在人表皮干细胞中表达hBChE。图23A：用于表达工程化hBChE的AAVS1靶向策略。靶向载体包含两个AAVS1同源臂，其在通过组成型启动子UbiC(泛素C启动子)的hBChE表达盒和选择标记(嘌呤霉素抗性基因，Puro)的两侧。hBChE和Puro由自切割肽T2A分开。23B：通过DNA印迹验证靶向载体整合到AAVS1基因座中。阳性克隆显示预期大小的额外带。23C：用所示不同抗体通过免疫印迹在靶细胞中确认hBChE的表达。23D：通过ELISA确认培养基中工程化hBChE的分泌。图23E：用器官型人皮肤培养物移植的裸鼠的图像。活体成像显示植入后表达萤光素酶的移植细胞(右侧)或对照细胞(左侧)的有效并入。23F：用所示不同的抗体对移植的皮肤切片进行免疫染色。虚线表示皮肤的基底。比例尺＝50μm。23G：用对照或hBChE皮肤类器官移植小鼠。在植入后通过ELISA测定血液中hBChE的存在8周(每组n＝3只小鼠)。
图24.用CRISPR在人表皮祖细胞中表达hBChE。图24A：FACS(荧光激活细胞分选)显示对照(Ctrl)和/或表达hBChE的表皮干细胞的类似的细胞周期谱。PI：碘化丙锭。图24B：钙移动后WT和表达hBChE的细胞中早期(Krt10：角蛋白10)和晚期(兜甲蛋白)分化标志物表达的蛋白质印迹分析。通过光密度测定法测定带强度，并且定量诱导倍数。图24C：从用对照或hBChE皮肤类器官移植的小鼠收集移植的皮肤。通过用针对磷酸化-组蛋白3的抗体通过免疫组织学染色测定和定量细胞增殖。24D：用针对活性胱天蛋白酶3的抗体通过免疫组织学染色测定和定量对照或hBChE皮肤移植物中的表皮细胞的凋亡。
图25.用CRISPR改造产生mGLP1的皮肤表皮干细胞。CRISPR介导的小鼠表皮祖细胞中DlmGLP1的敲入和dox调节的mGLP1表达。图25A：靶向载体包含在编码mGLP1的dox反应性表达盒两侧的两个Rosa26同源臂。通过T2A肽连接的Tet3G(反式激活因子)和嘌呤霉素抗性(Puro)的表达受泛素C(Ubi)启动子控制。ST是提高TRE启动子特异性的信号。图25B：DlmGLP1敲入PCR和DNA印迹验证。图25C：GLP1小鼠血浆中Dox诱导的mGLP1表达。图25D：GLP1小鼠中的长期mGLP1表达。
图26.mGLP1在乙醇诱导的CPP上的表现。GLP1小鼠不表现出显著的乙醇诱导的CPP。在第1天的2次自由探索(预试验)后，分开的GLP1和GWT小鼠组(每组n＝9)在接下来的4天内每天2次接受交替的乙醇(2g/kg)和盐水腹膜内注射，如先前所述(Chen等人，DopamineD1and D3receptors are differentially involved in cue-elicited cocaineseeking.J.Neurochem.114,530-541(2010)；Kong等人，Activation of dopamineD3receptors inhibits reward-related learning induced by cocaine.Neurosci.176,152-161(2011))。在第6天测试CPP表现。结果表示在药物配对侧减去盐水配对侧花费的平均值±SEM时间。使用测试天数内的重复测量ANOVA作为组内因子，移植状态作为对象间因子(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。计算F值并进行Newman-Keuls事后检验(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。GLP1和WT小鼠在整个期间饲喂dox食物。
图27.利用CRISPR在人表皮祖细胞中表达蜘蛛来源的疼痛肽。图显示了用于通过蜘蛛来源的疼痛肽(毒素)DkTx(SEQ ID NO:36)或VaTx(SEQ ID NO:35)的皮肤表达来治疗酒精中毒的预期靶向载体。SP：信号肽；F：弗林蛋白酶切割位点；IgG-Fc：小鼠(SEQ ID NO:34)或人IgG-Fc(SEQ ID NO:39)片段。预期的VatX3和DkTx靶载体盒分别由SEQ ID NO:37和38表示。
图28.利用CRISPR在人表皮祖细胞中表达PAL。图中显示了用于通过PAL的皮肤表达来治疗PKU的预期靶向载体；SP：信号肽；PAL：PAL的编码序列。
图29.mGLP1在尼古丁诱导的CPP上的表现。图例：GLP1小鼠不表现出显著的尼古丁诱导的CPP。如先前所述(Chen等人，2010；Kong等人，2011)，在第1天的2次自由探索(预试验)后，分开的GLP1和GWT小鼠组(每组n＝7)在接下来的4天内每天2次接受交替的尼古丁(0.4mg/kg)和盐水腹膜内注射。在第6天测试CPP表现。结果表示在药物配对侧减去盐水配对侧花费的平均值±SEM时间。使用测试天数内的重复测量ANOVA作为组内因子，移植状态作为对象间因子(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。计算F值并进行Newman-Keuls事后检验(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。GLP1和WT小鼠在整个期间饲喂dox食物。
具体实施方式
出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体明确地并入本文。
在详细描述本发明之前，将对许多术语进行定义。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数指示物。例如，提及“一种代谢物”是指一种或多种代谢物。
应注意，诸如“优选地”、“通常地”和“典型地”的术语在本文中未用于限制所要求保护的发明的范围或暗示某些特征对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在强调在本发明的特定实施方案中可以使用或不使用的替代或附加特征。
出于描述和定义本发明的目的，应注意，如本文所使用的术语“基本上”表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表示的固有不确定度。术语“基本上”在本文中还用于表示在不导致所讨论主题的基本功能变化的情况下，定量表示可相对于所示参考的变化程度。
可以使用本领域技术人员公知的方法构建根据本发明的遗传表达构建体、靶向载体和基因工程细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术、聚合酶链反应(PCR)技术等。参见，例如以下中描述的技术：Green&Sambrook,2012,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork；Ausubel等人，1989,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,New York,以及PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications(Innis等人，1990,Academic Press,San Diego,CA)。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，指代包含DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸。
如本文所用，术语“基因工程”是指一种或多种细胞的遗传操作，从而一种或多种细胞的基因组已被至少一种DNA序列增强。候选DNA序列包括但不是限制于非天然存在的基因，通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序列，以及希望引入到一个或多个细胞的其他基因或DNA序列。应理解，通常通过稳定引入一个或多个重组基因来增强本文所述的基因工程细胞的基因组。通常，引入的DNA最初不存在于作为DNA接受者的基因工程细胞中，但在本公开的范围内包括从给定的基因工程细胞中分离DNA片段，并随后将该DNA的一个或多个额外拷贝引入到相同的基因工程细胞，例如以增强基因产物的产生或改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组、定点诱变和/或基因组编辑技术包括CRISPR(聚类规则间隔短回文重复序列)和/或哺乳动物转座子技术(例如piggyBacTM转座子)来修饰或甚至替换内源基因或DNA序列。在一些情况下，引入的DNA通过病毒载体(包括来源于逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的载体)导入接受者。在一些情况下，引入的DNA通过电穿孔直接引入接受者皮肤，而不进行皮肤干细胞分离、培养、CRISPR编辑或移植。
如本文所用，术语“重组基因”是指引入基因工程细胞的基因或DNA序列，无论相同或相似的基因或DNA序列是否已经存在于这样的宿主中。在这种情况下，“引入”或“增强”在本领域中已知意味着由人的手动引入或增强。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列，或者可以是源自或存在于相同物种中的DNA序列，但是已经通过形成基因工程细胞的方法引入细胞中。应当理解，引入细胞的重组基因可以与通常存在于被转化细胞中的DNA序列相同，并且被引入以提供DNA的一个或多个另外的拷贝，从而允许该DNA的基因产物的过表达或改变的表达。还可以用不同的驱动启动子或可以改变基因表达水平或模式的相关序列引入重组基因。所述重组基因特别由cDNA编码。还可以包括非编码序列，例如短发夹RNA、微小RNA或长非编码RNA。
还预期可以对重组基因进行密码子优化以通过提高特定基因的翻译效率来使基因工程细胞中的蛋白质表达最大化。例如，可以通过将一个物种的核苷酸序列转化为不同物种的遗传序列来实现密码子优化。优化的密码子有助于实现更快的翻译速率和更高的准确性。由于这些因素，预期翻译选择在高表达基因中更强。然而，虽然本文考虑了优化的密码子用于表达公开的蛋白质，但所有可能的密码子预期用于本文中用于编码任何公开的蛋白质的核酸。
如本文所用，术语“约”是指任何特定值的±10％。
如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述彼此组合或互斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以表示单独“x”、表示单独“y”、表示单独“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。
如本文所用，术语“血液因子”是指可在体内，例如在血液和/或淋巴系统中循环的任何特定疾病相关指示物或因子。例如，血液因子可以是，但不限于，细胞、酶、蛋白质、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸、糖、脂质、代谢物、合成化合物、天然存在的化合物、矿物质、金属、细菌、病毒、朊病毒、疾病指示物及其组合或变化。
如本文所用，术语“报告分子”是指可以通过基因工程宿主细胞生物合成产生的任何化合物。例如，报告分子可以是酶、蛋白质、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸、糖、脂质、代谢物、合成化合物、天然存在的化合物及其组合。在一个特定实例中，报告分子可以是荧光蛋白、基于运输的生物传感器和/或生物发光蛋白。
在一个实施方案中，报告分子可以诱导表达，例如当组织类器官感测到血液因子时。如本文其他地方所述，表达的诱导也可以通过施用诱导因子引起。当通过诱导表达时，报告分子浓度的增加用于通过产生可检测信号来“报告”所讨论的血液因子的存在。“报告”可以通过任何可检测的手段，例如发荧光、产生FRET信号、产生电信号和/或经历构象变化。
或者，报告分子可以组成型表达，但仅当报告分子产生的信号随报告分子对血液因子的感测而改变时才“报告”。在这种情况下，信号的变化(增加或减少)可以与血液因子浓度的增加成比例地相关联。
在一个实施方案中，靶向表达报告分子的组织类器官的外部测量装置可用于非侵入性地测量患者中血液因子的相对量。在一个实施方案中，预期报告分子可以直接或间接与血液因子结合或接触以产生可检测信号，该信号与个体中血液因子的浓度成比例。
如本文所用，术语“治疗剂”是指当施用于有需要的个体时改善个体健康的物质。例如，治疗剂可以是但不限于酶、蛋白质、凝血因子、维生素、肽、脂质、毒素、激素、多糖及其组合。在一个具体实例中，治疗剂可以是胰岛素或其类似物，当施用于有需要的个体时，其通过调节个体的血糖水平来改善个体的健康。在另一个具体实例中，治疗剂可以是激素，例如GLP1，当施用于有需要的个体时，其通过诱导个体的饱腹感反应(例如，帮助调节食物摄入量)来改善个体的健康。在另一个具体实例中，治疗剂可以是酶，例如苯丙氨酸羟化酶(PAH)，当施用于有需要的个体时，其通过降低患者血液中苯丙氨酸的浓度来改善个体的健康。此外，治疗剂可以是可以通过基因工程宿主细胞(例如表皮细胞)生物合成产生的任何化合物。治疗剂可包括来源于一种物种并且以天然和/或修饰形式施用于另一物种的蛋白质和其他物质。
如本文所用，术语“个体”是指任何动物。个体的实例包括人、驯养动物、家庭宠物和其他动物，但不限于此。个体的其他实例包括患有疾病的动物。
如本文所用，术语“生理学定制”是指其中已经产生个体生理学和/或免疫学相容的组织类器官的状态。例如，生理学定制的组织类器官可以是从个体自身细胞或生理上相容的细胞生长成的组织类器官，并且当个体的免疫系统暴露于组织类器官时，例如当组织类器官通过外科手术移植到个体中或个体上或以其他方式生物整合时，其不会触发个体的免疫响应。
如本文所用，术语“组织类器官”是指形成组织的细胞集合，其已经过遗传修饰并且可以通过手术移植或移植在体内生物整合(例如，在个体皮肤上)。例如，组织类器官可以是从基因工程干细胞或取自个体的角质形成细胞生长成的培养的分层的皮肤移植物。除了体外构建之外，设想了组织类器官可以在个体上原位构建。
可以将培养的皮肤移植物工程化以在预定条件下(例如响应于一种或多种血液因子的水平的存在、不存在或变化)表达一种或多种感兴趣的蛋白质或其他分子。感兴趣的蛋白质或其他分子可以是报告分子、治疗剂、诱导因子和/或可以通过基因工程宿主细胞生物合成产生的任何其他分子或化合物。
如本文所用，术语“诱导因子”是指物理刺激和/或化学刺激物，其诱导组织类器官内的一种或多种基因的表达和/或来自组织类器官的报告分子或治疗剂的活化和/或释放。诱导因子的非排他性实例可包括热、冷、光、蛋白质、肽、激素、脂质、化学物质、代谢变化、代谢物、电势或电场，及其组合。诱导因子的具体实例包括多西环素、报告分子和乙醇，还预期诱导因子可以剂量依赖性方式诱导报告分子或治疗剂的表达和/或释放。
在一个实施方案中，本公开内容涉及生理学定制的生物可整合的组织类器官，其可以监测个体中一种或多种血液因子的水平。可以将组织类器官移植或植入到个体上以提供对一种或多种血液因子的永久或临时(例如一、二、三、六、十二或六十个月或更长时间)的持续监测和/或治疗剂的来源。例如，组织类器官可以是从个体自身的表皮干细胞培养的完全分层的皮肤移植物，其通过外科手术移植到个体的皮肤上。一旦生物整合到患者的皮肤中，组织类器官形成患者皮肤的一部分，从而通过排除对于刺穿皮肤以监测血液因子浓度的需要来防止潜在的感染。此外，由于组织类器官源自患者自身的细胞，所以降低了宿主排斥组织类器官的风险。
当生物整合时，组织类器官像个体的任何其他组织一样被营养并且同时暴露于循环血液因子。在这种情况下，可以对组织类器官进行基因工程化以携带一种或多种稳定的遗传修饰(例如，基因组整合的修饰)，例如编码报告分子的一种或多种基因，所述报告分子在血液因子被组织类器官感测到或与组织类器官接触时表达。
在另一个实施方案中，报告分子可以在组织类器官内组成型表达，但仅在结合和/或接触预定血液因子时通过产生可检测信号(例如发荧光、产生FRET信号、产生电信号、生物发光、产生比色变化、经历构象变化)来“报告”。预期报告分子可直接或间接与血液因子结合或接触血液因子以产生可检测信号。针对组织类器官的外部测量装置可以用于非侵入性地测量患者中感测到的血液因子的相对量。在另一个实施方案中，预期由组织类器官产生的报告分子全身释放并且因此可以在身体的另一部分缺乏。
在一个具体实施方案中，预期的组织类器官是血糖监测器，其表达与个体的相对血糖浓度成比例的报告分子。例如，组织类器官可以表达与葡萄糖血液浓度成比例的荧光或生物发光报告蛋白。可以从外部测量报告蛋白的相对量，例如通过荧光计或比色计，并且因此可以确定血液因子的浓度。还预期报告分子和特定血液因子之间的反比关系是可能的，使得报告分子的相对量响应于血液因子浓度的增加而降低。
还预期组织类器官可产生报告分子，其可通过测量汗液、泪液、粘液、血浆、尿液、粪便或其组合中的报告分子来检测。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及生理学定制的生物整合组织类器官，其可以表达通过表皮/真皮屏障以到达循环并具有治疗效果的治疗剂。
在一个具体实施方案中，可以组成型地或通过向个体施用诱导因子来诱导组织类器官表达治疗剂。例如，组织类器官可以在用诱导因子(例如多西环素)刺激时以剂量依赖性方式表达GLP1。以这种方式，由组织类器官表达的治疗剂的量可以根据个体在特定时间的特定需要而定制。
在一个实施方案中，组织类器官表达报告分子和治疗剂二者。
遗传构建体
组织类器官可包含能够表达报告分子和/或治疗剂的基因工程细胞。编码报告分子和/或治疗剂的基因可以使用允许基因组编辑的任何技术(例如CRISPR)稳定地引入细胞的基因组中。然而，本文考虑了其他方法。当使用CRISPR用于基因工程细胞时，可以使用适合于基因组编辑的任何整合基因座。整合基因座的实例包括AAVSI(腺相关病毒整合位点1)、HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶-1)和/或人Rosa26基因座。HPRT1基因座的使用提供了以下优点：可以基于其对6-TG(2-氨基-6-癸嘌呤)的抗性来选择正确整合的细胞。此外，CRISPR靶向载体可以引入用于细胞选择的药物抗性基因(嘌呤霉素；“puro”)，其可能在体内引发免疫反应。如果发生这种情况，可以修饰靶向载体，使得puro编码序列两侧为两个LoxP位点。在选择靶向克隆后，可通过瞬时表达Cre重组酶在体外除去puro序列。
细胞选择和组织生长
可用于组织类器官构建的合适细胞包括表皮干细胞，例如从人皮肤分离的表皮干细胞。表皮干细胞的其他来源包括诱导的人多能干细胞。合适细胞的其他实例包括胚胎干细胞和人诱导多能干细胞。
一旦分离，可以用携带一种或多种报告分子编码基因和/或一种或多种治疗剂编码基因的靶向载体转染干细胞，并通过DNA印迹和其他可用方法选择靶向载体的正确整合。然后，当在脱细胞真皮上接种并暴露于细胞培养插入物内的空气/液体界面时，可以诱导正确整合的基因工程表皮干细胞分化以形成分层的皮肤组织。一旦移植物准备好，就可以利用良好建立的方案将其移植到供体患者身上。
移植
可以通过已知的外科手术(例如皮肤移植)将组织类器官植入个体的皮肤中。其他合适的程序包括将工程化的皮肤干细胞直接应用于患者皮肤。一旦植入，可以使组织类器官愈合并完全生物整合到个体的皮肤中。
报告分子检测
生物整合的组织类器官的报告分子的检测可以通过本领域已知的任何适于检测待测报告分子的方法进行。例如，荧光计和/或比色计可用于测量与报告分子表达相关的荧光、颜色或发光的变化。此外，可以使用生物发光监测系统(例如Xenogen)进行活体生物发光成像。可以用于测量报告分子的测量装置的其他实例包括具有适当电极的电系统。
组织类器官标准化
一旦组织类器官生物整合到个体中，例如，血糖监测组织类器官，就可以使类器官对血糖浓度的响应标准化，使得给定的报告响应指示特定的血糖浓度。这可以通过使用标准血糖仪测量不同的血糖浓度并将测量的特定浓度与每种浓度的相对报告分子信号相关联来实现。诸如标准化测试的一个实例是腹膜内葡萄糖耐量试验。可以对经工程化以检测其他特定血液因子的组织类器官进行类似的临床标准化技术。设想一旦组织类器官“读出”与血液因子浓度相关，则不需要进一步的直接血液测试。
治疗平台开发
本公开还涉及用于同时或根据需要治疗多种医学问题的组织类器官。例如，设想了生理学定制的生物可整合的组织类器官，其可以表达经设计用于满足个体的特定医学需求的一种或多种治疗剂，从而形成生物可整合的治疗平台。例如，治疗平台可以设计成根据个体的需要同时或在不同时间表达多种治疗剂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种治疗剂。例如，待由治疗平台表达的每种治疗剂可以单独地和分别地由诱导因子诱导，使得对于每种待表达的治疗剂，必须引入单独的诱导因子以引起治疗剂的表达。或者，可以有利地同时表达的治疗剂(例如2种或更多种治疗剂)可以各自由相同的诱导因子诱导。
此外，尽管本文描述的一些实施方案涉及用于治疗现有病、疾病和/或所需生理物质(例如，酶，蛋白质，凝血因子，在维生素，肽，脂质等)的缺乏或不存在的治疗剂的表达，还设想了在预期生理损伤或应激时表达治疗剂。例如，在预期暴露于有害化学物质时，可以诱导表达治疗剂以抵抗有害化学品或物质的作用的组织类器官来表达治疗剂。以这种方式，在个体遇到有害化学物质或物质之前已经在个体中表达了治疗剂。在另一个实例中，可以在预期失血、低氧环境和/或其他生理损伤时使组织类器官表达治疗剂。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及生理学定制的生物可整合的组织类器官，其可以表达具有多种治疗效果的治疗剂。例如，可以设计组织类器官以表达单一治疗剂，例如可用于对抗酒精滥用和尼古丁滥用两者的GLP1。
在一个特定的实施方案中，设想经设计用于表达GLP-1(抗醇和抗尼古丁治疗剂)和BChE(抗可卡因治疗剂)的组织类器官可以生物整合到具有药物滥用或具有复发风险的个体中，以同时消除或最小化酒精、尼古丁和可卡因的成瘾作用。
在另一些实施方案中，预期GLP-1类似物用于本文。例如，用于本文的预期类似物包括Exendin-4和基于Exendin的治疗剂(例如艾塞那肽和艾塞那肽LAR)、DPP-IV抗性GLP-1类似物(例如阿必鲁肽(albiglutide))、索马鲁肽(semaglutide)(NN9535)、利拉鲁肽(liraglutide)、他司鲁肽(taspoglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)(GLP-1Fc，)(LY2189265)及其衍生物(参见Gupta,V.Glucagon-like peptide-1analogues:Anoverview,Indian J Endocrinol Metab,17(3):413-421(2013))。
相关地，设想包含一种或多种诱导因子的药物组合物可以施用于个体以引起一种或多种可由施用的诱导因子诱导的治疗剂的表达。例如，药学上可接受形式的制剂(例如口服、肠胃外、吸入和/或局部药物)可以包含2种或更多种诱导因子，每种诱导因子对于由组织类器官表达的单独治疗剂是特异性的。以这种方式，可以设计表达多种治疗剂的组织类器官，并且可以获得定制的治疗剂表达。
在一个具体实例中，组织类器官可以生物整合到个体中，其中组织类器官被设计为表达5种不同的治疗剂TA1、TA2、TA3、TA4和TA5，每种由单独的诱导因子(分别为I1、I2、I3、I4和I5)诱导。当需要时，可以向个体施用包括例如引起治疗剂TA2、TA3和TA5表达的诱导因子I2、I3和I5在内的药物组合物。或者，可以向个体施用包括例如引起治疗剂TA1、TA2和TA4表达的诱导因子I1、I2和I4在内的药物组合物。设想了治疗剂诱导的多种变化而没有限制。此外，考虑了药物剂型的多种变体，例如立即释放、延迟释放和/或延长释放形式。以这种方式，特定的药物组合物可包含例如诱导因子I1、I2、I3、I4和I5，其中诱导因子I1和I5被配制用于立即释放，诱导因子I2和I3被配制用于延迟释放，并且诱导因子II4被配制用于延长释放。考虑了其他剂型，例如可植入的贮库。本文考虑了任何剂型或制剂中的任何诱导因子的组合，但不限于此。
还设想可以设计表达多种治疗剂的组织类器官，其中一种或多种治疗剂的表达是诱导型的，并且一种或多种治疗剂的表达是组成型的。
还设想可以培养包含多个转化细胞群的组织类器官，其中每个群被设计为表达与组织类器官内的其他群不同的治疗剂。设想了任何数量的单独的细胞群。
在以下实施例中将进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
以下实施例说明了本发明的具体实施方案及其各种用途。它们仅出于解释目的而提出，并不视为对本发明的限制。
实施例1：用表皮干细胞中CRISPR介导的基因组编辑开发用于血糖水平的内在皮肤传感器
引言
目前的整合生物传感器在稳定性、生物相容性和增加的感染风险方面表现出限制。克服这些限制的一种可能性是通过基因组编辑技术将一小部分内源组织转化为生物整合的持久的生理和生化信号传感器(参见Hsu等人Development and applications ofCRISPR-Cas9for genome engineering.Cell 157,1262-1278(2014)；Maeder等人Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy.Mol Ther 24,430-446(2016)；以及Wright等人Biology and Applications of CRISPR Systems:Harnessing Nature'sToolbox for Genome Engineering.Cell 164,29-44(2016))。在这方面，人皮肤和皮肤表皮干细胞(参见Blanpain等人Epidermal stem cells of the skin.Annu Rev Ceil DevBiol 22,339-373(2006)和Watt,F.M.Mammalian skin cell biology:at the interfacebetween laboratory and clinic.Science 346,937-940(2014))具有多个独特的优点，使得它们特别适用于基因工程和体内应用(图1A)。
分离和培养原代表皮干细胞的程序已经良好确立。可以诱导培养的表皮干细胞在体外分层和分化，并且表皮自体移植物的移植在体内是微创的、安全的和稳定的。自体皮肤移植物已被临床用于治疗烧伤几十年(参见Carsin,H.等人Cultured epithelialautografts in extensive bum coverage of severely traumatized patients:a fiveyear single-center experience with 30patients.Burns:journal of theInternational Society for Burn Injuries 26,379-387(2000)和Coleman等人Culturedepidermal autografts:a life-saving and skin-saving technique in children,Journal of pediatric surgery 27,1029-1032(1992))。在该实施例中，显示来源于基因组编辑的表皮干细胞的组织类器官可用于持续监测体内血糖水平。
实验程序
试剂和质粒DNA构建
豚鼠抗K5、兔抗K14、兔抗K10和兜甲蛋白抗体是洛克菲勒大学(RockefellerUniversity)的Elaine Fuchs博士的慷慨馈赠。大鼠单克隆β4-整联蛋白(CD104，BD553745)获自BD(Franklin lakes,NJ)。Ser10pho-组蛋白抗体获自EMD(06-570,Billerica,MA)。切割的胱天蛋白酶-3抗体获自Cell Signaling(#9661,Danvers,MA)。胰岛素ELISA试剂盒获自EMD Corp.(EZRMI-13K,Billerica,MA)。GLP-1ELISA试剂盒获自(RAB0201-1kt,St.Louis,MO)。除非另有说明，否则其他化学品或试剂均来自
先前已经描述编码萤光素酶(SEQ ID NO:1)和H2B-RFP(SEQ ID NO:2)的慢病毒载体(Liu等,2015；Yue,2016)。编码hCas9-D10A突变体的质粒是来自George Church的馈赠，获自Addgene(质粒#41816)。使用gBlock作为模板用以下引物构建编码gRNA表达盒的质粒：AAG GAA AAA AGC GGC CGC TGT ACA AAA AAG CAG G(SEQ ID NO:3)和gGA ATT CTA ATGCCA ACT TTG TAC(SEQ ID NO:4)。用以下引物构建Rosa26靶向gRNA：ACA CCG GCA GGC TTAAAG GCT AAC CG(SEQ ID NO:5)，AAA ACG GTT AGC CTT TAA GCC TGC CG(SEQ ID NO:6)，ACA CCG AGG ACA ACG CCC ACA CAC Cg(SEQ ID NO:7)，AAA ACG GTG TGT GGG CGT TGTCCT CG(SEQ ID NO:8)。用以下引物构建AAVS1靶向gRNA：ACA CCG TCA CCA ATC CTG TCCCTA GG(SEQ ID NO:9)，AAA ACC TAG GGA CAG GAT TGG TGA CG(SEQ ID NO:10)，ACA CCGCCC CAC AGT GGG GCC ACT AG(SEQ ID NO:11)，AAA ACT AGT GGC CCC ACT GTG GGG CG(SEQ ID NO:12)。用pRosa26-GT作为模板(来自Liqun Luo的馈赠，addgene质粒40025)使用以下引物构建Rosa26靶向载体：GAC TAG TGA ATT CGG ATC CTT AAT TAA GGC CTC CGCGCC GGG TTT TGG CG(SEQ ID NO:13)，GAC TAG TCC CGG GGG ATC CAC CGG TCA GGA ACAGGT GGT GGC GGC CC(SEQ ID NO:14)，CGG GAT CCA CCG GTG AGG GCA GAG GAA GCC TTCTAA C(SEQ ID NO:15)，TCC CCC GGG TAC AAA ATC AGA AGG ACA GGG AAG(SEQ ID NO:16)，GGA ATT CAA TAA AAT ATC TTT ATT TTC ATT ACA TC(SEQ ID NO:17)，CCT TAA TTAAGG ATC CAC GCG TGT TTA AAC ACC GGT TTT ACG AGG GTA GGA AGT GGT AC(SEQ ID NO:18)。用AAVS1hPGK-PuroR-pA供体(来自Rudolf Jaenisch的馈赠，addgene质粒22072)作为模板使用以下引物构建AAVS1靶向载体(SEQ ID NO:40)：CCC AAG CTT CTC GAG TTG GGGTTG CGC CTT TTC CAA G(SEQ ID NO:19)，CCC AAG CTT CCA TAG AGC CCA CCG CAT CCC C(SEQ ID NO:20)，CAG GGT CTA GAC GCC GGA TCC GGT ACC CTG TGC CTT CTA GTT GC(SEQID NO:21)，GGA TCC GGC GTC TAG ACC CTG GGG AGA GAG GTC GGT G(SEQ ID NO:22).CCGCTC GAG AAT AAA ATA TCT TTA TTT TCA TTA CAT C(SEQ ID NO:23)，GCT CTA GAC CAAGTG ACG ATC ACA GCG ATC(SEQ ID NO:24)。用于CRISPR介导的敲入的基因分型引物：GAGCTG GGA CCA CCT TAT ATT C(SEQ ID NO:25),GGT GCA TGA CCC GCA AG(SEQ ID NO:26),GAG AGA TGG CTC CAG GAA ATG(SEQ ID NO:27)。
小鼠和人原代角质形成细胞的培养
在通过分散酶过夜处理使表皮与真皮在前分离之后，使用胰蛋白酶从新生小鼠的表皮分离原代小鼠角质形成细胞。将角质形成细胞接种在经丝裂霉素C处理的3T3成纤维细胞饲养细胞上直至第3代。将细胞在补充有15％血清和终浓度为0.05mM Ca2+的E-培养基中培养。
从Thermo(C0015C)获得原代人新生儿表皮角质形成细胞，并使用制造商推荐的程序用培养基(Thermo Fischer,M-EPICF-500)培养。通过将培养基中的钙浓度增加至1.5mM来进行钙移动以诱导原代角质形成细胞的分化。
使用ATCC通用支原体检测试剂盒(目录号30-1012K)常规筛选细胞中支原体的存在。每6个月筛选一次细胞，并且任何支原体污染将导致细胞被丢弃并用之前的无支原体世代代替。
细胞周期分析：
使用碘化丙啶(PI)染色然后使用流式细胞术确定细胞周期谱的影响。将小鼠和人表皮细胞分别在两个6cm细胞培养皿中培养24小时。用胰蛋白酶处理细胞，从每个培养皿收集1×105个细胞，然后进行一次PBS洗涤。使用70％(v/v)冰冷乙醇进行细胞固定1小时。然后，将固定的细胞在4℃下以500g离心10分钟，然后用PBS洗涤两次。然后将细胞用100μLPBS中的75μg RNA酶A处理，并在37℃下孵育1小时。孵育后，通过在4℃下以500g离心10分钟收集细胞，然后进行另一次PBS洗涤。将细胞沉淀重悬于200μL PBS中，另外的PI溶液最终浓度为25ng/μL。染色后，立即使用流式细胞仪BD FACSCantoTM II(BD Biosciences,SanJose,CA)分析细胞，激发波长为488nm，发射为585nm。使用FlowJoTM软件版本10(FLOWJOLLC,OR)分析DNA含量和细胞周期分布的直方图。
蛋白质生化分析
如先前所述进行蛋白质印迹(Blanpain等人)。简单地说，将等量的细胞裂解物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上分离，并电印迹到硝酸纤维素膜上。将免疫印迹用封闭缓冲液(Li-Cor)在室温下孵育1小时，然后与一抗孵育过夜。将印迹用Tween 20/Tris缓冲盐水(TBST)洗涤三次，并在室温下用1:10000稀释的二抗孵育1小时。将印迹用TBST再洗涤三次。使用LI-COR扫描仪和软件(LI-COR Biosciences)进行可视化和定量。
皮肤类器官培养和移植
通过用EDTA处理新生小鼠皮肤制备脱细胞真皮(直径为1cm的圆形)(Maeder等人)。将含有1.5X106个培养的角质形成细胞的等分试样接种到细胞培养插入物中的真皮上。过夜附着后，将皮肤培养物暴露于空气/液体界面。
对于皮肤类器官的移植，将6-8周龄的CD1(同基因小鼠角质形成细胞移植)雄性或裸(人角质形成细胞移植)雌性麻醉。将内径为0.8cm且外径为1.5cm的硅胶室底部植入其剃毛的背部中线皮肤上，所述背部中线皮肤用于保持皮肤移植物。在植入一片移植物之后立即安装室盖以密封室。大约一周后，移除室盖以使移植物暴露于空气中。腹膜内施用单剂量的0.2mgα-CD4(GK1.5)和0.2mgα-CD8(2.43.1)抗体用于皮肤移植。
高脂肪饮食诱导的肥胖和葡萄糖耐量试验
将具有皮肤移植物的雄性CD-1小鼠饲养(每笼5只，～8周龄)在中央控制空气、湿度和温度的动物设施中。向这些小鼠饲喂常规饲料(regular chow)或购自Bio-Serv(Frenchtown,NJ)的HFD(60％kcal来自脂肪，20％来自碳水化合物，20％来自蛋白质)。每两周测量体重和食物摄入量。
对于葡萄糖耐量试验，对用HFD饲喂10周的小鼠进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。在试验前使小鼠禁食6小时。向动物注射溶解在盐水中的葡萄糖(1g/kg葡萄糖/体重，腹膜内)，并使用葡萄糖测试条和葡萄糖计在0、10、20、30、60和90分钟测量血糖。
为了诱导低血糖，使具有皮肤移植物的CD1小鼠禁食4小时并且用购自Sigma(St.Louis,MO)的胰岛素注射(2U/kg，腹膜内)。此后在0、15、30、45和60分钟测定血糖水平。
小鼠的活体成像
在芝加哥大学(University of Chicago)的综合小动物成像研究资源(integrated small animal imaging research resource，iSAIRR)中进行光学成像。在向动物注射萤光素(100mg/kg)后，在IVIS Spectrum(Caliper LifeAlameda,CA)上采集生物发光图像。使用Living Image4.3.1软件进行采集和图像分析。
在芝加哥大学的光学显微镜中心，用多光子显微镜对移植皮肤中的伤口愈合进行成像。用Image J软件分析图像。
组织学和免疫荧光
将皮肤或伤口样品包埋在OCT中，冷冻，切片并在4％甲醛中固定。对于石蜡切片，将样品在4℃在4％甲醛中孵育过夜，用一系列递增浓度的乙醇和二甲苯脱水，然后包埋在石蜡中。将石蜡切片在降低浓度的乙醇中再水化，并在10mM柠檬酸盐(pH 6.0)中进行抗原暴露。如Wright等人所述对切片进行苏木精和伊红染色或免疫荧光染色。除非另有说明，否则根据制造商的说明稀释抗体。
统计分析
使用Excel或OriginLab软件进行统计分析。箱形图用于描述整个群体而不假设统计分布。Student t检验用于评估两个实验条件之间差异的统计显著性(P值)(除非另有说明，否则为2尾分布)。除非另有说明，否则所有实验重复至少三次。对于所有图，统计测试是合理的并且符合测试的假设。进行统计比较的不同测试组之间的差异是相似的。
对于所有实验，根据我们的初步测试和先前的研究选择样本大小。对于所有体外分析，没有样品排除。对于体内实验，排除在实验结束前死亡的动物。排除标准是预先确定的。本研究中未使用随机化或盲法。
结果和讨论
尽管有潜在的临床应用，但由于缺乏合适的模型，皮肤表皮干细胞的研究受到很大阻碍。尽管已经显示小鼠皮肤或人皮肤可以移植到免疫缺陷小鼠上，但是该模型中缺乏完整的免疫系统预示着该程序在体内的潜在结果预测。工程细胞的免疫清除一直是体细胞基因治疗的主要并发症(参见Collins,M.&Thrasher,A.Gene therapy:progress and predictions.Proceedings.Biological sciences/The Royal Society 282(2015))。另外，用小鼠表皮干细胞进行皮肤类器官培养并产生用于移植的小鼠皮肤替代物仍然在技术上具有挑战性。为了解决这些问题，通过在脱细胞小鼠真皮的上部培养细胞，开发了利用体外小鼠表皮干细胞的新器官型培养模型(图6A)(参见Liu,H等人Regulation of FocalAdhesion Dynamics and Cell Motility by the EB2and Hax1Protein Complex.J BiolChem 290,30771-30782(2015)以及Yue,J.等人In vivo epidermal migration requiresfocal adhesion targeting of ACF7.Nat Commun 7,11692(2016)。
组织类器官
暴露于空气/液体界面可以诱导培养的表皮细胞分层，从而在体外产生皮肤样类器官。将这种培养的皮肤类器官移植到裸宿主中导致有效的皮肤移植(参见Liu,H等人，2015和Yue,J等人，2016)。使用改进的外科手术和皮肤移植物维持方案，实现了将同基因小鼠皮肤替代物移植到具有或不具有用于皮肤移植的硅树脂圆顶室的免疫活性宿主(CD1和C57BL/6J品系)(图1B以及图6B和6C)。
在免疫活性宿主中的移植细胞容易地表达外源基因例如萤光素酶和组蛋白H2B-RFP(图1B-C)，将该外源基因用慢病毒转导至细胞。当对基础表皮干细胞(角蛋白14)或早期(角蛋白10)和晚期(兜甲蛋白)皮肤分化标志物进行染色时，移植组织表现出正常的皮肤分层(图1D-F)。另外，与相邻宿主皮肤相比，皮肤移植物显示出类似的细胞增殖和细胞死亡(图1G和图6D)。重要的是，如通过活体生物发光成像和组织组织学所测定，具有外源基因(例如萤光素酶和H2B-RFP)表达的组织类器官在免疫活性宿主体内稳定超过5个月。总之，这些结果表明组织类器官是表皮干细胞工程和移植的新模型，强烈暗示遗传修饰的皮肤表皮细胞在体内不具有免疫原性和良好耐受性。
工程化血糖监测器
用于非侵入性监测体内血糖水平的生物整合传感器可以消除糖尿病患者一天多次抽血的需要。另外，持续监测葡萄糖允许患者根据当前葡萄糖值通过改变胰岛素剂量或饮食来更好地维持血糖水平。目前，大多数持续葡萄糖监测传感器是植入皮下的酶电极或微透析探针。这些传感器通常需要氧来进行活动，在体内不够稳定并且在低葡萄糖条件下不准确。组织中干扰电活性物质的存在也会导致体内响应减弱和信号漂移，这需要频繁校准当前的传感器。皮肤中基于荧光的葡萄糖传感器可能更稳定，具有提高的灵敏度，并解决了来自组织的电化学干扰问题(参见Pickup等人Fluorescence-based glucosesensors.Biosensors&bioelectronics 20,2555-2565(2005))。
为了设计用于葡萄糖感测的表皮干细胞，检查了糖结合蛋白质、葡萄糖/半乳糖结合蛋白质(GGBP)的细胞内表达(Jeffery,C.J.Engineering periplasmic ligand bindingproteins as glucose nanosensors.Nano reviews 2,2011)。GGBP在大肠杆菌的周质内转运葡萄糖，并且与葡萄糖的结合可导致蛋白质的大的构象变化(Jeffery，2011)。GGBP的这种特性已被用于开发基于葡萄糖的FRET(荧光共振能量转移)或生物发光成像的蛋白质传感器(参见Fehr等人，In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in thecytosol of COS-7cells by fluorescent nanosensors,J Biol Chem 278,19127-19133,(2003)；Saxl等人A fluorescence lifetime-based fibre-optic glucose sensor usinggiucose/galactose-binding protein.The Analyst 136,968-972(2011)；TeasleyHamorsky等人A bioluminescent molecular switch for glucose.Angewandte Chemie47,3718-3721(2008)；Tian等人Structure-based design of robust glucosebiosensors using a Thermotoga maritima periplasmic glucose-bindingprotein.Protein science:a publication of the Protein Society 16,2240-225(2007)以及Veetil等人A glucose sensor protein for continuous glucosemonitoring.Biosensors&bioelectronics26,1650-1655(2010)。WT(野生型)GGBP具有非常高的葡萄糖结合亲和力(Kd＝0.2μm)。为了产生对应于生理学相关葡萄糖范围的探针，通过小鼠表皮干细胞中的CRISPR介导的基因组编辑设计了具有GGBP的A213R/L238S双突变体的CFP/YFP FRET传感器(SEQ ID NO:28)(Kd＝10mM)(Amiss,T.J.,Sherman,D.B.,Nycz,C.M.,Andaluz,S.A.&Pitner,J.B.Engineering and rapid selection of a low-affinityglucose/galactose-binding protein for a glucose biosensor.Protein science:apublication of the Protein Society 16,2350-2359)。开发了编码Cas9(CRISPR相关蛋白9)的D10A突变体的DNA载体(Ran,F.A.等人Double nicking by RNA-guided CRISPRCas9for enhanced genome editing specificity.Cell 154,1380-1389(2013)(SEQ IDNO:29)、靶向小鼠Rosa26基因座的两个gRNA(指导RNA)(SEG ID NO:30)(SEG ID NO:31)以及Rosa26靶向载体(SEG ID NO:32)。靶向载体包含在编码GGBP融合蛋白的表达盒的两侧的两个Rosa26基因座的同源臂(图2A和图7A)(SEG ID NO:33)。
从CD1新生小鼠分离原代表皮角质形成细胞，并用Rosa26靶向载体与编码Cas9和Rosa26特异性gRNA的质粒一起进行电穿孔。在选择时分离克隆，并通过PCR筛选和DNA印迹分析确认与Rosa26基因座的正确整合(图2B)。工程化表皮细胞在细胞溶质中表现出GGBP融合蛋白的强烈表达(图2C)。
为了测试皮内电穿孔是否也是引入报告物的有效手段，用编码萤光素酶和tdTomato的质粒DNA对CD1小鼠进行皮内电穿孔，并分别通过生物发光成像(图3A)和利用双光子显微镜的活体成像(图3B)两者分析表达。电穿孔导致萤光素酶和tdTomato两者的表达。
为了在体外测试葡萄糖感测，将细胞暴露于含有增加量的葡萄糖的培养基中。通过显微镜成像的FRET比率的定量显示FRET比率与0-10mM范围的细胞外葡萄糖浓度的极好相关性(图2D)。进一步分析显示GGBP报告物对细胞外葡萄糖或半乳糖有响应，但对其他糖类例如蔗糖、果糖或核糖没有响应(图2E)。细胞内GGBP探针对葡萄糖浓度的变化迅速响应。更换培养基后30秒内FRET比率发生变化，并在同一培养基中保持稳定。总之，这些结果表明表达GGBP报告物的表皮干细胞可以忠实地感测细胞外葡萄糖浓度。
表皮细胞中GGBP融合蛋白的表达不会显著改变体外细胞增殖(图2F和图7B)或分化(图2G)。为了证实经修饰的表皮细胞不是致瘤性的，测定了细胞的锚定非依赖性生长，并证实具有GGBP靶向的表皮干细胞不能在悬浮液中生长(图2H)。作为阳性对照，从小鼠SCC(鳞状细胞癌)分离的癌起始细胞在软琼脂培养基中显示出强烈的集落形成(图2H)。GGBP报告物的表达不影响表皮干细胞分层的能力。当进行皮肤类器官培养时，靶细胞容易产生分层的上皮组织(图7C)。
为了研究工程化的血糖监测器在体内的潜在适用性，用工程化的表皮干细胞制备皮肤类器官培养物，并将类器官移植到CD1宿主动物上(图4A)。移植后未观察到皮肤移植物的显著排斥。移植的类器官表现出正常的表皮分层、增殖和细胞死亡(图8A-8E)。为了测试体内葡萄糖感测能力，在移植动物中进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。使禁食动物腹膜内接受大量葡萄糖。通过活体成像监测移植皮肤中的荧光(FRET)变化(图4B)，并且通过商业葡萄糖监测系统(Bayer Contour)测量血糖水平，其中血液样品取自剪断的尾部。图4C和4D显示测量的葡萄糖浓度和FRET比率随时间变化之间的相关性。FRET比率与体内葡萄糖浓度呈近似线性相关性(图4D，R2＝0,977)。相比之下，传统的葡萄糖传感器无法准确测量体内低葡萄糖水平。
为了测试用于较低葡萄糖浓度的皮肤传感器，我们通过向禁食动物施用胰岛素来诱导低血糖。移植皮肤的活体成像再次显示出FRET比率变化与葡萄糖水平的极好相关性(图4E和4F)。总之，这些结果说明具有GGBP报告物的工程化皮肤类器官可以准确地感测体内的血糖水平。
工程化组织类器官
如果工程化血糖监测器可以经工程化以响应血糖水平产生或调节胰岛素水平，则其可以近似自动维持患者的葡萄糖水平的“人工内分泌胰腺”。因此，将表达盒引入编码GGBP报告物和治疗性蛋白质的表皮干细胞中可以通过单次皮肤移植实现持续的葡萄糖监测和糖尿病治疗。GLP1(胰高血糖素样肽1)在食物消耗时从肠道释放出来，作为饱腹感信号以减少食物消耗并且作为肠降血糖素激素以刺激胰岛素释放和抑制胰高血糖素分泌而起作用。事实上，GLP1受体激动剂以前已被用于治疗2型糖尿病。因此，开发了新的Rosa26靶向载体，其含有编码GLP1和小鼠IgG-Fc片段(用于增强GLP1的稳定性和分泌)融合蛋白以及GGBP报告基因的表达盒(图8F)。
工程化的表皮细胞表现出强的GLP1产生和分泌(图4G)。分泌的GLP1融合蛋白是有功能的，因为当加入培养的胰岛素瘤细胞时，条件培养基显著诱导胰岛素的分泌(图4H)。
为了检查在饮食诱导的肥胖和糖尿病中的潜在适用性，将表达GLP1/GGBP的细胞和对照细胞(单独的GGBP)移植到两组CD1成年雄性小鼠中。向小鼠饲喂高脂肪饮食(HFD)以诱导移植动物的肥胖。与常规饲料的动物相比，HFD极大加速了移植有对照细胞的小鼠的体重增加。相反，GLP1表达导致体重增加的显著抑制(图4I；在图4J中定量)。
进行IPGTT以检查葡萄糖稳态。如通过直接测量血糖或GGBP报告物的活体成像所测定，GLP1的表达显著降低体内血糖波动(图4K-4M)。在糖尿病动物和GLP1治疗的动物两者中，GGBP报告物的非侵入性监测表现出与常规葡萄糖测量的极好的相关性(图4L和4M)。
人组织类器官
为了测试用人表皮干细胞进行葡萄糖感测的可行性，由分离自人新生儿包皮的原代表皮角质形成细胞培养人皮肤类器官。人表皮角质形成细胞容易在体外产生类器官，可以将该类器官移植到裸鼠体内。当用慢病毒感染时，移植的人细胞表现出外源萤光素酶基因的强烈表达(图5A)。当对早期或晚期表皮分化标志物进行染色时，移植组织显示正常的皮肤分层(图5B)。
对于CRISPR介导的基因组编辑，开发了编码靶向人AAVS1(腺相关病毒整合位点1)基因座的两种gRNA的载体和编码GGBP报告蛋白的AAVS1靶向载体(图9A)。用靶向载体与编码Cas9和gRNA的质粒一起对人表皮角质形成细胞进行电穿孔。分离克隆并通过DNA印迹分析确认正确的整合(图5C)。
GGBP融合蛋白的表达不会显著改变体外细胞增殖(图9B)或分化(图9C)。工程细胞在体外分层并形成皮肤类器官，将该皮肤类器官成功移植到了裸宿主体上。移植的组织类器官在体内表现出正常的表皮分层和增殖(图9D-9G)。进行IPGTT和GGBP报告物的活体成像，并且观察到移植皮肤中FRET比率变化与血糖水平的类似相关性(图5D-5F)。这些数据表明这些人组织类器官可用于监测人体血糖水平。
这项研究中，克服了技术障碍，利用免疫活性宿主建立了独特的小鼠-小鼠皮肤移植模型。该结果提供了关键证据支持皮内监测体内血糖水平的可行性。同样的平台也可以用于开发其他生物传感器和离体皮肤基因疗法，以稳定递送体内治疗性蛋白质(例如GLP1)，为许多其他终末或严重致残疾病提供有希望的治疗(参见Christensen,R.等人Skingenetically engineered as a bioreactor or a'metabolic sink'.Cells,tissues,organs 172,96-104,(2002)以及Del Rio,M.等人Current approaches and perspectivesin human keratinocyte-based gene therapies.Gene therapy 11Suppl 1,S57-63,(2004))。
实施例2：用表皮干细胞中CRISPR介导的基因组编辑治疗糖尿病和肥胖症
引言
在本报告中，通过将CRISPR介导的基因组编辑与表皮干细胞平台相结合，开发了具有可控的GLP1(胰高血糖素样肽-1)释放的皮肤移植物，并且在饮食诱导的肥胖和糖尿病小鼠中通过降低血糖波动证明了体内治疗效果。GLP1是一种主要的生理性肠降血糖素，其通过刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排空和保护胰岛β细胞量来控制血糖的稳态(参见Ross等人，2010,Sandoval等人，2015)。然而，天然GLP1必须通过肠胃外途径递送以实现其效果，因为其具有极短的循环半衰期。因此，体细胞基因转移可以为体内GLP1的长期和稳定递送提供更有效的方式，以治疗糖尿病(Prud’homme等人，2007；Rowzee等人，2011)。
基因组编辑技术(包括CRISPR(聚类规则间隔短回文重复序列)系统)的最新发展使得可以进行精确的基因改造，而为体细胞基因疗法提供了理想的工具(Cox等人，2015；Hotta等人2015；Wright等人2016)。然而，由于使用常规递送方法在体内效力不足，CRISPR技术的临床应用一直具有挑战。因此，可以将体外精确基因组编辑与体内工程细胞的有效应用相结合的离体平台的开发将为许多人疾病的治疗提供显著益处。
皮肤表皮干细胞(Blanpain和Fuchs，2006；Watt，2014)具有数个独特的优势，使它们特别适合离体体细胞基因疗法：i)人皮肤是体内最大和最易获得的器官，提供了用良好确立的程序收集表皮干细胞的可用性(Rasmussen等人，2013；Rheinwald和Green，1975,1977)。此外，容易监测皮肤的基因靶向的潜在脱靶效应，并且必要时，在不利后果的情况下将其移除。ii)培养的表皮干细胞可以很容易地诱导分化并且所得分层皮肤组织可以用良好确立的方案移植到供体患者(Blanpain和Fuchs，2006；Watt，2014)。与其他体细胞基因疗法方法相比，自体皮肤移植物相对便宜，并且该程序方法是微创的、安全的，并且已经临床用于治疗烧伤创伤数十年(Carsin等人，2000；Coleman和Siwy，1992)。iii)表皮干细胞的体细胞基因疗法是组织特异性的。在解剖学上，皮肤表皮不是直接血管化的，但是从位于下面的真皮组织中的血管接收营养。基底膜的物理分离排除了体内遗传修饰细胞的潜在传播，使其对皮肤基因疗法具有极高的组织特异性和安全性。iv)表皮干细胞可以经受住体外长期培养而不会失去干细胞特性(Rheinwald和Green，1975)，使得可能用非病毒方法进行精确的基因组编辑。潜在的遗传毒性(特别是来自病毒载体)已成为体细胞基因疗法的重要障碍(Kotterman等人，2015；Kustikova等人，2010)。v)表皮干细胞具有低免疫原性。基因疗法衍生产品可被宿主免疫系统识别为外来抗原，其可产生免疫响应而导致遗传修饰细胞的清除。然而，从培养的表皮干细胞发育的自体皮肤移植或同种异体移植可以在人患者中实现长期和稳定的移植，而不会引起显著的免疫反应(Centanni等人，2011；Zaulyanov和Kirsner，2007)。vi)已经充分记载了皮肤表皮细胞分泌的蛋白质例如ApoE(载脂蛋白E)和大凝血蛋白因子VIII和因子IX可以穿过表皮/真皮屏障并达到循环，从而以全身方式实现治疗效果(Christensen等人，2002；Del Rio等人，2004；Fakharzadeh等人，2000；Fenjves等人，1989；Gerrard等人，1993；Morgan等人，1987)。因此，皮肤干细胞疗法的潜在适用性是广泛的，并且超出皮肤病
该实施例证明，基因组编辑的表皮干细胞可用于在体内稳健、可控地递送GLP1，并在临床相关环境中有效治疗糖尿病和肥胖症。
实验程序
试剂和质粒DNA构建
豚鼠抗K5、兔抗K14、兔抗K10和兜甲蛋白抗体是洛克菲勒大学(RockefellerUniversity)的Elaine Fuchs博士的慷慨馈赠。大鼠单克隆β4-整联蛋白(CD104，BD553745)获自BD Pharmingen(Franklin lakes,NJ)。Ser10pho-组蛋白抗体获自EMDMillipore(Billerica,MA)。切割的胱天蛋白酶-3抗体获自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。胰岛素ELISA试剂盒获自EMD Millipore Corp.(Billerica,MA)。GLP-1ELISA试剂盒获自Sigma(St.Louis,MO)。除非另有说明，否则其他化学品或试剂均来自Sigma。
先前已经描述编码萤光素酶(SEQ ID NO:1)和H2B-RFP(SEQ ID NO:2)的慢病毒载体(Liu等人，2015；Yue,2016)。编码hCasd-D10A突变体的质粒是来自George Church的馈赠，获自Addgene(质粒#41816)。使用gBlock作为模板用以下引物构建编码gRNA表达盒的质粒：AAG GAA AAA AGC GGC CGC TGT ACA AAA AAG CAG G(SEQ ID NO:3)和gGA ATT CTAATG CCA ACT TTG TAG(SEQ ID NO:4)。用以下引物构建Rosa26靶向gRNA：ACA CCG GCA GGCTTA AAG GCT AAC CG(SEQ ID NO:5)，AAA ACG GTT AGC CTT TAA GCC TGC CG(SEQ ID NO:6)，ACA CCG AGG ACA ACG CCC ACA CAC Cg(SEQ ID NO:7)，AAA ACG GTG TGT GGG CGTTGT CCT CG(SEQ ID NO:8)。用以下引物构建AAVS1靶向gRNA：ACA CCG TCA CCA ATC CTGTCC CTA GG(SEQ ID NO:9)，AAA ACC TAG GGA CAG GAT TGG TGA CG(SEQ ID NO:10)，ACACCG CCC CAC AGT GGG GCC ACT AG(SEQ ID NO:11)，AAA ACT AGT GGC CCC ACT GTG GGGCG(SEQ ID NO:12)。用pRosa26-GT作为模板(来自Liqun Luo的馈赠，addgene质粒40025)使用以下引物构建Rosa26靶向载体：GAC TAG TGA ATT CGG ATC CTT AAT TAA GGC CTC CGCGCC GGG TTT TGG CG(SEQ ID NO:13)，GAC TAG TCC CGG GGG ATC CAC CGG TCA GGA ACAGGT GGT GGC GGC CC(SEQ ID NO:14)，CGG GAT CCA CCG GTG AGG GCA GAG GAA GCC TTCTAA C(SEQ ID NO:15)，TCC CCC GGG TAG AAA ATC AGA AGG ACA GGG AAG(SEQ ID NO:16)，GGA ATT CAA TAA AAT ATC TTT ATT TTC ATT ACA TC(SEQ ID NO:17)，CCT TAA TTAAGG ATC CAC GCG TGT TTA AAC ACC GGT TTT ACG AGG GTA GGA AGT GGT AC(SEQ ID NO:18)。用AAVS1hPGK-PuroR-pA供体(来自Rudolf Jaenisch的馈赠，addgene质粒22072)作为模板使用以下引物构建AAVS1靶向载体(SEQ ID NO:40)：CCC AAG CTT CTC GAG TTG GGGTIG CGC GTT TTC GAA G(SEQ ID NO:19)，CCC AAG CTT CCA TAG AGG CCA CCG CAT CCC C(SEQ ID NO:20)，CAG GGT CTA GAC GCC GGA TCC GGT ACC CTG TGC CTT CTA GTT GC(SEQID NO:21)，GGA TCC GGG GTC TAG ACC CTG GGG AGA GAG GTC GGT G(SEQ ID NO:22)，CCGCTC GAG AAT AAA ATA TCT TTA TTT TCA TTA CAT C(SEQ ID NO:23)，GCT CTA GAC CAAGTG ACG ATC ACA GGG ATC(SEQ ID NO:24)。用于CRISPR介导的敲入的基因分型引物：GAGCTG GGA CCA GGT TAT ATT C(SEQ ID NO:25)，GGT GCA TGA CCC GCA AG(SEQ ID NO:26)，GAG AGA TGG CTC GAG GAA ATG(SEQ ID NO:27)。
皮肤类器官培养和移植
通过用EDTA处理新生小鼠皮肤制备脱细胞真皮(直径为1cm的圆形)(Prunieras等人，1983)。将含有1.5X106个培养的角质形成细胞的等分试样接种到细胞培养插入物中的真皮上。过夜附着后，将皮肤培养物暴露于空气/液体界面。
对于皮肤类器官的移植，将6-8周龄的CD1雄性麻醉。将内径为0.8cm、外径为1.5cm的硅胶室底部植入其剃毛的背部中线皮肤上，该背部中线皮肤用于保持皮肤移植物。在植入一片移植物之后立即安装室盖以密封室。大约一周后，移除室盖以使移植物暴露于空气中。腹膜内施用单剂量的0.2mgα-CD4(GK1.5)和0.2mgα-CD8(2.43.1)抗体用于皮肤移植。
组织学和免疫荧光
将皮肤或伤口样品包埋在OCT中，冷冻，切片并在4％甲醛中固定。对于石蜡切片，将样品在4℃在4％甲醛中孵育过夜，用一系列递增浓度的乙醇和二甲苯脱水，然后包埋在石蜡中。将石蜡切片在降低浓度的乙醇中再水化，并在10mM柠檬酸盐(pH 6.0)中进行抗原暴露。对切片进行苏木精和伊红染色或免疫荧光染色。除非另有说明，否则根据制造商的说明稀释抗体。
细胞周期分析：
使用碘化丙啶(PI)染色然后使用流式细胞术确定细胞周期谱的影响。将小鼠和人表皮细胞分别在两个6cm细胞培养皿中培养24小时。用胰蛋白酶处理细胞，从每个培养皿收集1×105个细胞，然后进行一次PBS洗涤。使用70％(v/v)冰冷乙醇进行细胞固定1小时。然后，将固定的细胞在4℃下以500g离心10分钟，然后进行2次PBS洗涤。然后将细胞用100μlPBS中的75μg RNA酶A处理，并在37℃下孵育1小时。孵育后，通过在4℃下以500g离心10分钟收集细胞，然后进行另一次PBS洗涤。将细胞沉淀重悬于200μl PBS中，PI溶液最终浓度为25ng/μl。染色后，立即使用流式细胞仪BD FACSCantoTM II(BD Biosciences,San Jose,CA)分析细胞，激发波长为488nm，发射为585nm。使用FlowJoTM软件版本10(FLOWJO LLC,OR)分析DNA含量和细胞周期分布的直方图。
蛋白质生化分析
进行蛋白质印迹以评估蛋白质生化。简单地说，将等量的细胞裂解物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上分离，并电印迹到NC膜上。将免疫印迹用Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor)在室温下孵育1小时，然后与一抗孵育过夜。将印迹用Tween 20/Tris缓冲盐水(TBST)洗涤三次，并在室温下用1:10000稀释的二抗孵育1小时。将印迹用TBST再洗涤三次。使用LI-COR扫描仪和软件(LI-COR Biosciences)进行可视化和定量。
高脂肪饮食诱导的肥胖和葡萄糖和胰岛素耐量试验
将雄性CD-1小鼠饲养(每笼5只，～8周龄)在中央控制空气、湿度和温度的动物设施中。向这些小鼠饲喂常规饲料或购自Bio-Serv(Frenchtown,NJ)的HFD(60％kcal来自脂肪，20％来自碳水化合物，20％来自蛋白质)。每两周测量体重和食物摄入量。
对于葡萄糖耐量试验，对用HFD饲喂10周的小鼠进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。在试验前使小鼠禁食6小时。向动物注射溶解在盐水中的葡萄糖(1g/kg葡萄糖/体重，腹膜内)，并使用葡萄糖测试条和葡萄糖计在0、30、60和90分钟测量血糖。在IPGTT后1周进行腹膜内胰岛素耐量试验。使小鼠禁食4小时并用购自Sigma(St.Louis，MO)的胰岛素注射(2U/kg，腹膜内)。之后在0、30、60和90分钟测定血糖水平。
统计分析
使用Excel或OriginLab软件进行统计分析。箱形图用于描述整个群体而不假设统计分布。student t检验用于评估两个实验条件之间差异的统计显著性(P值)。
结果
通过CRISPR介导的基因组编辑在表皮干细胞中异位表达GLP1
通过皮肤表皮干细胞的基因工程，皮肤可被转化为以可控的方式产生GLP1的体内反应器(图1A)。尽管皮肤干细胞对利用病毒载体的操作非常敏感，但病毒感染可能导致遗传毒性并可能引起潜在基因疗法的重大安全问题(Kotterman等人，2015；Kostikova等人，2010)。CRISPR系统提出了以非病毒方式对靶基因组进行位点特异性修饰的新方法(Cox等人，2015；Hotta和Yamanaka,2015；Wright等人，2016)。
为了测试小鼠表皮干细胞中CRISPR介导的基因组编辑，开发了编码Cas9(CRISPR相关蛋白9)的D10A突变体的DNA载体(Ran等人，2013)、靶向小鼠Rosa26基因座的两种gRNA(指导RNA)和Rosa26靶向载体。靶向载体包含在编码GLP-1和小鼠IgG-Fc片段融合蛋白的表达盒的两侧的Rosa26基因座的两个同源臂(图10A和图2A)。当在表皮细胞中异位表达时，与IgG-Fc的融合增强了GLP-1的稳定性和分泌(Kumar等人，2007)。为了控制GLP-1释放的水平，我们进一步修饰了靶向载体，因此GLP-1融合蛋白的表达由四环素依赖性启动子驱动(图10A)。
从CD1新生小鼠分离原代表皮角质形成细胞，并用Rosa26靶向载体与编码Cas9和Rosa26特异性gRNA的质粒一起进行电穿孔。在选择时分离克隆，并通过PCR筛选和DNA印迹分析确认与Rosa26基因座的正确整合(图10B)。工程化的表皮细胞在用多西环素以剂量依赖性方式刺激后表现出强的GLP1产生(图10C)。分泌的GLP1融合蛋白是有功能的，因为当加入体外培养的胰岛素瘤细胞时，条件培养基显著诱导胰岛素的分泌(图10D)。表皮细胞中GLP1融合蛋白的表达不会显著改变体外细胞增殖(图10E和图14A)或分化(图10F和10G)。
为了证实修饰的表皮细胞不具有致瘤性，检查了细胞潜在的锚定非依赖性生长，结果表明在有或没有多西环素刺激的情况下，具有GLP1靶向的表皮干细胞不能在悬浮液中生长(图10H)。作为阳性对照，从小鼠SCC(鳞状细胞癌)分离的癌起始细胞(Schober和Fuchs，2011)在软琼脂培养基中表现出强烈的集落形成(图10H)。GLP1的表达不影响表皮干细胞分层的能力。当进行皮肤类器官培养时，靶细胞容易产生分层的上皮组织(14B)。
通过皮肤移植在体内稳定递送GLP1
为了研究GLP1在体内的潜在治疗效果，制备具有用GLP1-表达载体或对照载体靶向的表皮角质形成细胞的皮肤类器官培养物，并将类器官移植到CD1宿主动物(图11A和11B)。移植后未观察到皮肤移植物的显著排斥，表明靶向的表皮干细胞在体内免疫学上良好耐受。无论是否用多西环素处理，移植皮肤都表现出正常的表皮分层、增殖和细胞死亡(图11C-11E，以及图15A和15B)。当用含有多西环素的食物饲喂时，移植有表达GLP1的细胞的小鼠在血液中显示出显著增强的GLP1水平(图11F)。GLP1在移植动物中的表达稳定超过3个月(图11G)。与先前的观察(Christensen等人，2002；Del Rio等人，2004；Fakharzadeh等人，2000；Fenjves等人，1989；Gerrard等人，1993；Morgan等人，1987；Sebastiano等人，2014)一致，这些结果证实，皮肤来源的治疗性蛋白质可以穿过基底膜屏障并在体内实现系统效果。
用GLP1进行皮肤基因转移可以在体内实现治疗效果
为了研究对饮食诱导的肥胖和糖尿病的潜在效果，将表达GLP1的细胞和对照细胞移植到两组CD1成年小鼠上，并使用高脂肪饮食(HFD)在移植动物中诱导肥胖。将多西环素施用于一半动物以诱导GLP1的表达。为使性别差异最小化，仅使用雄性动物。与常规饲料的动物相比，HFD极大加速了未用多西环素处理的移植有对照细胞或GLP1细胞的小鼠的体重增加。用多西环素诱导GLP1表达导致移植有GLP1细胞而不是对照细胞的小鼠体重显著降低(图12A和图1C中定量)。一致地，白色脂肪组织的组织学检查证明，在对照组中，HFD在实验结束时逐渐增加脂肪细胞的大小并诱导显著水平的脂肪细胞肥大(图12B)。相比之下，GLP1表达的诱导显著抑制了这种效应(图12B)。
为了检查葡萄糖稳态，进行IPGTT(腹膜后葡萄糖耐量试验)和ITT(胰岛素耐量试验)。HFD导致未用多西环素处理的对照小鼠或GLP1-移植小鼠的葡萄糖耐量降低(12D和12E)。相比之下，GLP1的表达显著降低了体内血糖波动(图12D和12E)。与葡萄糖体内平衡分析一致，与对照小鼠或未进行多西环素处理的GLP1小鼠相比，移植皮肤中GLP1的表达显著降低了胰岛素抗性(图12F和12G)。总之，这些数据有力地表明，具有诱导型GLP1表达的皮肤基因疗法可用于治疗和预防饮食诱导的肥胖和病理。
用人表皮干细胞皮肤递送GLP1
为了测试用人表皮干细胞进行皮肤基因疗法的可行性，由分离自人新生儿包皮的原代表皮角质形成细胞培养人皮肤类器官。当用慢病毒感染时，移植的人细胞表现出外源萤光素酶基因的强烈表达(图13A)。当对早期或晚期表皮分化标志物进行染色时，移植组织显示正常的皮肤分层(图13B)。
为了检查人表皮细胞中CRISPR介导的基因组编辑，使用编码靶向人AAVS1(腺相关病毒整合位点1)基因座的两个gRNA的载体，和包含编码GLP-1和IgG-Fc片段融合蛋白的四环素诱导表达盒的AAVS1靶向载体(图16A)。用靶向载体与编码Cas9和gRNA的质粒一起转染人表皮角质形成细胞。分离克隆并通过DNA印迹分析确认正确的整合(图13C)。与小鼠细胞一样，工程人表皮细胞在用多西环素剂量依赖性刺激后表现出强GLP1产生(图13D)。从这些细胞分泌的GLP1融合蛋白在体外诱导胰岛素分泌(图13E)，证实了功能性GLP1从这些细胞中的释放。
人细胞中GLP1融合蛋白的表达不会显著改变体外细胞增殖(图16B)或分化(图16C和16D)。工程细胞在体外分层并形成皮肤类器官，将该皮肤类器官移植到裸宿主中(图13F)。无论是否用多西环素处理，移植的皮肤都表现出正常的表皮分层和增殖(图16E-16G)。当用含有多西环素的食物饲喂时，在用表达GLP1的细胞移植的裸鼠的血液中检测到GLP1的显著分泌(图13G)。
讨论
体细胞基因疗法为治疗多种其他终末或严重致残疾病提供了一种有前景的治疗方法(Collins和Thrasher，2015)。皮肤表皮干细胞代表了用于离体细胞基因疗法的理想平台，允许有效的遗传操作，具有最小的体内肿瘤发生或其他有害并发症的风险(Christensen等人，2002；Del Rio等人，2004)。除了表达治疗剂(例如，激素和/或蛋白质因子)例如GLP-1之外，皮肤表皮细胞中代谢酶的异位表达也可以将工程化组织类器官转化为潜在的“代谢池”以用于校正多种代谢紊乱(Christensen等人，2002)。因此，这种皮肤基因疗法平台的适用性非常广泛。由于皮肤移植的微创和安全性，如果建立用于皮肤基因疗法的有效临床前模型并从动物模型中获得令人鼓舞的结果，则人体临床试验可以相对容易地开始。
糖尿病是全球主要的健康问题(Ahima，2011；Ashcroft和Rorsman，2012)。肽激素GLP1具有维持葡萄糖的稳态水平以有效治疗糖尿病所必需的必需特性。延长内源GLP1的半衰期的化合物或合成GLP1受体激动剂已经临床用于辅助抗糖尿病治疗(Ross和Ekoe,2010；Sandoval和D'Alessio,Physiology of proglucagon peptides:role of glucagon andGLP-1in health and disease.Physio.Rev.95,513-548(2015))。已经提出可以将GLP1稳定递送至患者的体细胞基因转移作为糖尿病治疗的更有效方式(Prud'homme等人，2007；Rowzee等人，2011)。在这方面，皮肤构成有吸引力的靶器官，提供了用于GLP1递送的持久、安全且经济的方式。在这里，GLP1的可控释放在工程化组织类器官中得到证实，并且被证明在体内具有治疗效果，因此为开发用于对抗肥胖和糖尿病的新型治疗方法奠定了必要的基础。
基因疗法衍生产品可被宿主免疫系统识别为外来抗原，其可产生免疫响应而导致遗传修饰细胞的清除(Collins和Thrasher，2015)。但是，本研究中开发的模型提供了一种独特的方法。在正常皮肤表皮内，朗格汉斯细胞充当表达主要组织相容性复合体(MHC)II类并呈递抗原的唯一细胞类型(Haniffa等人，2015)。表皮角质形成细胞仅在其细胞表面上表达MHC I类分子，并且被认为是“非专职”抗原呈递细胞。因此，在没有朗格汉斯细胞或白细胞作为抗原呈递细胞的本文描述的工程化组织类器官(由表皮干细胞产生)中，潜在的抗原性和免疫原性显著降低。已经显示从培养的人角质形成细胞发展的皮肤同种异体移植物临床上可以用于治疗创伤，而不会引起显著的免疫反应(Centanni等人，2011；Zaulyanov和Kirsner，2007)。本结果首次证明，表达治疗性蛋白质的移植皮肤干细胞可以有效且稳定地移植到具有完整免疫系统的宿主小鼠。本结果进一步证明了皮肤基因疗法在未来治疗各种人疾病的潜力。
实施例3：用于治疗可卡因成瘾的组织类类器官
引言
药物成瘾的特征在于，当上瘾的个体暴露于药物或药物相关诱因时，出现强迫性药物寻求和摄取以及复发的高可能性，即使在戒断之后很长时间也是如此(Kalivas等人Drug addiction as a pathology of staged neuroplasticity.Neuropsychopharmacology:official publication of the American College of Neuropsychopharmacology33:166-180(2008)；Koob等人Neurocircuitry of addiction.Neuropsychopharmacology:official publication of the American College of Neuropsychopharmacology 35:217-238(2010)；O'Brien等人Conditioning factors in drug abuse:can they explaincompulsion？Journal of psychopharmacology 12:15-22(1998))。可卡因是一种常见的滥用药物，其导致严重的发病率和死亡率。虽然已经探索了多种药理学靶标和行为干预措施，但目前还没有FDA批准用于治疗使用者的可卡因使用或复发的药物，并且没有用于可卡因过量引起的急性紧急情况的有效干预措施(Heard等人Mechanisms of acute cocainetoxicity.The open pharmacology journal 2.70-78,(2008)；Zimmerman,J.L.Cocaineintoxication.Critical care clinics 28:517-526(2012))。最近我们证明皮肤的表皮祖细胞可以使用CRISPR(聚类规则间隔短回文重复序列)容易地在体外进行基因组编辑，并移植回供体小鼠(参见Liu,H等人，2015；Yue,J等人，2016；Yue等人，Engineered epidermalprogenitor cells can correct diet-induced obesity and diabetes.Cell stem cell(2017))。这种独特的离体平台可提供用于体基因传递的持久、有效和安全的方式。在这里，我们报道了这种用于在体内长期递送可卡因水解酶的基于皮肤干细胞的平台可以有效和特异地防止可卡因寻求和急性过量。
BChE(丁酰胆碱酯酶)是一种天然酶，其存在于肝细胞和血浆中，并水解其正常底物乙酰胆碱。BChE还可以以低催化效率将可卡因水解成苯甲酸和芽子碱甲酯，后者具有低毒性和有益的性质，即它们不是成瘾物质。蛋白质工程的最新进展极大地提高了BChE对可卡因水解的催化效力和底物特异性，并且用于保护免于可卡因诱导的行为，包括IVSA(静脉内自施用)的获取和复现。经修饰的hBChE(E30-6)的催化效率(kcat/KM)比野生型(WT)hBChE高4400倍以上，并且具有显著降低的对于乙酰胆碱的活性(参见Zheng等人A highlyefficient cocaine-detoxifying enzyme obtained by computational design.NatCommun.5:3457(2014)。然而，纯化的重组hBChE在静脉内注射后具有短的体内半衰期，使其仅用于可卡因滥用的急性治疗。在最近的临床试验中，hBChE-白蛋白融合蛋白TV-1380在促进依赖个体的可卡因戒断方面无效，这很可能是由于蛋白质的短半衰期以及低效率的肌内注射途径(Cohen-Barak等人Safety,pharmacokinetics,and pharmacodynamics of TV-1380,a novel mutated butyrylcholinesterase treatment for cocaine addiction,after single and multiple intramuscular injections in healthysubjects.Journal of clinical pharmacology 55:573-583(2015)；Gilgun-Sherki等人Placebo-controlled evaluation of a bioengineered,cocaine-metabolizing fusionprotein,TV-1380(AlbuBChE),in the treatment of cocaine dependence.Drug andalcohol dependence 166:13-20(2016))。因此，在体内稳定递送工程化hBChE以允许持续活性的能力可导致依赖个体中的可卡因戒断并且防止在其他人中建立可卡因依赖性。
实验程序
试剂和质粒DNA构建
除非有相反的指示，否则试剂和实验程序遵循以上实施例2中所述的那些。HumanBChE quantikine ELISA试剂盒获自R&D systems(Minneapolis,MN)。
具有点突变的人(SEQ ID NO:41)和小鼠BChE(SEQ ID NO:43){Zheng,2014#794}经密码子优化并由IDT(integrated DNA Technology,Coralville,IA)合成，并且分别用引物A-D进行PCR扩增：GCT CTA GAG CCA CCA TGC AGA CTC AGC ATA CCA AGG(SEQ ID NO:47)，CGG GAT CCA CCG GTT TAG AGA GCT GTA CAA GAT TCT TTC TTG(SEQ ID NO:48)，CCCAAG CTT GCC ACC ATG CAT AGC AAA GTC ACA ATC(SEQ ID NO:49)，ACG CGT CGA CTT AGAGAC CCA CAC AAC TTT CTT TCT TG(SEQ ID NO:50)。
皮肤类器官培养和移植
按照上述实施例2中描述的程序进行皮肤类器官培养和移植。
植入
除非下文另有说明，否则按照上文实施例2中所述的程序进行植入。
可卡因诱导的行为
对于所有行为实验，除非另有说明，否则使用C57BL/6J小鼠。将大约相等数量的成年雄性和雌性小鼠分组饲养直至手术。将小鼠以12h:12h的光:暗周期(在7:00光照)保持在受控的温度和湿度条件下。水和食物随意获得。在实验开始时，小鼠体重为约25-30g。所有程序均遵循美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南，并获得芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准。
药物：可卡因HCl和甲基苯丙胺HCl(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)溶解在无菌盐水中，并以10mL/kg的体积以适当的剂量腹膜内递送。乙醇(Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO,95％,密度＝0.816)在无菌盐水中以20％(v/v)稀释制备，并以适当的剂量腹膜内递送。(无菌盐水)以10mL/kg腹膜内施用作为对照。
CPP装置：如先前所述(Yan等人，2013)，CPP装置(图17；Med Associates,E.Fairfield,VT,USA)由被小室(7.2×12.7×12.7cm)分隔的两个大室(16.8×12.7×12.7cm)组成。每个室具有视觉和触觉特性的独特组合(一个大室具有黑色壁和杆状地板，另一个大室具有白色壁和网状地板，而中间室具有灰色壁和实心灰色地板)。每个隔室具有嵌入透明的有机玻璃(Plexiglas)铰链盖的灯。通过光束中断测量在每个室中花费的时间并记录。通过在药物配对侧花费的时间减去在盐水配对侧花费的时间，在试验日确定CPP。
CPP的获取：使用类似于先前研究(Yan等人，2013)的偏好CPP程序。CPP获取由三个连续程序组成：预试验、条件化和试验。在从移植手术中恢复7-12天后，小鼠在第1天进行预试验，其中允许小鼠每天自由探索整个室20分钟。将在灰色室中花费超过500秒或在任一大室中花费超过800秒的小鼠从研究中排除。在预试验日之后，小鼠在第2-5天进行条件化和试验。从第2天开始，小鼠接受药物的腹膜内注射(可卡因CPP中10mg/kg可卡因或乙醇CPP中2g/kg乙醇)并限制在白色室中30分钟。在同一天至少5小时后，小鼠接受生理盐水的腹膜内注射并限制在黑色室中30分钟。在第6天(试验日)，允许小鼠探索整个室20分钟，并记录在每个区域中花费的时间。
CPP的消退和复现：在CPP获取后，小鼠经历消退，其中程序与试验日相同。在每个消退日，允许小鼠探索整个室20分钟并记录在每个区域中花费的时间。进行消退直至CPP降低至与连续两天的预试验的水平无差别的水平。在最后消退的第二天，小鼠接受复现程序，其中接受可卡因CPP训练的小鼠接受腹膜内注射15mg/kg可卡因，并且接受乙醇CPP训练的小鼠接受腹膜内注射1g/kg乙醇。注射后立即让小鼠探索整个室20分钟，记录在每个区域花费的时间。
急性药物过量测试：移植手术后2周，4组GhBChE和4组GWT小鼠(每组n＝8)以40、80、120和160mg/kg接受可卡因的腹膜内注射。作为对照，4组GhBChE和4组GWT小鼠(每组n＝8)以34、68(LD50)、100和160mg/kg接受甲基苯丙胺(METH)的腹膜内注射。将CD1小鼠作为宿主的两只GhBChE小鼠和GWT小鼠也用于录制急性可卡因(80mg/kg)诱导的行为。注射后监测小鼠2小时，计算可卡因和METH诱导的致死率百分比。
具体方法：在植入后，对一组GhBChE和一组GWT小鼠(每组n＝9)进行可卡因CPP训练7天(图18A)。小鼠在第1天进行预试验，在第2天至第5天进行可卡因条件化4天，并且在第6天进行CPP试验。在植入后，对一组GhBChE和一组GWT小鼠(每组n＝8)进行乙醇CPP训练7天(图18B)。小鼠在第1天进行预试验，在第2天至第5天进行乙醇条件化4天，并且在第6天进行CPP试验。从第1天至第6天，对两组未经药物治疗的小鼠(每组n＝8)进行可卡因CPP训练(图18C)。第二天，小鼠接受移植手术。从第18天开始，在移植手术后重新开始行为程序。从第18天到第31天进行消退。在第32天，小鼠进行通过腹膜内注射可卡因诱导的复现。从第1天至第6天，对一组GhBChE和一组GWT小鼠(每组n＝8)进行乙醇CPP训练。从第7天至第20天进行消退(图18D)。在第21天，小鼠进行通过腹膜内注射乙醇诱导的复现程序。
统计分析
使用Excel或OriginLab软件进行统计分析。箱形图用于描述整个群体而不假设统计分布。student t检验用于评估两个实验条件之间差异的统计显著性(P值)。对于可卡因行为分析，使用因子时间(测试天数)内和因子处理(移植)之间的重复测量ANOVA分析CPP结果。用Fisher t-检验进一步分析了显著效果。
结果和讨论
为了在小鼠表皮祖细胞中进行CRISPR介导的基因组编辑，开发了编码Cas9(CRISPR相关蛋白9；Ran等人，2013)的D10A突变体的DNA载体、靶向小鼠Rosa26基因座的两种gRNA(指导RNA)和Rosa26靶向载体。靶向载体包含在编码经修饰的hBChE基因的表达盒的两侧的Rosa26基因座的两个同源臂(图19A)。从新生小鼠分离原代表皮基底细胞，并用Rosa26靶向载体与编码Cas9和Rosa26特异性gRNA的质粒一起进行电穿孔。在选择时分离克隆，并通过PCR筛选和DNA印迹分析确认与Rosa26基因座的正确整合(图19B)。如免疫印迹和ELISA(酶联免疫吸附测定)所示，工程化的表皮细胞表现出强的hBChE表达和分泌(图19C和19D)。分泌的hBChE蛋白是有功能的，因为从表达hBChE的细胞而不是对照细胞收集的条件培养基在体外显著诱导可卡因降解(图19E)。与先前的报道一致，mBChE(小鼠BChE)中的类似突变导致可卡因水解中的仅残余活性(Chen,X.等人Kinetic characterization of acocaine hydrolase engineered from mouse butyrylcholinesterase.The Biochemicaljournal466,243-251(2015)；图19E)。表皮干细胞中hBChE的表达在不会显著改变体外细胞增殖(图19F和图20A)或分化(图20B)。为了证实修饰的表皮细胞不具有致瘤性，检查了细胞潜在的锚定非依赖性生长。结果表明，hBChE靶向的表皮干细胞不能在悬浮液中生长。相比之下，从小鼠SCC(鳞状细胞癌)分离的癌症起始细胞(Schober,M,等人Tumor-initiatingstem cells of squamous cell carcinomas and their control by TGF-beta andintegrin/focal adhesion kinase(FAK)signaling.Proc Natl Acad Sci USA 108,10544-10549(2011))在软琼脂培养基中显示出强的集落形成效率(图20C)。
为了有效移植小鼠表皮祖细胞，通过在脱细胞小鼠真皮的上部培养细胞，开发了利用体外小鼠表皮干细胞的新器官型培养模型。暴露于空气/液体界面可诱导培养细胞分层，从而在体外产生皮肤样类器官。hBChE的表达不改变表皮干细胞分层的能力(图21A)。为了研究体内hBChE表达的潜在治疗效果，我们将类器官移植到同基因宿主动物(CD1和C57BL/6)(图22A和22B)。在移植后至少5个月未观察到皮肤移植物的显著排斥，表明靶向的表皮干细胞在体内免疫学上良好耐受。移植的皮肤表现出正常的表皮分层、增殖和细胞死亡(图21B、21C和22C)。移植有表达hBChE的细胞的小鼠在血液中显示出显著升高的人BChE水平(图22D)。移植动物中hBChE的表达稳定超过10周(图22D)。与先前的观察结果一致，我们的结果证实，皮肤来源的治疗性蛋白质可以穿过基底膜屏障并进入体内循环。
为了首先确定移植表达hBChE的细胞是否保护小鼠免受可卡因的急性全身毒性，我们向移植小鼠递送不同剂量的可卡因并计算可卡因的致死率。40、80、120、160mg/kg剂量的可卡因在移植有表达hBChE的细胞的小鼠(GhBChE)中具有接近0的致死率，而在移植有WT表皮细胞的对照小鼠(GWT)中，80mg/kg的可卡因诱导约50％致死率并且120和160mg/kg可卡因诱导100％致死率(图22E)。进行平行测试以测试在GhBChE小鼠和GWT小鼠中相关刺激物METH(甲基苯丙胺)的毒性。在GhBChE和GWT动物之间，由各种剂量的METH诱导的致死率没有差异(图22F)。该发现表明，表达hBChE的细胞的植入可导致体内功能性hBChE的显著释放，并保护小鼠免于急性可卡因过量的毒性。
接下来，使用条件性位置偏好(CPP)模式评估保护免于出现可卡因寻求，该模式被认为模拟奖励学习和寻求，因为实验动物接近并保持与已经与奖励效果配对的线索接触。将表达hBChE的细胞移植到未接触过可卡因的小鼠(cocaine-mice)，并且GWT动物作为对照。在4天的位置条件化之后，GWT小鼠在先前与可卡因相关的环境中花费显著更多的时间，而GhBChE小鼠显示没有这种偏好(图18A)。作为另外的对照，在GhBChE小鼠和GWT小鼠中4天的条件化之后测量乙醇CPP。相比之下，GhBChE小鼠和GWT小鼠在乙醇配对环境中花费显著更多的时间(图18B)。该发现表明，表达hBChE的细胞的植入有效且特异性地减弱了可卡因诱导的奖励效应。
为了确定移植表达hBChE的细胞是否影响可卡因诱导的药物寻求的复现，将表达hBChE的细胞移植到先前获得可卡因CPP的小鼠中。恢复10天后，我们进行了消退训练和药物引起的复现。在初始剂量的可卡因注射后，在GWT小鼠中恢复了对先前可卡因相关环境的偏好，但在GhBChE小鼠中没有恢复(图18C)。因为hBChE表达不阻止乙醇的CPP诱导(图18B)，所以使用这些GhBChE小鼠和GWT小鼠进行消退训练，然后进行复现。与由可卡因诱导的那些相反，在GhBChE小鼠和GWT小鼠中乙醇CPP类似地复现(图18D)。这些结果表明皮肤来源的hBChE有效且特异性地破坏可卡因引发的复现。
为了测试用人表皮祖细胞进行皮肤基因疗法的可行性，我们从分离自人新生儿包皮的原代表皮角质形成细胞培养人皮肤类器官。为了在人细胞中进行CRISPR介导的基因组编辑，我们开发了编码靶向人AAVS1(腺相关病毒整合位点1)基因座的两种gRNA的载体，以及具有编码工程化hBChE的表达盒的AAVS1靶向载体(图23A)。用靶向载体与编码Cas9和gRNA的质粒一起对人表皮角质形成细胞进行电穿孔。分离克隆并通过DNA印迹分析确认正确的整合(图23B)。如通过免疫印迹和ELISA所测定，与小鼠细胞一样，工程化的人表皮细胞表现出强的hBChE产生(图23C和23D)。hBChE蛋白在人细胞中的表达不会显著改变体外细胞增殖(图24A)或分化(图24B)。工程细胞在体外分层并形成皮肤类器官，将其移植到裸宿主中(图23E)。移植的皮肤在体内表现出正常的表皮分层、增殖和凋亡(图23F和图24C-D)。总之，这些结果表明人表皮祖细胞的CRISPR编辑不会显著改变细胞动力学和体内持久性。ELISA证实，移植有表达hBChE的细胞的小鼠在血液中具有显著水平的人BChE，该人BChE表达在体内稳定超过8周(图23G)。我们的研究结果表明，皮肤基因递送将来治疗可卡因滥用和过量具有潜在的临床意义。
这项研究首次表明，表达hBChE的移植皮肤干细胞在解决可卡因滥用的几个关键方面可具有高度药物特异性，包括减少可卡因寻求的发展，防止可卡因引起的药物寻求的复现和保护免于急性可卡因过量。由于存在高水平的hBChE，这种方法非常有效，几乎没有个体差异。用工程化的表皮干细胞进行皮肤基因递送可以为药物滥用或除可卡因之外的共同滥用提供治疗机会。
例如，胰高血糖素样肽1(GLP1)是控制食物摄入和葡萄糖稳态的主要生理肠降血糖素(Sandoval等人，2015)。多种GLP1受体激动剂已被FDA批准用于治疗II型糖尿病。我们最近的研究表明，皮肤来源的GLP1表达可以有效地纠正小鼠中饮食诱导的肥胖和糖尿病(Yue等人，2017)。有趣的是，GLP1受体激动剂还可以减弱啮齿动物中酒精和尼古丁的增强特性(Skibicka,K.P.,The central GLP-1:implications for food and drugreward.Front Neuroses.7,181(2013)；Egecioglu等人The glucagon-like peptide1analogue Exendin-4attenuates alcohol mediated behaviors in rodents.Psychoneuroendocrinol.38,1259-1270(2013)；Shirazi等人，Gut peptide GLP-1and itsanalogue,Exendin-4,decrease alcohol intake and reward.PLoS One.8,e61965(2013)；等人The glucagon-like peptide 1receptor agonist liraglutideattenuates the reinforcing properties of alcohol in rodents.Addict.Biol.21,422-437(2016))。因此，未来的研究将确定皮肤移植物中GLP1的组成型或诱导型表达是否可以减少酒精使用障碍和尼古丁依赖患者的酒精和尼古丁使用和复发。此外，重要的是研究皮肤中hBChE和GLP1的共表达是否可用于治疗酒精和可卡因以及乙醇和尼古丁共同滥用，这种情况高频率发生并显著增加与药物相关的发病率和死亡率风险。
皮肤的表皮干细胞为离体细胞基因疗法提供了理想的平台，允许有效的遗传操作，具有最小的体内肿瘤发生或其他有害并发症的风险。培养的人表皮祖细胞已被用于产生CEA(培养的表皮自体移植物)，其已在临床上用于治疗大量烧伤创伤数十年。工程化的皮肤干细胞和CEA也被用于治疗其他皮肤病，包括白癜风和皮肤遗传性疾病，例如大疱性表皮松解症。再生皮肤在体内是稳定的，并且可以在临床随访研究中长期持续。因此，皮肤基因疗法是持久的、微创的和安全的。
基因疗法衍生产品可被宿主免疫系统识别为外来抗原，其可产生免疫响应，导致治疗分子的中和或遗传修饰细胞的清除(Collins和Thrasher，2015)。我们用WT同基因动物构建的皮肤移植模型提供了一种独特的方法来检查体内这一过程。皮肤表皮角质形成细胞具有低免疫原性。在正常皮肤表皮内，朗格汉斯细胞充当表达主要组织相容性复合体(MHC)II类并呈递抗原的唯一细胞类型。表皮角质形成细胞被认为是“非专职”抗原呈递细胞。因此，在不存在朗格汉斯细胞或白细胞作为抗原呈递细胞的情况下，由表皮祖细胞产生的皮肤替代物中，潜在的抗原性和免疫原性显著降低。因此，工程化的皮肤移植物通常很好取得并且在WT同基因动物中是免疫耐受的。实际上，在具有完整免疫系统的宿主小鼠中皮肤来源的hBChE表达可以稳定超过10周而不会显著降低工程酶的血清水平，强烈暗示皮肤环境的低免疫原性可能有助于降低对hBChE的抗原性和免疫反应。此外，最老的GhBChE小鼠为6个月大，健康并且没有组织排斥，进一步支持针对可卡因滥用的皮肤基因疗法的长期可行性。总之，这些结果显示了皮肤基因疗法作为未来可卡因滥用的安全且具有成本效益的治疗选择的前景。
实施例4：治疗酒精滥用
引言
酒精使用障碍(AUD)是最重要的公众健康问题之一。AUD涉及以下问题：控制饮酒，即使引起问题仍继续使用酒精，不得不多饮酒以达到同样的效果，或者当饮酒减少或停止饮酒时出现戒断症状(Koob等人Neurobiology of addiction:a neurocircuitryanalysis.Lancet Psychiatry 3,760-773(2016)；Koob,G.F.Neurocircuitry of alcoholaddiction:synthesis from animal models.Handb.Clin.Neurol.125,33-54(2014)。在2012年美国有7.2％或1700万18岁及以上的成年人患有AUD(Grant等人Epidemiology ofDSM-5alcohol use disorder:results from the national epidemiologic survey onalcohol and related conditions III.JAMA Psychiatry 72,757-766(2015))。有三种FDA批准的药物和行为咨询用于在人中停止或减少饮酒和预防复发(Johnson,B.A.Updateon neuropharmacological treatments for alcoholism:scientific basis andclinical findings.Biochem.Pharmacol.75,34-56(2008))。然而，仅130万人接受治疗(NIAAA，2015)。此外，并非所有人都对这些药物和治疗类型具有响应，并且并非所有人都遵循所提供的治疗方案(Cohen等人Alcohol treatment utilization:findings from thenational epidemiologic survey on alcohol and related conditions.Drug AlcoholDepend.86,214-221(2007))。因此，需要采取其他方法来对抗AUD。事实上，如果有治疗可以阻止个人渴望消耗酒精，那么这种治疗可能最终导致个体停止消耗酒精。
胰高血糖素样肽1(GLP1)是胃肠肽和控制食物摄入和葡萄糖稳态的主要生理肠降血糖素(Sandoval等人，2015)。多种GLP1受体激动剂已被FDA批准用于治疗II型糖尿病。有趣的是，GLP1受体激动剂还可以减弱啮齿动物中酒精的增强特性(Skibicka,K.P.,Thecentral GLP-1:implications for food and drug reward.Front Neuroses.7,181(2013)；Egecioglu等人The glucagon-like peptide 1analogue Exendin-4attenuatesalcohol mediated behaviors in rodents.Psychoneuroendocrinol.38,1259-1270(2013)；Shirazi等人，Gut peptide GLP-1and its analogue,Exendin-4,decreasealcohol intake and reward.PLoS One.8,e61965(2013)；等人The glucagon-like peptide 1receptor agonist liraglutide attenuates the reinforcingproperties of alcohol in rodents.Addict.Biol.21,422-437(2016)；等人Effects of the GLP-1agonist Exendin-4on intravenous ethanol self-administration in mice.Alcohol Clin.Exp.Res.40,2247-2252(2016)；Suchankova等人The glucagon-like peptide-1receptor as a potential treatment target inalcohol use disorder:evidence from human genetic association studies and amouse model of alcohol dependence.Transl.Psychi.5,e583(2015))。
虽然GLP1可潜在地用于治疗AUD(Suchankova等人，2015)，但是天然GLP1必须通过肠胃外途径递送以实现其效果，并且它具有极短的循环半衰期(Sandoval和D’Alessio，2015)。因此，使用实施例2中的体细胞基因转移方法来确定GLP1在小鼠中治疗AUD的功效。
实验程序
除非有相反的指示，否则试剂和实验程序遵循以上实施例2中所述的那些。
经修饰的GLP1
对GLP1基因(mGLP1或DlmGLP1)进行修饰以产生具有较长体内半衰期的新蛋白质(Kumar等人，Gene therapy of diabetes using a novel GLP-1/IgG1-Fc fusionconstruct normalizes glucose levels in db/db mice.Gene therapy 14,162-172,(2007))。为了能够稳定地在体内递送mGLP1并控制其表达，我们制备了由dox依赖性启动子驱动的编码Gly8-突变体mGLP1和小鼠IgG-Fc片段融合蛋白(SEQ ID NO:45)的Rosa26-靶向载体(图25A；Yue等人Treatment of diabetes and obesity with CRISPR-mediatedgenome editing in epidermal progenitor cells.Cell Stem Cell,In press(2017)；Kumar等人，2007)。甘氨酸突变使得肽对DPP-IV介导的切割具有抗性(Mentlein等人，Dipeptidyl-peptidase IV hydrolyses gastric inhibitory polypeptide,glucagon-like peptide-1(7-36)amide,peptide histidine methionine and is responsible fortheir degradation in human serum.Eur.J.Biochem.214,829-835(1993))。
当在表皮细胞中表达时，与IgG-Fc的融合进一步增强mGLP1稳定性和循环半衰期(Kumar等人，2007)，并且其可以通过血脑屏障到达脑(Pardridge,W.M.,CSF,blood-brainbarrier,and brain drug delivery.Expert Opin.Drug Deliv.13,963-975(2016))。Rosa26等位基因已被广泛用作小鼠中基因靶向的安全基因座(Soriano,P.,GeneralizedlacZ expression with the ROSA26Cre reporter strain.Nat,Genetics 21,70-71,(1999))。为了使用CRISPR-介导的基因组编辑，开发了编码Cas9(CRISPR相关蛋白9)的D10A突变体的载体(Ran等人，2013)和靶向小鼠Rosa26等位基因的两种gRNA(指导RNA)。Cas9中的D10A突变和双切口系统将基因组中不希望的脱靶诱变降低到最低水平(Ran等人，2013)。
皮肤类器官培养和移植
从CD1或C57BL/6J小鼠的新生幼崽中分离表皮祖细胞。用编码Cas9和Rosa26特异性gRNA的靶向载体和质粒转染细胞。在含有嘌呤霉素的培养基中选择靶向克隆，并且通过PCR和DNA印迹确认正确引入Rosa26基因座(图25B)。通过将靶细胞接种到脱细胞新生真皮并在暴露于空气/液体界面时进行分化来制备小鼠皮肤替代物，并将所得组织移植到CD1或C57BL/6J小鼠(GLP1)。
当用dox食物饲喂时，GGLP1小鼠在3天内开始在血液中显示出显著增强的mGLP1水平(图25C；Yue等人，2017)。血浆中存在mGLP1的剂量依赖性释放(未显示)。在存在dox的情况下，mGLP1在GLP1小鼠中的表达稳定长达4个月(图25D)。
结果和讨论
与模拟移植(GWT)相比，mGLP1表达减弱了GLP1小鼠中乙醇诱导的CPP(图26)。
GLP1小鼠未表现出显著的乙醇诱导的CPP。如先前所述(Chen等人，DopamineD1and D3receptors are differentially involved in cue-elicited cocaineseeking.J.Neurochem.114,530-541(2010)；Kong等人，Activation of dopamineD3receptors inhibits reward-related learning induced by cocaine.Neurosci.176,152-161(2011))，在第1天进行2次自由探索(预试验)后，分开的GLP1和GWT小鼠组(每组n＝9)在接下来的4天内每天2次接受交替的乙醇(2g/kg)和盐水腹膜内注射。在第6天测试CPP表现。结果表示为在药物配对侧减去盐水配对侧花费的平均值±SEM时间。使用测试天数内的重复测量ANOVA作为组内因子，移植状态作为对象间因子(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。计算F值并进行Newman-Keuls事后检验(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。GLP1和GWT小鼠在整个期间饲喂dox食物。
这些结果表明mGLP1表达减弱了乙醇诱导的CPP。因此，表达mGLP1的组织类器官具有治疗AUD的潜力。此外，Egecioglu等人也报道了GLP-1受体激动剂Exendin-4(Ex4)减弱尼古丁诱导的运动刺激、累积多巴胺释放以及小鼠条件性位置偏好的表现(Egecioglu等人，2013)。因此，认为表达mGLP1的组织类器官也可用于治疗尼古丁成瘾。由此可见，表达mGLP1的组织类器官也可用于治疗同时对尼古丁成瘾的AUD患者。此外，据信设计用于表达多种治疗剂(例如mGLP1和hBChE)的组织类器官可用于减少可卡因和乙醇和/或尼古丁共同滥用的事件，并可能减少其他药物(例如苯丙胺)的滥用和共同滥用(参见Skibicka K.P.Thecentral GLP-1:Implications for food and drug reward,Front Neurosci.7:181(2013))。本文还预期GLP-1类似物(参见上文)可以以类似方式使用。
实施例5：用于治疗酒精滥用的组织类器官
酒精中毒是一种使人衰弱的疾病，其特征在于依赖于酒精消耗，并且通常与社会和/或健康问题有关。药物可用于治疗酒精中毒，该药物通过在消耗酒精时引起恶心、通过减少与饮酒相关的愉悦或通过减少对酒精的渴望来阻止酒精消耗。然而，与所有药物一样，治疗依从性是困难的。当药物用于戒除成瘾并需要自我施用时，治疗依从性进一步复杂化。因此，自动施用用于对抗消耗酒精时引起的酒精中毒的治疗剂将是期望的。
因此，如上所述制备了经工程化以表达编码蜘蛛来源的疼痛肽(例如DkTx(S2-DkTx；SEG ID NO:36)或VaTx(S2-VaTx3；SEG ID NO:35))的一种或多种酒精诱导型基因的组织类器官(参见图27)。此外，可以将GLP-1和/或GLP-1类似物进一步添加到组织类器官中，以与DkTx或VaTx一起同时或按需表达。设想任何这些治疗剂可以单独或以任何组合表达和/或施用。
在工程化酒精诱导型治疗组织类器官后，在两瓶选择模式中训练小鼠之前和之后将类器官移植到小鼠中。该模式测试了该系统如何有效地保护小鼠免于饮酒或重新饮酒。在小鼠饲养笼中，有两个液体瓶，一个含有常规饮用水，另一个含有一定比例的酒精溶液。每天测量酒精或水的消耗量。以前的工作已经确定，小鼠在一段时间内相比于饮水优先饮酒，反映了酒精的奖励效果。
因此，在植入酒精诱导型治疗组织类器官的情况下，预期小鼠不会产生对饮酒的偏好(获取)或重新开始饮酒(复发)。
类似地，根据该实例，当酒精代谢激活治疗剂(例如，蜘蛛来源的毒素和GLP-1或GLP-1类似物)的表达时，具有生物整合的组织类器官的人患者经历1)来自表达的毒素的疼痛或不适，和2)缺少来自表达的GLP-1/GLP-1类似物的奖励。以这种方式，响应于酒精代谢物而表达的治疗剂协同作用，并且患者不愿意饮酒。
实施例6：用于监测无症状心脏病发作(Silent Heart Attack)的组织类器官
无症状心脏病发作具有很少或没有明显的“典型”症状，例如胸部压力、胸部沉重、手臂疼痛、颈部疼痛、下颌疼痛、呼吸短促、出汗、极度疲劳、头晕和恶心。然而，虽然近一半的心脏病发作是无症状(silent)的，但它们与“明显”的心脏病发作有相似的死亡风险，并且如果成功诊断，其可以用类似的药物和生活方式改变来治疗。因此，监测指示无症状心脏病发作的因子(例如心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和心肌肌红蛋白)的能力将是有益的。
使用包含编码对H-FABP(SEG ID NO：62)和心肌肌红蛋白(SEQ ID NO:63)有特异性的报告分子的基因的靶向载体，如上所述制备经工程化以报告无症状心脏病发作的发生的组织类器官。
实施例7：用于监测中风的组织类器官
脑血管意外或“中风”是当流入脑的血流因阻塞或血管破裂而受损时由于缺乏氧气导致的脑细胞突然死亡。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(SEG ID NO：64)是与急性中风症状相关的生物标志物。S100B(SEQ ID NO:65)是与中风相关星形胶质细胞损伤和BBB通透性增加相关的标志物。当个体经历中风时，监测这种中风标志物的能力将允许更早的干预。
因此，使用包含编码对GFAP(SEQ ID NO:64)和S100B(SEQ ID NO:65)有特异性的报告分子的基因的靶向载体，如上所述制备经工程化以报告中风发生的组织类器官。
实施例8：用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的组织类固醇
引言
PKU是涉及氨基酸代谢的最普遍的遗传性疾病。其来自编码关键肝酶苯丙氨酸羟化酶(PAH)的基因的突变，所述酶催化将苯丙氨酸转化为酪氨酸的羟基化反应。如果不加以治疗，PKU将导致血浆苯丙氨酸水平急剧增加，造成深刻和不可逆转的精神残疾、癫痫和其他行为问题。目前对PKU的治疗是通过化学制造的蛋白质替代品对天然蛋白质摄入的严格饮食限制和补充除苯丙氨酸以外的氨基酸，这可以预防出生后该疾病的大多数并发症。然而，有充分证据表明，饮食限制的患者仍然存在神经心理缺陷，并且已经证明维持饮食控制是困难的，特别是在青少年、年轻人和孕妇中。体细胞基因疗法具有开发用于PKU的更有效的治疗的潜力。
尽管PAH天然是肝酶，但据推测，通过PAH在肝脏以外的组织(例如T细胞、肌肉细胞和皮肤表皮细胞)中异位表达，可以充分清除循环苯丙氨酸。然而，潜在的问题是PAH的催化活性需要非蛋白质辅助因子BH4(四氢生物蝶呤)，其通过涉及GTP环化水解酶I(GTPCH)、6-丙酮酰四氢生物蝶呤合酶(PTPS)和墨蝶呤还原酶(SR)的三种酶途径在肝细胞中从鸟苷三磷酸从头合成。如果没有BH4的足够补充或BH4合成途径的重建，PAH的异位表达不能正常发挥作用。在多种皮肤特异性启动子下表达PAH和GTPCH(BH4合成的限速酶)的转基因小鼠不能充分地拯救体内苯丙氨酸缺陷，这表明必须采用替代方法将皮肤表皮转化为有效的“苯丙氨酸池”。
已经提出酶替代疗法用于治疗PKU。苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)是用于清除苯丙氨酸的有吸引力的替代物。PAL可以进行L-苯丙氨酸的非氧化脱氨作用形成氨和肉桂酸(肉桂酸盐)，其可以作为尿液中的马尿酸盐与少量肉桂酸和苯甲酸一起排泄。与PAH不同，PAL是不需要辅助因子的自动催化酶，使其成为一种简单有效的去除血浆苯丙氨酸的方法。
小鼠表皮角质形成细胞的初步结果显示，在用编码PAL的慢病毒感染时PAL有效表达，并且培养基中苯丙氨酸的降解比表达PAH的细胞快得多。在表皮祖细胞中的外源性表达PAL不会显著改变体内细胞增殖或分化，并且当在脱细胞真皮的上部培养时，细胞容易产生皮肤类器官。因此，使用利用表皮祖细胞技术的CRISPR介导的基因组编辑，研究了通过PAL的皮肤表达来治疗PKU的可能性。
已经在BTBR品系(Jax品系002232)中通过ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)介导的诱变开发了PKU的小鼠模型。
随着在PAH突变小鼠中皮肤移植的建立，监测血浆苯丙氨酸水平。在用PAL表达细胞或对照细胞(用对照载体处理的BTBR表皮祖细胞)进行皮肤移植后三周，每两周从尾部剪切收集血样，持续长达30周。通过离心分离血浆。通过已建立的荧光方案确定苯丙氨酸浓度。降低苯丙氨酸水平恢复了黑色素生物合成，并导致毛色变化。对于所有移植动物，每周记录皮色的潜在改变。之前已经证明，对于病毒载体介导的疗法和用经修饰的PAL的酶替代疗法，PKU的治疗具有性别依赖性响应。因此，建立了两个不同的动物群(雄性和雌性)以测试体内皮肤基因疗法的潜在性别依赖性效应。
在实验的终点(30周)，使移植的动物安乐死并收集组织样品(移植的皮肤、宿主皮肤和肝脏)。通过PAH和PAL活性测定确定组织中酶活性的存在。
体外分析证明PAL在小鼠表皮细胞中的外源表达可以清除～120nmol的苯丙氨酸/小时/106个细胞。因此，含有～2X107个代谢活性细胞的两个1cm2表皮移植物可每天除去57μmol苯丙氨酸，这足以完全逆转高苯丙氨酸血症(PAH突变小鼠通常具有～2mM的血浆苯丙氨酸)。还预期了从棕色被毛到深黑色毛皮的完全表型变化。对于组织酶分析，预期了移植皮肤中的PAL活性检测，但在其他组织中没有。突变小鼠的肝脏中不存在PAH活性。雌性小鼠对PKU疗法更具抗性。如果这是皮肤基因疗法的情况，则测试雌性PAH突变小鼠以确定它们是否比雄性小鼠需要更大的皮肤移植物或更多移植物以校正高苯丙氨酸血症。
一个潜在的问题是PAL的过度表达可能导致小鼠中苯丙氨酸的过量去除并导致低苯丙氨酸血症，对于接受重组PAL酶替代疗法的人PKU患者已经报道了这种情况。如果发生这种情况，可以使用如上所述的用于驱动PAL表达的Tet(四环素)-诱导型系统。PAL的表达水平可以通过施用不同剂量的多西环素来控制。
方法1：在移植细胞中表达PAL基因
尽管PAL的外源表达不改变小鼠表皮角质形成细胞中的细胞增殖或分化程序，但PAL的表达可能损害人角质形成细胞生长或皮肤再生。如果发生这种情况，则使用用于驱动PAL基因表达的Tet诱导型系统(参见图28)。
方法2：PAL的免疫不耐受
如果PAL的外源表达确实导致不能被抑制的严重免疫响应，则测试用于治疗PKU的PAH(天然苯丙氨酸加工酶)的表达。尽管PAH需要BH4作为辅助因子，但已经表明肌肉中GTPCH和PTPS与PAH的共表达可导致小鼠模型中血浆苯丙氨酸的稳定和长期减少。因此，开发了具有编码PAH(SEQ ID NO:54)、GTPCH(SEQ ID NO:55)和PTPS(SEQ ID NO:56)的三重顺式表达盒的Rosa26靶向载体。
在体外和体内检查靶向的表皮祖细胞的苯丙氨酸清除率和对PKU的潜在治疗效果。如果PAH、GTPCH和PTPS的共表达不充分，则开发具有编码PAH、GTPCH、PTPS和SR(SEQ IDNO:57)的四重顺反子表达盒的Rosa26靶向载体以在组织类器官中重建整个BH4从头合成途径。
实施例9：用于治疗血友病的组织类器官
引言
血友病是由血浆中凝血因子VIII(A型)或IX(B型)缺乏引起的遗传性凝血障碍。无法停止的出血本身可能危及生命，但血友病患者通常也遭受软组织、关节和肌肉反复出血，导致慢性滑膜炎、严重的关节病和身体残疾。血友病是皮肤基因疗法的优秀候选者，因为因子VIII和IX二者是分泌蛋白，因此其在表皮细胞中的表达可校正缺陷。此外，特别是对于血友病A，因子VIII的编码序列超过7kb(千碱基)，远超出用于基因疗法的典型病毒载体(例如AAV(腺相关病毒)载体)的包装限制。皮肤中的体细胞基因疗法提供了比目前通过静脉输注纯化的因子VIII的标准疗法更持久和负担得起的用于血友病A的治疗。
先前的工作已经证明，因子VIII和IX可以在人或小鼠表皮角质形成细胞中表达，并且外源表达的凝血因子可以通过表皮/真皮屏障以到达循环。特别是，当在外皮蛋白启动子下表达因子VIII的转基因皮肤移植到免疫功能低下的宿主(因子VIII和Rag1双敲除)时，因子VIII的表皮表达显著恢复血浆因子VIII水平，强烈支持用皮肤基因疗法方法治疗血友病A的可行性。
设想了具有B结构域缺失的因子VIII表达基因(SEQ ID NO:58)，其中移除了B结构域，该B结构域是长内部结构域并且在功能上可用于血液凝固。设想转染靶向载体进一步引入Tet-诱导型系统以控制因子VIII的过度表达。
针对因子VIII的抑制性抗体的出现是当前酶替代疗法的最严重的并发症。如果小鼠因子VIII在突变小鼠(因子VIII缺陷)中的表达诱导抗体产生，则采用三种方法：
1)代替B结构域缺失的因子VIII，使用全长因子VIII(SEQ ID NO:59)用于皮肤基因疗法。虽然B结构域对于血液凝固不是必需的，但前瞻性临床结果的荟萃分析(meta-analysis)表明，B结构域的缺失可缩短重组因子VIII的半衰期，增加患者的出血发生率，并显著增加出现中和抗体的风险。
2)免疫球蛋白的Fc结构域(小鼠IgG1 Fc(SEQ ID NO:34)或人IgG1 Fc(SEQ IDNO:39))与因子VIII缀合。IgG的Fc结构域可以与新生Fc受体相互作用，其可以保护IgG免受分解代谢并延长其在循环中的半衰期。已经显示，人因子VIII与IgG1 Fc结构域的融合可以显著增加其在患者中的半衰期。此外，目前的临床结果表明，因子VIII的Fc缀合不会在患者中诱导中和抗体产生。一致地，已经显示，在血友病A小鼠模型中，与非缀合的因子VIII相比，Fc-因子VIII缀合物引发低得多的免疫反应。
3)因子VIII与白蛋白(SEQ ID NO:60)偶联。白蛋白是最丰富的血浆蛋白，是循环中多种分子的天然载体。白蛋白在血液中具有非常长的半衰期和低免疫原性。因此，与白蛋白的缀合可能增强皮肤基因疗法对血友病A的有效性。已经证明，白蛋白与因子IX(SEQ IDNO:61)的缀合可以显著保护循环中的因子IX并降低其免疫原性。尽管之前尚未成功地进行因子VIII与白蛋白的融合，但采用了不同的融合策略(例如，与因子VIII的氨基或羧基末端缀合和/或使用不同的接头肽进行融合)并且检查了体外和体外作用。
对于血友病B，使用因子IX采用与上述类似的方法。
实施例10：评价对皮肤移植的免疫响应
用免疫活性小鼠开发的皮肤移植程序提供了评估皮肤基因疗法后潜在免疫响应的独特机会。为了检查组织类器官移植后体内潜在的炎性浸润，在移植后的不同时间点收集移植的皮肤组织。通过用α-CD3、α-CD4、α-CD8(T细胞)、α-B220(B细胞)、α-CD11c(树突细胞)、α-Mac-1(巨噬细胞)、α-CD335(NK细胞)和α-Gr1(粒细胞)抗体进行免疫荧光染色来评估免疫细胞的潜在浸润。通过用α-CD1a抗体染色来确定皮肤移植物中朗格汉斯细胞的存在。此外，对皮肤样品进行作为潜在移植物排斥、组织抗原性和表皮反应性的指示剂的MHCI类和II类抗原(包括HLA-ABC和HLA-DR)染色。
作为第二种方法，通过流式细胞术(荧光激活细胞分选)评估免疫响应，其允许对免疫细胞群进行更全面和定量的分析。为此目的，开发了特定的抗体组以更仔细地检查响应于移植而改变的免疫细胞的表型。这些实验由切片的免疫荧光染色结果指导。例如，如果看到染色法中巨噬细胞的数量和/或位置的差异，则建立“巨噬细胞组”，其允许使用表面标志物确定募集的巨噬细胞是否采用促炎性M1(CD38、CD274、CD319)或抗炎M2(CD206、CD163、TFRC)表型。类似地，如果染色实验表明T细胞响应，则实施包含CD3(所有T细胞)、CD4(辅助T细胞)、CD8(杀伤T细胞)、FoxP3/CD25(调节T细胞)和CD44/CD62L(活化的T细胞)的T细胞组。需要了解免疫响应的确切性质(例如，免疫原性对比致耐受性)，以确定是否需要调节宿主对移植的响应。
为了确定经修饰表皮的植入是否可以增加对移植的角质形成细胞有特异性的宿主白细胞，进行体外细胞增殖测定。在皮肤移植之前和之后分离外周血单核细胞(PBMC)，并用经照射的自体PBMC或具有经修饰的表达的经照射的表皮祖细胞评估细胞增殖测定。使用植物凝集素作为阳性对照。
为了检查针对表皮祖细胞的NK(自然杀伤)细胞活性，使用从移植动物分离的PBMC。进行体外细胞毒性测定以确定不同效应物:靶比率下NK细胞的活性。使用NK敏感细胞系作为阳性对照。
为了检查经修饰的蛋白质的免疫原性，收集在不同时间点(最多6个月)来自移植动物的血液样品。通过ELISA(酶联免疫吸附测定)分析测定血清抗体水平。作为阳性对照，将重组经修饰的蛋白质的静脉内注射注射到小鼠中。
实施例11：皮肤移植物的非手术移除
生物整合的组织类器官可以临时使用并通过手术除去。然而，皮肤干细胞技术允许另一种非侵入性和有效的方式来实现移植细胞的清除。
为了测试这种可能性，使用编码苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)(SEQ ID NO:51)以及诱导型“自杀”基因HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)(SEQ ID NO:52)和yCD(酵母胞嘧啶脱氨酶)(SEQ ID NO:53)的Rosa26靶向载体进行表皮祖细胞转染。结果(数据未显示)表明两种自杀基因在表皮祖细胞中安全表达，并且在用前药(分别为更昔洛韦和5-氟胞嘧啶)处理后有效诱导细胞死亡。
潜在的问题是高水平的自杀基因表达(TK或yCD)可能导致旁观者效应，导致周围组织中的细胞死亡。为了防止这种情况，可以使用Tet启动子来驱动自杀基因表达，从而通过施用多西环素来控制自杀基因表达水平。
因此，考虑编码报告分子和/或治疗剂以及诱导型自杀基因的组织类器官，以通过非手术方式移除生物整合的组织类器官。
实施例12：用于治疗肥胖的组织类器官
最近的报告显示，近40％的美国成年人和约20％的儿童是肥胖的。肽YY(PYY)(SEQID NO:66)与饥饿和饱腹感有关，并且响应于进食从回肠和结肠中的细胞释放。PYY水平的增加被认为与饱腹感有关。根据本公开内容，PYY的施用可允许患有肥胖症的人减少其食物消耗，从而使其可以不仅减轻体重，而且保持体重减轻。
因此，使用编码PYY(SEQ ID NO:66)的靶向载体如本文所述制备了用于治疗和/或预防肥胖的组织类器官。预计增加的PYY水平将减少接受表达PYY的组织类器官的个体的渴望。结果，预期个体将经历减少的食物寻求和消耗，从而治疗和/或预防肥胖。
实施例13：用于开衰老作用的组织类器官
全球抗衰老市场估计为2500亿美元。衰老的影响包括但不限于血管和心脏疾病以及免疫响应的降低。金属蛋白酶组织抑制物2(TIMP2)(SEQ ID NO:67)编码为基质金属蛋白酶(MMP)的天然抑制剂的蛋白质。发现TIMP2在很小的年龄时以高浓度存在，但随着年龄的增长而下降。用小鼠进行的记忆研究表明，在用TIMP2注射后，较老的小鼠与年轻小鼠的表现相当(Castellano等人，Nature,544,488-492(2017))。TIMP2的受控施用可具有抗衰老作用，例如记忆改善。
因此，使用编码TIMP2(SEQ ID NO:67)的靶向载体如本文所述制备经工程化以治疗和/或预防衰老作用的组织类器官。预计增加的TIMP2水平将在接受表达TIMP2的组织类器官的个体中表现出抗衰老作用。结果，预期受治疗的个体可以经历衰老的负面影响的减少，该负面影响可以包括记忆丧失、血管响应降低和/或免疫响应降低。
实施例14：用于尼古丁滥用的组织类器官
类似地，烟草使用是心血管疾病、肺病和癌症造成的死亡的主要原因(Nature，362,2295-2303(2010))。美国疾病控制中心(Center for Disease Control)声称，每年有近48万人死于与烟草相关的死亡。很久就确定尼古丁是导致烟草的成瘾性质的原因。尼古丁替代疗法(包括透皮尼古丁贴片和尼古丁口香糖)是FDA批准的第一个用于戒烟的治疗。虽然常用尼古丁替代品，但也有其他形式的治疗方法，包括抗抑郁剂安非他酮(NationalInstitute on Drug Abuse,Tobacco/Nicotine,Research Report Series(2012)。尽管有多种治疗方法，尼古丁滥用仍然普遍存在。Egecioglu等人报道了GLP-1受体激动剂Exendin-4(Ex4)减弱尼古丁诱导的运动刺激、累积多巴胺释放以及小鼠条件性位置偏好的表现(Egecioglu等人，2013)。因此，认为表达mGLP1的组织类器官也可用于治疗尼古丁成瘾。
实验程序
除非有相反的指示，否则试剂和实验程序遵循以上实施例2中所述的那些。
经修饰的GLP1
对GLP1基因(mGLP1)进行修饰以产生具有较长体内半衰期的新蛋白质(Kumar等人，Gene therapy of diabetes using a novel GLP-1/IgG1-Fc fusion constructnormalizes glucose levels in db/db mice.Gene therapy 14,162-172,(2007))。为了能够稳定地在体内递送mGLP1并控制其表达，我们制备了由dox依赖性启动子驱动的编码Gly8-突变体mGLP1和小鼠IgG-Fc片段融合蛋白(SEQ ID NO:45)的Rosa26-靶向载体(图25A；Yue等人Treatment of diabetes and obesity with CRISPR-mediated genomeediting in epidermal progenitor ceils.Cell Stem Cell,In press(2017)；Kumar等人，2007)。甘氨酸突变使得肽对DPP-IV介导的切割具有抗性(Mentlein等人，Dipeptidyl-peptidase IV hydrolyses gastric inhibitory polypeptide,glucagon-like peptide-1(7-36)amide,peptide histidine methionine and is responsible for theirdegradation in human serum.Eur.J.Biochem.214,829-835(1993))。
当在表皮细胞中表达时，与IgG-Fc的融合进一步增强mGLP1稳定性和循环半衰期(Kumar等人，2007)，并且其可以通过血脑屏障到达脑(Pardridge,W.M.,CSF,blood-brainbarrier,and brain drug delivery.Expert Opin.Drug Deliv.13,963-975(2016))。Rosa26等位基因已被广泛用作小鼠中基因靶向的安全基因座(Soriano,P.,GeneralizedlacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.Nat,Genetics 21,70-71,(1999))。为了使用CRISPR-介导的基因组编辑，开发了编码Cas9(CRISPR相关蛋白9)的D10A突变体的载体(Ran等人，2013)和靶向小鼠Rosa26等位基因的两种gRNA(指导RNA)。Cas9中的D10A突变和双切口系统将基因组中不希望的脱靶诱变降低到最低水平(Ran等人，2013)。
皮肤类器官培养和移植
从CD1或C57BL/6J小鼠的新生幼崽中分离表皮祖细胞。用编码Cas9和Rosa26特异性gRNA的靶向载体和质粒转染细胞。在含有嘌呤霉素的培养基中选择靶向克隆，并且通过PCR和DNA印迹确认正确引入Rosa26基因座(图25B)。通过将靶细胞接种到脱细胞新生真皮并在暴露于空气/液体界面时进行分化来制备小鼠皮肤替代物，并将所得组织移植到CD1或C57BL/6J小鼠(GLP1)。
当用dox食物饲喂时，mGLP1小鼠在3天内开始在血液中显示出显著增强的mGLP1水平(图25C；Yue等，2017)。血浆中存在GLP1的剂量依赖性释放(未显示)。在存在dox的情况下，mGLP1在GLP1小鼠中的表达稳定长达4个月(图25D)。
结果和讨论
与模拟移植(GWT)相比，GLP1表达减弱了GLP1小鼠中尼古丁诱导的CPP(图29)。
GLP1小鼠未表现出显著的尼古丁诱导的GPP。如先前所述(Chen等人，DopamineD1and D3receptors are differentially involved in cue-elicited cocaineseeking.J.Neurochem.114,530-541(2010)；Kong等人，Activation of dopamineD3receptors inhibits reward-related learning induced by cocaine.Neurosci.176,152-161(2011))，在第1天进行2次自由探索(预试验)后，分开的mGLP1和GWT组(每组n＝7)在接下来的4天内每天2次接受交替的尼古丁(0.4mg/kg)和盐水腹膜内注射。在第6天测试CPP表现。结果表示为在药物配对侧减去盐水配对侧花费的平均值±SEM时间。使用测试天数内的重复测量ANOVA作为组内因子，移植状态作为对象间因子(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。计算F值并进行Newman-Keuls事后检验(Chen等人，2010；Kong等人，2011)。GLP1和GWT小鼠在整个期间饲喂dox食物。
这些结果表明mGLP1表达减弱了尼古丁诱导的CPP。因此，表达mGLP1的组织类器官具有治疗尼古丁滥用的潜力。此外，据信经设计用于表达多种治疗剂(例如mGLP1和hBChE)的组织类器官可用于减少可卡因和乙醇和/或尼古丁共同滥用的事件，并可能减少其他药物(例如苯丙胺)的滥用和共同滥用(参见Skibicka K.P.The central GLP-1:implications for food and drug reward,Front Neurosci.7:181(2013))。本文还预期GLP-1类似物(参见上文)可以以类似方式使用。
序列
已经详细地并参考本发明的具体方面和/或实施方案描述了本发明，显而易见的是在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。更具体地，尽管本文中的一些方面可以在本文中被识别为特别有利，但是可以预期本发明不限于本发明的这些特定方面。
序列表
<110> The University of Chicago
<120> 组织类器官
<130> 16-1381-PRO
<140> tbd
<141> 2016-12-09
<160> 67
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1071
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 萤光素酶
<400> 1
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accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtggac atcacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt 360
tcgcagccta ccgtggtgtt cgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaagctcc caatcatcca aaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtgccag agtccttcga tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga 600
tctactggtc tgcctaaagg tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac 840
aagattcaaa gtgcgctgct ggtgccaacc ctattctcct tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960
aaggaagtcg gggaagcggt tgccaagagg ttccatctgc caggtatcag gcaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcaaag aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cctgaagtct 1320
ctgattaagt acaaaggcta tcaggtggct cccgctgaat tggaatccat cttgctccaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccg 1648
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> gRNA表达盒正向引物
<400> 3
aaggaaaaaa gcggccgctg tacaaaaaag cagg 34
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> gRNA表达盒反向引物
<400> 4
ggaattctaa tgccaacttt gtac 24
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向gRNA正向引物1
<400> 5
acaccggcag gcttaaaggc taaccg 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向gRNA反向引物1
<400> 6
aaaacggtta gcctttaagc ctgccg 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向gRNA正向引物2
<400> 7
acaccgagga caacgcccac acaccg 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向gRNA反向引物2
<400> 8
aaaacggtgt gtgggcgttg tcctcg 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> AAVS1靶向gRNA正向引物1
<400> 9
acaccgtcac caatcctgtc cctagg 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> AAVS1靶向gRNA反向引物1
<400> 10
aaaacctagg gacaggattg gtgacg 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> AAVS1靶向gRNA正向引物2
<400> 11
acaccgcccc acagtggggc cactag 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> AAVS1靶向gRNA反向引物2
<400> 12
aaaactagtg gccccactgt ggggcg 26
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向载体正向引物1
<400> 13
gactagtgaa ttcggatcct taattaaggc ctccgcgccg ggttttggcg 50
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向载体反向引物1
<400> 14
gactagtccc gggggatcca ccggtcagga acaggtggtg gcggccc 47
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向载体正向引物2
<400> 15
cgggatccac cggtgagggc agaggaagcc ttctaac 37
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向载体反向引物2
<400> 16
tcccccgggt acaaaatcag aaggacaggg aag 33
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向载体正向引物3
<400> 17
ggaattcaat aaaatatctt tattttcatt acatc 35
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向载体反向引物3
<400> 18
ccttaattaa ggatccacgc gtgtttaaac accggtttta cgagggtagg aagtggtac 59
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用AAVS1 hPGK-PuroR-pA 供体正向引物1构建的AAVS1靶向载体
<400> 19
cccaagcttc tcgagttggg gttgcgcctt ttccaag 37
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用AAVS1 hPGK-PuroR-pA 供体反向引物1构建的AAVS1靶向载体
<400> 20
cccaagcttc catagagccc accgcatccc c 31
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用AAVS1 hPGK-PuroR-pA 供体正向引物2构建的AAVS1靶向载体
<400> 21
cagggtctag acgccggatc cggtaccctg tgccttctag ttgc 44
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用AAVS1 hPGK-PuroR-pA 供体反向引物2构建的AAVS1靶向载体
<400> 22
ggatccggcg tctagaccct ggggagagag gtcggtg 37
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用AAVS1 hPGK-PuroR-pA 供体正向引物3构建的AAVS1靶向载体
<400> 23
ccgctcgaga ataaaatatc tttattttca ttacatc 37
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用AAVS1 hPGK-PuroR-pA 供体反向引物3构建的AAVS1靶向载体
<400> 24
gctctagacc aagtgacgat cacagcgatc 30
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用于CRISPR介导的敲入的基因分型引物#1
<400> 25
gagctgggac caccttatat tc 22
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用于CRISPR介导的敲入的基因分型引物#2
<400> 26
ggtgcatgac ccgcaag 17
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 用于CRISPR介导的敲入的基因分型引物#3
<400> 27
gagagatggc tccaggaaat g 21
<210> 28
<211> 2391
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 具有GGBP的A213R/L238S双突变的CFP/YFP FRET传感器
<400> 28
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacat cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagggt 720
ggtaccggag gcgccgctga tactcgcatt ggtgtaacaa tctataagta cgacgataac 780
tttatgtctg tagtgcgcaa ggctattgag caagatgcga aagccgcgcc agatgttcag 840
ctgctgatga atgattctca gaatgaccag tccaagcaga acgatcagat cgacgtattg 900
ctggcgaaag gggtgaaggc actggcaatc aacctggttg acccggcagc tgcgggtacg 960
gtgattgaga aagcgcgtgg gcaaaacgtg ccggtggttt tcttcaacaa agaaccgtct 1020
cgtaaggcgc tggatagcta cgacaaagcc tactacgttg gcactgactc caaagagtcc 1080
ggcattattc aaggcgattt gattgctaaa cactgggcgg cgaatcaggg ttgggatctg 1140
aacaaagacg gtcagattca gttcgtactg ctgaaaggtg aaccgggcca tccggatgca 1200
gaagcacgta ccacttacgt gattaaagaa ttgaacgata aaggcatcaa aactgaacag 1260
ttacagttag ataccgcaat gtgggacacc gctcaggcga aagataagat ggacgcctgg 1320
ctgtctggcc cgaacgccaa caaaatcgaa gtggttatcg ccaacaacga tcggatggca 1380
atgggcgcgg ttgaagcgct gaaagcacac aacaagtcca gcattccggt gtttggcgtc 1440
gatgcgtcgc cagaagcgct ggcgctggtg aaatccggtg cactggcggg caccgtactg 1500
aacgatgcta acaaccaggc gaaagcgacc tttgatctgg cgaaaaacct ggccgatggt 1560
aaaggtgcgg ctgatggcac caactggaaa atcgacaaca aagtggtccg cgtaccttat 1620
gttggcgtag ataaagacaa cctggctgaa ttcagcaaga aaggcgccgg taccggtgga 1680
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 1740
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 1800
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 1860
ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 1920
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 1980
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 2040
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 2100
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 2160
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 2220
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 2280
tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 2340
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct g 2391
<210> 29
<211> 4146
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Cas9 D10A
<400> 29
gccaccatgg acaagaagta ctccattggg ctcgctatcg gcacaaacag cgtcggctgg 60
gccgtcatta cggacgagta caaggtgccg agcaaaaaat tcaaagttct gggcaatacc 120
gatcgccaca gcataaagaa gaacctcatt ggcgccctcc tgttcgactc cggggagacg 180
gccgaagcca cgcggctcaa aagaacagca cggcgcagat atacccgcag aaagaatcgg 240
atctgctacc tgcaggagat ctttagtaat gagatggcta aggtggatga ctctttcttc 300
cataggctgg aggagtcctt tttggtggag gaggataaaa agcacgagcg ccacccaatc 360
tttggcaata tcgtggacga ggtggcgtac catgaaaagt acccaaccat atatcatctg 420
aggaagaagc ttgtagacag tactgataag gctgacttgc ggttgatcta tctcgcgctg 480
gcgcatatga tcaaatttcg gggacacttc ctcatcgagg gggacctgaa cccagacaac 540
agcgatgtcg acaaactctt tatccaactg gttcagactt acaatcagct tttcgaagag 600
aacccgatca acgcatccgg agttgacgcc aaagcaatcc tgagcgctag gctgtccaaa 660
tcccggcggc tcgaaaacct catcgcacag ctccctgggg agaagaagaa cggcctgttt 720
ggtaatctta tcgccctgtc actcgggctg acccccaact ttaaatctaa cttcgacctg 780
gccgaagatg ccaagcttca actgagcaaa gacacctacg atgatgatct cgacaatctg 840
ctggcccaga tcggcgacca gtacgcagac ctttttttgg cggcaaagaa cctgtcagac 900
gccattctgc tgagtgatat tctgcgagtg aacacggaga tcaccaaagc tccgctgagc 960
gctagtatga tcaagcgcta tgatgagcac caccaagact tgactttgct gaaggccctt 1020
gtcagacagc aactgcctga gaagtacaag gaaattttct tcgatcagtc taaaaatggc 1080
tacgccggat acattgacgg cggagcaagc caggaggaat tttacaaatt tattaagccc 1140
atcttggaaa aaatggacgg caccgaggag ctgctggtaa agcttaacag agaagatctg 1200
ttgcgcaaac agcgcacttt cgacaatgga agcatccccc accagattca cctgggcgaa 1260
ctgcacgcta tcctcaggcg gcaagaggat ttctacccct ttttgaaaga taacagggaa 1320
aagattgaga aaatcctcac atttcggata ccctactatg taggccccct cgcccgggga 1380
aattccagat tcgcgtggat gactcgcaaa tcagaagaga ccatcactcc ctggaacttc 1440
gaggaagtcg tggataaggg ggcctctgcc cagtccttca tcgaaaggat gactaacttt 1500
gataaaaatc tgcctaacga aaaggtgctt cctaaacact ctctgctgta cgagtacttc 1560
acagtttata acgagctcac caaggtcaaa tacgtcacag aagggatgag aaagccagca 1620
ttcctgtctg gagagcagaa gaaagctatc gtggacctcc tcttcaagac gaaccggaaa 1680
gttaccgtga aacagctcaa agaagactat ttcaaaaaga ttgaatgttt cgactctgtt 1740
gaaatcagcg gagtggagga tcgcttcaac gcatccctgg gaacgtatca cgatctcctg 1800
aaaatcatta aagacaagga cttcctggac aatgaggaga acgaggacat tcttgaggac 1860
attgtcctca cccttacgtt gtttgaagat agggagatga ttgaagaacg cttgaaaact 1920
tacgctcatc tcttcgacga caaagtcatg aaacagctca agaggcgccg atatacagga 1980
tgggggcggc tgtcaagaaa actgatcaat gggatccgag acaagcagag tggaaagaca 2040
atcctggatt ttcttaagtc cgatggattt gccaaccgga acttcatgca gttgatccat 2100
gatgactctc tcacctttaa ggaggacatc cagaaagcac aagtttctgg ccagggggac 2160
agtcttcacg agcacatcgc taatcttgca ggtagcccag ctatcaaaaa gggaatactg 2220
cagaccgtta aggtcgtgga tgaactcgtc aaagtaatgg gaaggcataa gcccgagaat 2280
atcgttatcg agatggcccg agagaaccaa actacccaga agggacagaa gaacagtagg 2340
gaaaggatga agaggattga agagggtata aaagaactgg ggtcccaaat ccttaaggaa 2400
cacccagttg aaaacaccca gcttcagaat gagaagctct acctgtacta cctgcagaac 2460
ggcagggaca tgtacgtgga tcaggaactg gacatcaatc ggctctccga ctacgacgtg 2520
gatcatatcg tgccccagtc ttttctcaaa gatgattcta ttgataataa agtgttgaca 2580
agatccgata aaaatagagg gaagagtgat aacgtcccct cagaagaagt tgtcaagaaa 2640
atgaaaaatt attggcggca gctgctgaac gccaaactga tcacacaacg gaagttcgat 2700
aatctgacta aggctgaacg aggtggcctg tctgagttgg ataaagccgg cttcatcaaa 2760
aggcagcttg ttgagacacg ccagatcacc aagcacgtgg cccaaattct cgattcacgc 2820
atgaacacca agtacgatga aaatgacaaa ctgattcgag aggtgaaagt tattactctg 2880
aagtctaagc tggtctcaga tttcagaaag gactttcagt tttataaggt gagagagatc 2940
aacaattacc accatgcgca tgatgcctac ctgaatgcag tggtaggcac tgcacttatc 3000
aaaaaatatc ccaagcttga atctgaattt gtttacggag actataaagt gtacgatgtt 3060
aggaaaatga tcgcaaagtc tgagcaggaa ataggcaagg ccaccgctaa gtacttcttt 3120
tacagcaata ttatgaattt tttcaagacc gagattacac tggccaatgg agagattcgg 3180
aagcgaccac ttatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtgtggga caagggtagg 3240
gatttcgcga cagtccggaa ggtcctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt taaaaagacc 3300
gaagtacaga ccggaggctt ctccaaggaa agtatcctcc cgaaaaggaa cagcgacaag 3360
ctgatcgcac gcaaaaaaga ttgggacccc aagaaatacg gcggattcga ttctcctaca 3420
gtcgcttaca gtgtactggt tgtggccaaa gtggagaaag ggaagtctaa aaaactcaaa 3480
agcgtcaagg aactgctggg catcacaatc atggagcgat caagcttcga aaaaaacccc 3540
atcgactttc tcgaggcgaa aggatataaa gaggtcaaaa aagacctcat cattaagctt 3600
cccaagtact ctctctttga gcttgaaaac ggccggaaac gaatgctcgc tagtgcgggc 3660
gagctgcaga aaggtaacga gctggcactg ccctctaaat acgttaattt cttgtatctg 3720
gccagccact atgaaaagct caaagggtct cccgaagata atgagcagaa gcagctgttc 3780
gtggaacaac acaaacacta ccttgatgag atcatcgagc aaataagcga attctccaaa 3840
agagtgatcc tcgccgacgc taacctcgat aaggtgcttt ctgcttacaa taagcacagg 3900
gataagccca tcagggagca ggcagaaaac attatccact tgtttactct gaccaacttg 3960
ggcgcgcctg cagccttcaa gtacttcgac accaccatag acagaaagcg gtacacctct 4020
acaaaggagg tcctggacgc cacactgatt catcagtcaa ttacggggct ctatgaaaca 4080
agaatcgacc tctctcagct cggtggagac agcagggctg accccaagaa gaagaggaag 4140
gtgtga 4146
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26 gRNA1
<400> 30
ggcaggctta aaggctaacc tgg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26 gRNA2
<400> 31
gactggagtt gcagatcacg agg 23
<210> 32
<211> 7695
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> Rosa26靶向载体
<220>
<221> misc_feature
<222> (195)..(195)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (230)..(230)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (380)..(380)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (3724)..(3724)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4213)..(4213)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4297)..(4297)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4874)..(4874)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4931)..(4931)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4953)..(4953)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4993)..(4993)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5644)..(5644)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6667)..(6667)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6769)..(6769)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7147)..(7147)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7562)..(7562)
<223> n是a、c、g或t
<400> 32
ccgcggcagg ccctccgagc gtggtggagc cgttctgtga gacagccggg tacgagtcgt 60
gacgctggaa ggggcaagcg ggtggtgggc aggaatgcgg tccgccctgc agcaaccgga 120
gggggaggga gaagggagcg gaaaagtctc caccggacgc ggccatggct cggggggggg 180
ggggcagcgg aggancgctt ccggccgacg tctcgtcgct gattggcttn ttttcctccc 240
gccgtgtgtg aaaacacaaa tggcgtgttt tggttggcgt aaggcgcctg tcagttaacg 300
gcagccggag tgcgcagccg ccggcagcct cgctctgccc actgggtggg gcgggaggta 360
ggtggggtga ggcgagctgn acgtgcgggc gcggtcggcc tctggcgggg cgggggaggg 420
gagggagggt cagcgaaagt agctcgcgcg cgagcggccg cccaccctcc ccttcctctg 480
ggggagtcgt tttacccgcc gccggccggg cctcgtcgtc tgattggctc tcggggccca 540
gaaaactggc ccttgccatt ggctcgtgtt cgtgcaagtt gagtccatcc gccggccagc 600
gggggcggcg aggaggcgct cccaggttcc ggccctcccc tcggccccgc gccgcagagt 660
ctggccgcgc gcccctgcgc aacgtggcag gaagcgcgcg ctgggggcgg ggacgggcag 720
tagggctgag cggctgcggg gcgggtgcaa gcacgtttcc gacttgagtt gcctcaagag 780
gggcgtgctg agccagacct ccatcgcgca ctccggggag tggagggaag gagcgagggc 840
tcagttgggc tgttttggag gcaggaagca cttgctctcc caaagtcgct ctgagttgtt 900
atcagtaagg gagctgcagt ggagtaggcg gggagaaggc cgcacccttc tccggagggg 960
ggaggggagt gttgcaatac ctttctggga gttctctgct gcctcctggc ttctgaggac 1020
cgccctgggc ctgggagaat cccttgcccc ctcttcccct cgtgatctgc aactccagtc 1080
tttctagtga attcggatcc ttaattaagg cctccgcgcc gggttttggc gcctcccgcg 1140
ggcgcccccc tcctcacggc gagcgctgcc acgtcagacg aagggcgcag cgagcgtcct 1200
gatccttccg cccggacgct caggacagcg gcccgctgct cataagactc ggccttagaa 1260
ccccagtatc agcagaagga cattttagga cgggacttgg gtgactctag ggcactggtt 1320
ttctttccag agagcggaac aggcgaggaa aagtagtccc ttctcggcga ttctgcggag 1380
ggatctccgt ggggcggtga acgccgatga ttatataagg acgcgccggg tgtggcacag 1440
ctagttccgt cgcagccggg atttgggtcg cggttcttgt ttgtggatcg ctgtgatcgt 1500
cacttggtct agacgccacc atggtgtcca agggcgagga ggtgatcaag gagttcatgc 1560
gcttcaaggt gcgcatggag ggctccatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg 1620
gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc 1680
ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc cccagttcat gtacggctcc aaggcctacg 1740
tgaagcaccc cgccgacatc cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt 1800
gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcctggtgac cgtgacccag gactcctccc 1860
tgcaggacgg caccctgatc tacaaggtga agatgcgcgg caccaacttc ccccccgacg 1920
gccccgtgat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc 1980
gcgacggcgt gctgaagggc gagatccacc aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact 2040
acctggtgga gttcaagacc atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact 2100
actacgtgga caccaagctg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc 2160
agtacgagcg ctccgagggc cgccaccacc tgttcctgac cggtgagggc agaggaagcc 2220
ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggcccttc cgggatgacc gagtacaagc 2280
ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg 2340
cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg 2400
tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg 2460
tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg 2520
cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc 2580
agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg 2640
ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc 2700
ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc 2760
gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg 2820
aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgaatctag gtcgacctgc 2880
agaagcttgc ctcgagcagc gctgctcgag agatctacgg gtggcatccc tgtgacccct 2940
ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa 3000
taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga 3060
ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct 3120
attgggaacc aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct 3180
gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga 3240
ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc 3300
tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat 3360
tacaggcgtg aaccactgct cccttccctg tccttctgat tttgtacccg ggactagaag 3420
atgggcggga gtcttctggg caggcttaaa ggctaacctg gtgtgtgggc gttgtcctgc 3480
aggggaattg aacaggtgta aaattggagg gacaagactt cccacagatt ttcggttttg 3540
tcgggaagtt ttttaatagg ggcaaatagg aaaatggagg ataggagtca tctggggttt 3600
atgcagcaaa actacaggta tattgcttgt atccgcctcg gagatttcca tgaggagata 3660
aagacatgtc acccgagttt atactctcct gcttagatcc tactacagta tgaaatacag 3720
tgtngcgagg tagactatgt aagcagattt aatcatttta aagagcccag tacttcatat 3780
ccatttctcc cgctccttct gcagccttat caaaaggtat ttagaacact cattttagcc 3840
ccattttcat ttattatact ggcttatcca acccctagac agagcattgg cattttccct 3900
ttcctgatct tagaagtctg atgactcatg aaaccagaca gattagttac atacaccaca 3960
aatcgaggct gtagctgggg cctcaacact gcagttcttt tataactcct tagtacactt 4020
tttgttgatc ctttgccttg atccttaatt ttcagtgtct atcacctctc ccgtcaggtg 4080
gtgttccaca tttgggccta ttctcagtcc agggagtttt acaacaatag atgtattgag 4140
aatccaacct aaagcttaac tttccactcc catgaatgcc tctctccttt ttctccatta 4200
taactgagct atnaccatta atggtttcag gtggatgtct cctcccccaa tatacctgat 4260
gtatctacat attgccaggc tgatatttta agacatnaaa ggtatatttc attattgagc 4320
cacatggtat tgattactgc tactaaaatt ttgtcattgt acacatctgt aaaaggtggt 4380
tccttttgga atgcaaagtt caggtgtttg ttgtctttcc tgacctaagg tcttgtgagc 4440
ttgtattttt tctatttaag cagtgctttc tcttggactg gcttgactca tggcattcta 4500
cacgttattg ctggtctaaa tgtgattttg ccaagcttct tcaggaccta taattttgct 4560
tgacttgtag ccaaacacaa gtaaaatgat taagcaacaa atgtatttgt gaagcttggt 4620
ttttaggttg ttgtgttgtg tgtgcttgtg ctctataata atactatcca ggggctggag 4680
aggtggctcg gagttcaaga gcacagactg ctcttccaga agtcctgagt tcaattccca 4740
gcaaccacat ggtggctcac aaccatctgt aatgggatct gatgccctct tctggtgtgt 4800
ctgaagacca caagtgtatt cacattaaat aaataatcct ccttcttctt cttttttttt 4860
ttttaaagag aatnctgtct ccagtagaat tactgaagta atgaaatact ttgtgtttgt 4920
tccaatatgg nagccaataa tcaaatactc ttnagcactg gaaatgtacc aaggaactat 4980
tttatttaag tgnactgtgg acagaggagc cataactgca gacttgtggg atacagaaga 5040
ccaatgcaga cttaatgtct tttctcttac actaagcaat aaagaaataa aaattgaact 5100
tctagtatcc tatttgttaa actgctagct ttactaactt ttgtgcttca tctatacaaa 5160
gctgaaagct aagtctgcag ccattactaa acatgaaagc aagtaatgat aattttggat 5220
ttcaaaaatg tagggccaga gtttagccag ccagtggtgg tgcttgcctt tatgccttaa 5280
tcccagcact ctggaggcag agacaggcag atctctgagt ttgagcccag cctggtctac 5340
acatcaagtt ctatctagga tagccaggaa tacacacaga aaccctgttg gggagggggg 5400
ctctgagatt tcataaaatt ataattgaag cattccctaa tgagccacta tggatgtggc 5460
taaatccgtc tacctttctg atgagatttg ggtattattt tttctgtctc tgctgttggt 5520
tgggtctttt gacactgtgg gctttcttaa agcctccttc cctgccatgt ggtctcttgt 5580
ttgctactaa cttcccatgg cttaaatggc atggcttttt gccttctaag ggcagctgct 5640
gagntttgca gcctgatttc cagggtgggg ttgggaaatc tttcaaacac taaaattgtc 5700
ctttaatttt tttttaaaaa atgggttata taataaacct cataaaatag ttatgaggag 5760
tgaggtggac taatattaat gagtccctcc cctataaaag agctattaag gctttttgtc 5820
ttatactaac ttttttttta aatgtggtat ctttagaacc aagggtctta gagttttagt 5880
atacagaaac tgttgcatcg cttaatcaga ttttctagtt tcaaatccag agaatccaaa 5940
ttcttcacag ccaaagtcaa attaagaatt tctgacttta atgttatttg ctactgtgaa 6000
tataaaatga tagcttttcc tgaggcaggg tctcactatg tatctctgcc tgatctgcaa 6060
caagatatgt agactaaagt tctgcctgct tttgtctcct gaatactaag gttaaaatgt 6120
agtaatactt ttggaacttg caggtcagat tcttttatag gggacacact aagggagctt 6180
gggtgatagt tggtaaatgt gtttaagtga tgaaaacttg aattattatc accgcaacct 6240
actttttaaa aaaaaaagcc aggcctgtta gagcatgcta agggatccct aggacttgct 6300
gagcacacaa gagtagtact tggcaggctc ctggtgagag catatttcaa aaaacaaggc 6360
agacaaccaa gaaactacag taaggttacc tgtctttaac catctgcata tacacaggga 6420
tattaaaata ttccaaataa tatttcattc aagttttccc ccatcaaatt gggacatgga 6480
tttctccggt gaataggcag agttggaaac taaacaaatg ttggttttgt gatttgtgaa 6540
attgttttca agtgatagtt aaagcccatg agatacagaa caaagctgct atttcgaggt 6600
ctcttggtta tactcagaag cacttctttg ggtttccctg cactatcctg atcatgtgct 6660
aggcctncct taggctgatt gttgttcaaa taacttaagt ttcctgtcag gtgatgtcat 6720
atgatttcat atatcaaggc aaaacatgtt atatatgtta aacatttgna cttaatgtga 6780
aagttaggtc tttgtgggtt ttgattttaa tttcaaaacc tgagctaaat aagtcatttt 6840
acatgtctta catttggtga attgtatatt gtggtttgca ggcaagactc tctgacctag 6900
taaccctcct atagagcact ttgctgggtc acaagtctag gagtcaagca tttcaccttg 6960
aagttgagac gttttgttag tgtatactag ttatatgttg gaggacatgt ttatccagaa 7020
gatattcagg actatttttg actgggctaa ggaattgatt ctgattagca ctgttagtga 7080
gcattgagtg gcctttaggc ttgaattgga gtcacttgta tatctcaaat aatgctggcc 7140
ttttttnaaa agcccttgtt ctttatcacc ctgttttcta cataattttt gttcaaagaa 7200
atacttgttt ggatctcctt ttgacaacaa tagcatgttt tcaagccata ttttttttcc 7260
tttttttttt tttttttggt ttttcgagac agggtttctc tgtatagccc tggctgtcct 7320
ggaactcact ttgtagacca ggctggcctc gaactcagaa atccgcctgc ctctgcctcc 7380
tgagtgccgg gattaaaggc gtgcaccacc acgcctggct aagttggata ttttgtatat 7440
aactataacc aatactaact ccactgggtg gatttttaat tcagtcagta gtcttaagtg 7500
gtctttattg gcccttatta aaatctactg ttcactctaa cagaggctgt tggactagtg 7560
gnactaagca acttcctacg gatatactag cagataaggg tcagggatag aaactagtct 7620
agcgttttgt atacctacca gcttatacta ccttgttctg atagaaatat ttaggacatc 7680
tagcttatcg atccg 7695
<210> 33
<211> 9435
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 具有GGBP的Rosa26靶向载体
<220>
<221> misc_feature
<222> (195)..(195)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (230)..(230)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (380)..(380)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5464)..(5464)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5953)..(5953)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6037)..(6037)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6614)..(6614)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6671)..(6671)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6693)..(6693)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6733)..(6733)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7384)..(7384)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8407)..(8407)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8509)..(8509)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8887)..(8887)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (9302)..(9302)
<223> n是a、c、g或t
<400> 33
ccgcggcagg ccctccgagc gtggtggagc cgttctgtga gacagccggg tacgagtcgt 60
gacgctggaa ggggcaagcg ggtggtgggc aggaatgcgg tccgccctgc agcaaccgga 120
gggggaggga gaagggagcg gaaaagtctc caccggacgc ggccatggct cggggggggg 180
ggggcagcgg aggancgctt ccggccgacg tctcgtcgct gattggcttn ttttcctccc 240
gccgtgtgtg aaaacacaaa tggcgtgttt tggttggcgt aaggcgcctg tcagttaacg 300
gcagccggag tgcgcagccg ccggcagcct cgctctgccc actgggtggg gcgggaggta 360
ggtggggtga ggcgagctgn acgtgcgggc gcggtcggcc tctggcgggg cgggggaggg 420
gagggagggt cagcgaaagt agctcgcgcg cgagcggccg cccaccctcc ccttcctctg 480
ggggagtcgt tttacccgcc gccggccggg cctcgtcgtc tgattggctc tcggggccca 540
gaaaactggc ccttgccatt ggctcgtgtt cgtgcaagtt gagtccatcc gccggccagc 600
gggggcggcg aggaggcgct cccaggttcc ggccctcccc tcggccccgc gccgcagagt 660
ctggccgcgc gcccctgcgc aacgtggcag gaagcgcgcg ctgggggcgg ggacgggcag 720
tagggctgag cggctgcggg gcgggtgcaa gcacgtttcc gacttgagtt gcctcaagag 780
gggcgtgctg agccagacct ccatcgcgca ctccggggag tggagggaag gagcgagggc 840
tcagttgggc tgttttggag gcaggaagca cttgctctcc caaagtcgct ctgagttgtt 900
atcagtaagg gagctgcagt ggagtaggcg gggagaaggc cgcacccttc tccggagggg 960
ggaggggagt gttgcaatac ctttctggga gttctctgct gcctcctggc ttctgaggac 1020
cgccctgggc ctgggagaat cccttgcccc ctcttcccct cgtgatctgc aactccagtc 1080
tttctagtga attcggatcc ttaattaagg cctccgcgcc gggttttggc gcctcccgcg 1140
ggcgcccccc tcctcacggc gagcgctgcc acgtcagacg aagggcgcag cgagcgtcct 1200
gatccttccg cccggacgct caggacagcg gcccgctgct cataagactc ggccttagaa 1260
ccccagtatc agcagaagga cattttagga cgggacttgg gtgactctag ggcactggtt 1320
ttctttccag agagcggaac aggcgaggaa aagtagtccc ttctcggcga ttctgcggag 1380
ggatctccgt ggggcggtga acgccgatga ttatataagg acgcgccggg tgtggcacag 1440
ctagttccgt cgcagccggg atttgggtcg cggttcttgt ttgtggatcg ctgtgatcgt 1500
cacttggtct agaggatccg ggccgcatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg 1560
tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg 1620
gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg 1680
gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctggggc gtgcagtgct 1740
tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag 1800
gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg 1860
aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 1920
aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacatcagc cacaacgtct 1980
atatcaccgc cgacaagcag aagaacggca tcaaggccaa cttcaagatc cgccacaaca 2040
tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg 2100
gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc 2160
ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc 2220
tcggcatgga cgagctgtac aagggtggta ccggaggcgc cgctgatact cgcattggtg 2280
taacaatcta taagtacgac gataacttta tgtctgtagt gcgcaaggct attgagcaag 2340
atgcgaaagc cgcgccagat gttcagctgc tgatgaatga ttctcagaat gaccagtcca 2400
agcagaacga tcagatcgac gtattgctgg cgaaaggggt gaaggcactg gcaatcaacc 2460
tggttgaccc ggcagctgcg ggtacggtga ttgagaaagc gcgtgggcaa aacgtgccgg 2520
tggttttctt caacaaagaa ccgtctcgta aggcgctgga tagctacgac aaagcctact 2580
acgttggcac tgactccaaa gagtccggca ttattcaagg cgatttgatt gctaaacact 2640
gggcggcgaa tcagggttgg gatctgaaca aagacggtca gattcagttc gtactgctga 2700
aaggtgaacc gggccatccg gatgcagaag cacgtaccac ttacgtgatt aaagaattga 2760
acgataaagg catcaaaact gaacagttac agttagatac cgcaatgtgg gacaccgctc 2820
aggcgaaaga taagatggac gcctggctgt ctggcccgaa cgccaacaaa atcgaagtgg 2880
ttatcgccaa caacgatcgg atggcaatgg gcgcggttga agcgctgaaa gcacacaaca 2940
agtccagcat tccggtgttt ggcgtcgatg cgtcgccaga agcgctggcg ctggtgaaat 3000
ccggtgcact ggcgggcacc gtactgaacg atgctaacaa ccaggcgaaa gcgacctttg 3060
atctggcgaa aaacctggcc gatggtaaag gtgcggctga tggcaccaac tggaaaatcg 3120
acaacaaagt ggtccgcgta ccttatgttg gcgtagataa agacaacctg gctgaattca 3180
gcaagaaagg cgccggtacc ggtggaatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg 3240
tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg 3300
gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg 3360
gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccacctt cggctacggc ctgcagtgct 3420
tcgcccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag 3480
gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg 3540
aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 3600
aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct 3660
atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca 3720
tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg 3780
gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagctacca gtccgccctg agcaaagacc 3840
ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc 3900
tcggcatgga cgagctgtac aagggaggtg gcggaagctc cggtgagggc agaggaagcc 3960
ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggcccttc cgggatgacc gagtacaagc 4020
ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg 4080
cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg 4140
tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg 4200
tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg 4260
cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc 4320
agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg 4380
ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc 4440
ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc 4500
gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg 4560
aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgaatctag gtcgacctgc 4620
agaagcttgc ctcgagcagc gctgctcgag agatctacgg gtggcatccc tgtgacccct 4680
ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa 4740
taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga 4800
ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct 4860
attgggaacc aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct 4920
gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga 4980
ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc 5040
tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat 5100
tacaggcgtg aaccactgct cccttccctg tccttctgat tttgtacccg ggactagaag 5160
atgggcggga gtcttctggg caggcttaaa ggctaacctg gtgtgtgggc gttgtcctgc 5220
aggggaattg aacaggtgta aaattggagg gacaagactt cccacagatt ttcggttttg 5280
tcgggaagtt ttttaatagg ggcaaatagg aaaatggagg ataggagtca tctggggttt 5340
atgcagcaaa actacaggta tattgcttgt atccgcctcg gagatttcca tgaggagata 5400
aagacatgtc acccgagttt atactctcct gcttagatcc tactacagta tgaaatacag 5460
tgtngcgagg tagactatgt aagcagattt aatcatttta aagagcccag tacttcatat 5520
ccatttctcc cgctccttct gcagccttat caaaaggtat ttagaacact cattttagcc 5580
ccattttcat ttattatact ggcttatcca acccctagac agagcattgg cattttccct 5640
ttcctgatct tagaagtctg atgactcatg aaaccagaca gattagttac atacaccaca 5700
aatcgaggct gtagctgggg cctcaacact gcagttcttt tataactcct tagtacactt 5760
tttgttgatc ctttgccttg atccttaatt ttcagtgtct atcacctctc ccgtcaggtg 5820
gtgttccaca tttgggccta ttctcagtcc agggagtttt acaacaatag atgtattgag 5880
aatccaacct aaagcttaac tttccactcc catgaatgcc tctctccttt ttctccatta 5940
taactgagct atnaccatta atggtttcag gtggatgtct cctcccccaa tatacctgat 6000
gtatctacat attgccaggc tgatatttta agacatnaaa ggtatatttc attattgagc 6060
cacatggtat tgattactgc tactaaaatt ttgtcattgt acacatctgt aaaaggtggt 6120
tccttttgga atgcaaagtt caggtgtttg ttgtctttcc tgacctaagg tcttgtgagc 6180
ttgtattttt tctatttaag cagtgctttc tcttggactg gcttgactca tggcattcta 6240
cacgttattg ctggtctaaa tgtgattttg ccaagcttct tcaggaccta taattttgct 6300
tgacttgtag ccaaacacaa gtaaaatgat taagcaacaa atgtatttgt gaagcttggt 6360
ttttaggttg ttgtgttgtg tgtgcttgtg ctctataata atactatcca ggggctggag 6420
aggtggctcg gagttcaaga gcacagactg ctcttccaga agtcctgagt tcaattccca 6480
gcaaccacat ggtggctcac aaccatctgt aatgggatct gatgccctct tctggtgtgt 6540
ctgaagacca caagtgtatt cacattaaat aaataatcct ccttcttctt cttttttttt 6600
ttttaaagag aatnctgtct ccagtagaat tactgaagta atgaaatact ttgtgtttgt 6660
tccaatatgg nagccaataa tcaaatactc ttnagcactg gaaatgtacc aaggaactat 6720
tttatttaag tgnactgtgg acagaggagc cataactgca gacttgtggg atacagaaga 6780
ccaatgcaga cttaatgtct tttctcttac actaagcaat aaagaaataa aaattgaact 6840
tctagtatcc tatttgttaa actgctagct ttactaactt ttgtgcttca tctatacaaa 6900
gctgaaagct aagtctgcag ccattactaa acatgaaagc aagtaatgat aattttggat 6960
ttcaaaaatg tagggccaga gtttagccag ccagtggtgg tgcttgcctt tatgccttaa 7020
tcccagcact ctggaggcag agacaggcag atctctgagt ttgagcccag cctggtctac 7080
acatcaagtt ctatctagga tagccaggaa tacacacaga aaccctgttg gggagggggg 7140
ctctgagatt tcataaaatt ataattgaag cattccctaa tgagccacta tggatgtggc 7200
taaatccgtc tacctttctg atgagatttg ggtattattt tttctgtctc tgctgttggt 7260
tgggtctttt gacactgtgg gctttcttaa agcctccttc cctgccatgt ggtctcttgt 7320
ttgctactaa cttcccatgg cttaaatggc atggcttttt gccttctaag ggcagctgct 7380
gagntttgca gcctgatttc cagggtgggg ttgggaaatc tttcaaacac taaaattgtc 7440
ctttaatttt tttttaaaaa atgggttata taataaacct cataaaatag ttatgaggag 7500
tgaggtggac taatattaat gagtccctcc cctataaaag agctattaag gctttttgtc 7560
ttatactaac ttttttttta aatgtggtat ctttagaacc aagggtctta gagttttagt 7620
atacagaaac tgttgcatcg cttaatcaga ttttctagtt tcaaatccag agaatccaaa 7680
ttcttcacag ccaaagtcaa attaagaatt tctgacttta atgttatttg ctactgtgaa 7740
tataaaatga tagcttttcc tgaggcaggg tctcactatg tatctctgcc tgatctgcaa 7800
caagatatgt agactaaagt tctgcctgct tttgtctcct gaatactaag gttaaaatgt 7860
agtaatactt ttggaacttg caggtcagat tcttttatag gggacacact aagggagctt 7920
gggtgatagt tggtaaatgt gtttaagtga tgaaaacttg aattattatc accgcaacct 7980
actttttaaa aaaaaaagcc aggcctgtta gagcatgcta agggatccct aggacttgct 8040
gagcacacaa gagtagtact tggcaggctc ctggtgagag catatttcaa aaaacaaggc 8100
agacaaccaa gaaactacag taaggttacc tgtctttaac catctgcata tacacaggga 8160
tattaaaata ttccaaataa tatttcattc aagttttccc ccatcaaatt gggacatgga 8220
tttctccggt gaataggcag agttggaaac taaacaaatg ttggttttgt gatttgtgaa 8280
attgttttca agtgatagtt aaagcccatg agatacagaa caaagctgct atttcgaggt 8340
ctcttggtta tactcagaag cacttctttg ggtttccctg cactatcctg atcatgtgct 8400
aggcctncct taggctgatt gttgttcaaa taacttaagt ttcctgtcag gtgatgtcat 8460
atgatttcat atatcaaggc aaaacatgtt atatatgtta aacatttgna cttaatgtga 8520
aagttaggtc tttgtgggtt ttgattttaa tttcaaaacc tgagctaaat aagtcatttt 8580
acatgtctta catttggtga attgtatatt gtggtttgca ggcaagactc tctgacctag 8640
taaccctcct atagagcact ttgctgggtc acaagtctag gagtcaagca tttcaccttg 8700
aagttgagac gttttgttag tgtatactag ttatatgttg gaggacatgt ttatccagaa 8760
gatattcagg actatttttg actgggctaa ggaattgatt ctgattagca ctgttagtga 8820
gcattgagtg gcctttaggc ttgaattgga gtcacttgta tatctcaaat aatgctggcc 8880
ttttttnaaa agcccttgtt ctttatcacc ctgttttcta cataattttt gttcaaagaa 8940
atacttgttt ggatctcctt ttgacaacaa tagcatgttt tcaagccata ttttttttcc 9000
tttttttttt tttttttggt ttttcgagac agggtttctc tgtatagccc tggctgtcct 9060
ggaactcact ttgtagacca ggctggcctc gaactcagaa atccgcctgc ctctgcctcc 9120
tgagtgccgg gattaaaggc gtgcaccacc acgcctggct aagttggata ttttgtatat 9180
aactataacc aatactaact ccactgggtg gatttttaat tcagtcagta gtcttaagtg 9240
gtctttattg gcccttatta aaatctactg ttcactctaa cagaggctgt tggactagtg 9300
gnactaagca acttcctacg gatatactag cagataaggg tcagggatag aaactagtct 9360
agcgttttgt atacctacca gcttatacta ccttgttctg atagaaatat ttaggacatc 9420
tagcttatcg atccg 9435
<210> 34
<211> 747
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> IgGFc (小鼠)
<400> 34
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
atatcggcca tggttagatc tggttgtaag ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca 120
tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca ccattactct gactcctaag 180
gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt 240
gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc 300
actttccgct cagtcagtga acttcccatc atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag 360
ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa 420
accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg 480
gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg ataacagact tcttccctga agacattact 540
gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg gagaactaca agaacactca gcccatcatg 600
gacacagatg gctcttactt cgtctacagc aagctcaatg tgcagaagag caactgggag 660
gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta catgagggcc tgcacaacca ccatactgag 720
aagagcctct cccactctcc tggtaaa 747
<210> 35
<211> 195
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 具有信号的S2-VaTx3
<400> 35
atgcgccgcg gccgcctgct ggagatcgcc ctgggcttca ccgtgctgct ggcctcctac 60
acctcccacg gcgccgacgc cgctgaattc gagtgccgct ggtacctggg cggctgcaag 120
gaggactccg agtgctgcga gcacctgcag tgccactcct actgggagtg gtgcctgtgg 180
gacggctcct tctaa 195
<210> 36
<211> 324
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 具有信号的S2-DkTx
<400> 36
atgcgccgcg gccgcctgct ggagatcgcc ctgggcttca ccgtgctgct ggcctcctac 60
acctcccacg gcgccgacgc cgctgaattc ggatctgact gcgccaagga gggcgaggtg 120
tgctcctggg gcaagaagtg ctgcgacctg gacaacttct actgccccat ggagttcatc 180
ccccactgca agaagtacaa gccctacgtg cccgtgacca ccaactgcgc caaggagggc 240
gaggtgtgcg gctggggctc caagtgctgc cacggcctgg actgccccct ggccttcatc 300
ccctactgcg agaagtaccg ctaa 324
<210> 37
<211> 873
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> VatX3靶载体盒: 信号->VaTx3->Furin->IgGFc
<400> 37
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
ggatctgagt gccgctggta cctgggcggc tgcaaggagg actccgagtg ctgcgagcac 120
ctgcagtgcc actcctactg ggagtggtgc ctgtgggacg gctccttccg acggaagcga 180
gggatatcgg ccatggttag atctggttgt aagccttgca tatgtacagt cccagaagta 240
tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct 300
aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg 360
tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac 420
agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc atcatgcacc aggactggct caatggcaag 480
gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc 540
aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag 600
atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc atgataacag acttcttccc tgaagacatt 660
actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca gcggagaact acaagaacac tcagcccatc 720
atggacacag atggctctta cttcgtctac agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg 780
gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact 840
gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa taa 873
<210> 38
<211> 993
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> DkTx靶载体盒: 信号->DkTx->Furin->IgGFc
<400> 38
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
ggatctgact gcgccaagga gggcgaggtg tgctcctggg gcaagaagtg ctgcgacctg 120
gacaacttct actgccccat ggagttcatc ccccactgca agaagtacaa gccctacgtg 180
cccgtgacca ccaactgcgc caaggagggc gaggtgtgcg gctggggctc caagtgctgc 240
cacggcctgg actgccccct ggccttcatc ccctactgcg agaagtaccg ccggaagcga 300
gggatatcgg ccatggttag atctggttgt aagccttgca tatgtacagt cccagaagta 360
tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct 420
aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg 480
tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac 540
agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc atcatgcacc aggactggct caatggcaag 600
gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag 720
atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc atgataacag acttcttccc tgaagacatt 780
actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca gcggagaact acaagaacac tcagcccatc 840
atggacacag atggctctta cttcgtctac agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg 900
gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact 960
gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa taa 993
<210> 39
<211> 681
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> IgGFc (人)
<400> 39
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 40
<211> 3778
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> AAVSI靶载体盒: 信号
<400> 40
tgctttctct gaccagcatt ctctcccctg ggcctgtgcc gctttctgtc tgcagcttgt 60
ggcctgggtc acctctacgg ctggcccaga tccttccctg ccgcctcctt caggttccgt 120
cttcctccac tccctcttcc ccttgctctc tgctgtgttg ctgcccaagg atgctctttc 180
cggagcactt ccttctcggc gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg 240
tctgggtcct ctccgggcat ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct 300
gggttccctt ttccttctcc ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct 360
tctccgacgg atgtctccct tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc 420
gtttttctgg acaaccccaa agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc 480
ttgctttctt tgcctggaca ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt 540
catttgggca gctcccctac cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc 600
ctgtcatggc atcttccagg ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc 660
ccctatgtcc acttcaggac agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct 720
gggaccacct tatattccca gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct 780
gtcccctcca ccccacagtg gggcaagctt ctcgagttgg ggttgcgcct tttccaaggc 840
agccctgggt ttgcgcaggg acgcggctgc tctgggcgtg gttccgggaa acgcagcggc 900
gccgaccctg ggtctcgcac attcttcacg tccgttcgca gcgtcacccg gatcttcgcc 960
gctacccttg tgggcccccc ggcgacgctt cctgctccgc ccctaagtcg ggaaggttcc 1020
ttgcggttcg cggcgtgccg gacgtgacaa acggaagccg cacgtctcac tagtaccctc 1080
gcagacggac agcgccaggg agcaatggca gcgcgccgac cgcgatgggc tgtggccaat 1140
agcggctgct cagcagggcg cgccgagagc agcggccggg aaggggcggt gcgggaggcg 1200
gggtgtgggg cggtagtgtg ggccctgttc ctgcccgcgc ggtgttccgc attctgcaag 1260
cctccggagc gcacgtcggc agtcggctcc ctcgttgacc gaatcaccga cctctctccc 1320
cagggtctag acgccaccat ggtgtccaag ggcgaggagg tgatcaagga gttcatgcgc 1380
ttcaaggtgc gcatggaggg ctccatgaac ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc 1440
gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc gccaagctga aggtgaccaa gggcggcccc 1500
ctgcccttcg cctgggacat cctgtccccc cagttcatgt acggctccaa ggcctacgtg 1560
aagcaccccg ccgacatccc cgactacaag aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg 1620
gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc ctggtgaccg tgacccagga ctcctccctg 1680
caggacggca ccctgatcta caaggtgaag atgcgcggca ccaacttccc ccccgacggc 1740
cccgtgatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcca ccgagcgcct gtacccccgc 1800
gacggcgtgc tgaagggcga gatccaccag gccctgaagc tgaaggacgg cggccactac 1860
ctggtggagt tcaagaccat ctacatggcc aagaagcccg tgcagctgcc cggctactac 1920
tacgtggaca ccaagctgga catcacctcc cacaacgagg actacaccat cgtggagcag 1980
tacgagcgct ccgagggccg ccaccacctg ttcctgggat ccgagggcag aggaagcctt 2040
ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggcccttccg ggatgaccga gtacaagccc 2100
acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg 2160
ttcgccgact accccgccac gcgccacacc gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc 2220
accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc 2280
gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg 2340
gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag 2400
caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc 2460
accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc 2520
ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc 2580
aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa 2640
ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct gaatctaggt cgacattcta 2700
cttggtaccc tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 2760
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 2820
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 2880
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggaagctt 2940
tactagggac aggattggtg acagaaaagc cccatcctta ggcctcctcc ttcctagtct 3000
cctgatattg ggtctaaccc ccacctcctg ttaggcagat tccttatctg gtgacacacc 3060
cccatttcct ggagccatct ctctccttgc cagaacctct aaggtttgct tacgatggag 3120
ccagagagga tcctgggagg gagagcttgg cagggggtgg gagggaaggg ggggatgcgt 3180
gacctgcccg gttctcagtg gccaccctgc gctaccctct cccagaacct gagctgctct 3240
gacgcggctg tctggtgcgt ttcactgatc ctggtgctgc agcttcctta cacttcccaa 3300
gaggagaagc agtttggaaa aacaaaatca gaataagttg gtcctgagtt ctaactttgg 3360
ctcttcacct ttctagtccc caatttatat tgttcctccg tgcgtcagtt ttacctgtga 3420
gataaggcca gtagccagcc ccgtcctggc agggctgtgg tgaggagggg ggtgtccgtg 3480
tggaaaactc cctttgtgag aatggtgcgt cctaggtgtt caccaggtcg tggccgcctc 3540
tactcccttt ctctttctcc atccttcttt ccttaaagag tccccagtgc tatctgggac 3600
atattcctcc gcccagagca gggtcccgct tccctaaggc cctgctctgg gcttctgggt 3660
ttgagtcctt ggcaagccca ggagaggcgc tcaggcttcc ctgtccccct tcctcgtcca 3720
ccatctcatg cccctggctc tcctgcccct tccctacagg ggttcctggc tctgctct 3778
<210> 41
<211> 602
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 人突变BChE
<400> 41
Met His Ser Lys Val Thr Ile Ile Cys Ile Arg Phe Leu Phe Trp Phe
1 5 10 15
Leu Leu Leu Cys Met Leu Ile Gly Lys Ser His Thr Glu Asp Asp Ile
20 25 30
Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met Asn Leu Thr Val
35 40 45
Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Gln Pro
50 55 60
Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser Leu Thr Lys Trp
65 70 75 80
Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser Cys Cys Gln Asn
85 90 95
Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu Met Trp Asn Pro
100 105 110
Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Trp Ile Pro
115 120 125
Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp Ile Tyr Gly Gly
130 135 140
Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr Asp Gly Lys Phe
145 150 155 160
Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met Asn Tyr Arg Val
165 170 175
Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro Glu Ala Pro Gly
180 185 190
Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Lys
195 200 205
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val Thr Leu Phe Gly
210 215 220
Glu Ser Ser Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu Leu Ser Pro Gly
225 230 235 240
Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser Gly Ser Ala Asn
245 250 255
Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg Asn Arg Thr Leu
260 265 270
Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn Glu Thr Glu Ile
275 280 285
Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile Leu Leu Asn Glu
290 295 300
Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Ala Leu Gly Val Asn Phe Gly Pro
305 310 315 320
Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp Ile Leu Leu Glu
325 330 335
Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly Val Asn Lys Asp
340 345 350
Glu Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp
355 360 365
Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu Gly Leu Lys Ile
370 375 380
Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser Ile Leu Phe His
385 390 395 400
Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn Tyr Arg Glu Ala
405 410 415
Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys Pro Ala Leu Glu
420 425 430
Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala Phe Phe Tyr Tyr
435 440 445
Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu Trp Met Gly Val
450 455 460
Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu Pro Leu Glu Arg
465 470 475 480
Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser Arg Ser Ile Val
485 490 495
Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Asn Glu Thr Gln
500 505 510
Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr Glu Gln Lys Tyr
515 520 525
Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr Lys Leu Arg Ala
530 535 540
Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys Val Leu Glu Met
545 550 555 560
Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys Ala Gly Phe His
565 570 575
Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln Phe Asn Asp Tyr
580 585 590
Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
595 600
<210> 42
<211> 1806
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的核酸序列
<400> 42
atgcacagca aggtgaccat catctgcatc aggttcctgt tctggttcct gctgctgtgc 60
atgctgatcg gcaagagcca caccgaggac gacatcatca tcgccaccaa gaacggcaag 120
gtgaggggca tgaacctgac cgtgttcggc ggcaccgtga ccgccttcct gggcatcccc 180
tacgcccagc cccccctggg caggctgagg ttcaagaagc cccagagcct gaccaagtgg 240
agcgacatct ggaacgccac caagtacgcc aacagctgct gccagaacat cgaccagagc 300
ttccccggct tccacggcag cgagatgtgg aaccccaaca ccgacctgag cgaggactgc 360
ctgtacctga acgtgtggat ccccgccccc aagcccaaga acgccaccgt gctgatctgg 420
atctacggcg gcggcttcca gaccggcacc agcagcctgc acgtgtacga cggcaagttc 480
ctggccaggg tggagagggt gatcgtggtg agcatgaact acagggtggg cgccctgggc 540
ttcctggccc tgcccggcaa ccccgaggcc cccggcaaca tgggcctgtt cgaccagcag 600
ctggccctgc agtgggtgca gaagaacatc gccgccttcg gcggcaaccc caagagcgtg 660
accctgttcg gcgagagcag cggcgccgcc agcgtgagcc tgcacctgct gagccccggc 720
agccacagcc tgttcaccag ggccatcctg cagagcggca gcgccaacgc cccctgggcc 780
gtgaccagcc tgtacgaggc caggaacagg accctgaacc tggccaagct gaccggctgc 840
agcagggaga acgagaccga gatcatcaag tgcctgagga acaaggaccc ccaggagatc 900
ctgctgaacg aggccttcgt ggtgccctac ggcaccgccc tgggcgtgaa cttcggcccc 960
accgtggacg gcgacttcct gaccgacatg cccgacatcc tgctggagct gggccagttc 1020
aagaagaccc agatcctggt gggcgtgaac aaggacgagg gcacctggtt cctggtgggc 1080
ggcgcccccg gcttcagcaa ggacaacaac agcatcatca ccaggaagga gttccaggag 1140
ggcctgaaga tcttcttccc cggcgtgagc gagttcggca aggagagcat cctgttccac 1200
tacaccgact gggtggacga ccagaggccc gagaactaca gggaggccct gggcgacgtg 1260
gtgggcgact acaacttcat ctgccccgcc ctggagttca ccaagaagtt cagcgagtgg 1320
ggcaacaacg ccttcttcta ctacttcgag cacaggagca gcaagctgcc ctggcccgag 1380
tggatgggcg tgatgcacgg ctacgagatc gagttcgtgt tcggcctgcc cctggagagg 1440
agggacaact acaccaaggc cgaggagatc ctgagcagga gcatcgtgaa gaggtgggcc 1500
aacttcgcca agtacggcaa ccccaacgag acccagaaca acagcaccag ctggcccgtg 1560
ttcaagagca ccgagcagaa gtacctgacc ctgaacaccg agagcaccag gatcatgacc 1620
aagctgaggg cccagcagtg caggttctgg accagcttct tccccaaggt gctggagatg 1680
accggcaaca tcgacgaggc cgagtgggag tggaaggccg gcttccacag gtggaacaac 1740
tacatgatgg actggaagaa ccagttcaac gactacacca gcaagaagga gagctgcgtg 1800
ggcctg 1806
<210> 43
<211> 603
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 小鼠突变BChE
<400> 43
Met Gln Thr Gln His Thr Lys Val Thr Gln Thr His Phe Leu Leu Trp
1 5 10 15
Ile Leu Leu Leu Cys Met Pro Phe Gly Lys Ser His Thr Glu Glu Asp
20 25 30
Phe Ile Ile Thr Thr Lys Thr Gly Arg Val Arg Gly Leu Ser Met Pro
35 40 45
Val Leu Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Gln
50 55 60
Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Pro Leu Asn Lys
65 70 75 80
Trp Pro Asp Ile His Asn Ala Thr Gln Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr Gln
85 90 95
Asn Ile Asp Gln Ala Phe Pro Gly Phe Gln Gly Ser Glu Met Trp Asn
100 105 110
Pro Asn Thr Asn Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Trp Ile
115 120 125
Pro Val Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Met Val Trp Ile Tyr Gly
130 135 140
Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu Pro Val Tyr Asp Gly Lys
145 150 155 160
Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met Asn Tyr Arg
165 170 175
Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Phe Pro Gly Asn Pro Asp Ala Pro
180 185 190
Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln
195 200 205
Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Ile Thr Ile Phe
210 215 220
Gly Glu Ser Ser Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu Leu Cys Pro
225 230 235 240
Gln Ser Tyr Pro Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Glu Ser Gly Ser Ala
245 250 255
Asn Ala Pro Trp Ala Val Lys His Pro Glu Glu Ala Arg Asn Arg Thr
260 265 270
Leu Thr Leu Ala Lys Phe Thr Gly Cys Ser Lys Glu Asn Glu Met Glu
275 280 285
Met Ile Lys Cys Leu Arg Ser Lys Asp Pro Gln Glu Ile Leu Arg Asn
290 295 300
Glu Arg Phe Val Leu Pro Ser Asp Ser Ala Leu Gly Ile Asn Phe Gly
305 310 315 320
Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro His Thr Leu Leu
325 330 335
Gln Leu Gly Lys Val Lys Lys Ala Gln Ile Leu Val Gly Val Asn Lys
340 345 350
Asp Glu Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys
355 360 365
Asp Asn Asp Ser Leu Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu Gly Leu Asn
370 375 380
Met Tyr Phe Pro Gly Val Ser Arg Leu Gly Lys Glu Ala Val Leu Phe
385 390 395 400
Tyr Tyr Val Asp Trp Leu Gly Glu Gln Ser Pro Glu Val Tyr Arg Asp
405 410 415
Ala Leu Asp Asp Val Ile Gly Asp Tyr Asn Ile Ile Cys Pro Ala Leu
420 425 430
Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ala Glu Leu Glu Asn Asn Ala Phe Phe Tyr
435 440 445
Phe Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu Trp Met Gly
450 455 460
Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu Pro Leu Gly
465 470 475 480
Arg Arg Val Asn Tyr Thr Arg Ala Glu Glu Ile Phe Ser Arg Ser Ile
485 490 495
Met Lys Thr Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly His Pro Asn Gly Thr
500 505 510
Gln Gly Asn Ser Thr Met Trp Pro Val Phe Thr Ser Thr Glu Gln Lys
515 520 525
Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Lys Ser Lys Ile Tyr Ser Lys Leu Arg
530 535 540
Ala Pro Gln Cys Gln Phe Trp Arg Leu Phe Phe Pro Lys Val Leu Glu
545 550 555 560
Met Thr Gly Asp Ile Asp Glu Thr Glu Gln Glu Trp Lys Ala Gly Phe
565 570 575
His Arg Trp Ser Asn Tyr Met Met Asp Trp Gln Asn Gln Phe Asn Asp
580 585 590
Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Thr Ala Leu
595 600
<210> 44
<211> 1809
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 43的氨基酸序列的核酸序列
<400> 44
atgcagaccc agcacaccaa ggtgacccag acccacttcc tgctgtggat cctgctgctg 60
tgcatgccct tcggcaagag ccacaccgag gaggacttca tcatcaccac caagaccggc 120
agggtgaggg gcctgagcat gcccgtgctg ggcggcaccg tgaccgcctt cctgggcatc 180
ccctacgccc agccccccct gggcagcctg aggttcaaga agccccagcc cctgaacaag 240
tggcccgaca tccacaacgc cacccagtac gccaacagct gctaccagaa catcgaccag 300
gccttccccg gcttccaggg cagcgagatg tggaacccca acaccaacct gagcgaggac 360
tgcctgtacc tgaacgtgtg gatccccgtg cccaagccca agaacgccac cgtgatggtg 420
tggatctacg gcggcggctt ccagaccggc accagcagcc tgcccgtgta cgacggcaag 480
ttcctggcca gggtggagag ggtgatcgtg gtgagcatga actacagggt gggcgccctg 540
ggcttcctgg ccttccccgg caaccccgac gcccccggca acatgggcct gttcgaccag 600
cagctggccc tgcagtgggt gcagaggaac atcgccgcct tcggcggcaa ccccaagagc 660
atcaccatct tcggcgagag cagcggcgcc gccagcgtga gcctgcacct gctgtgcccc 720
cagagctacc ccctgttcac cagggccatc ctggagagcg gcagcgccaa cgccccctgg 780
gccgtgaagc accccgagga ggccaggaac aggaccctga ccctggccaa gttcaccggc 840
tgcagcaagg agaacgagat ggagatgatc aagtgcctga ggagcaagga cccccaggag 900
atcctgagga acgagaggtt cgtgctgccc agcgacagcg ccctgggcat caacttcggc 960
cccaccgtgg acggcgactt cctgaccgac atgccccaca ccctgctgca gctgggcaag 1020
gtgaagaagg cccagatcct ggtgggcgtg aacaaggacg agggcacctg gttcctggtg 1080
ggcggcgccc ccggcttcag caaggacaac gacagcctga tcaccaggaa ggagttccag 1140
gagggcctga acatgtactt ccccggcgtg agcaggctgg gcaaggaggc cgtgctgttc 1200
tactacgtgg actggctggg cgagcagagc cccgaggtgt acagggacgc cctggacgac 1260
gtgatcggcg actacaacat catctgcccc gccctggagt tcaccaagaa gttcgccgag 1320
ctggagaaca acgccttctt ctacttcttc gagcacagga gcagcaagct gccctggccc 1380
gagtggatgg gcgtgatgca cggctacgag atcgagttcg tgttcggcct gcccctgggc 1440
aggagggtga actacaccag ggccgaggag atcttcagca ggagcatcat gaagacctgg 1500
gccaacttcg ccaagtacgg ccaccccaac ggcacccagg gcaacagcac catgtggccc 1560
gtgttcacca gcaccgagca gaagtacctg accctgaaca ccgagaagag caagatctac 1620
agcaagctga gggcccccca gtgccagttc tggaggctgt tcttccccaa ggtgctggag 1680
atgaccggcg acatcgacga gaccgagcag gagtggaagg ccggcttcca caggtggagc 1740
aactacatga tggactggca gaaccagttc aacgactaca ccagcaagaa ggagagctgc 1800
accgccctg 1809
<210> 45
<211> 275
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> mGLP-1 (具有IgG-Fc融合的GLY8突变体)
<400> 45
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
35 40 45
Gly Arg Gly Arg Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
50 55 60
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
65 70 75 80
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
85 90 95
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
100 105 110
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
115 120 125
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
145 150 155 160
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
165 170 175
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
180 185 190
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
195 200 205
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
210 215 220
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
225 230 235 240
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
245 250 255
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
260 265 270
Pro Gly Lys
275
<210> 46
<211> 825
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的核酸序列
<400> 46
atgtacagga tgcagctgct gagctgcatc gccctgagcc tggccctggt gaccaacagc 60
cacggcgagg gcaccttcac cagcgacgtg agcagctacc tggagggcca ggccgccaag 120
gagttcatcg cctggctggt gaagggcagg ggcaggagcg gctgcaagcc ctgcatctgc 180
accgtgcccg aggtgagcag cgtgttcatc ttccccccca agcccaagga cgtgctgacc 240
atcaccctga cccccaaggt gacctgcgtg gtggtggaca tcagcaagga cgaccccgag 300
gtgcagttca gctggttcgt ggacgacgtg gaggtgcaca ccgcccagac ccagcccagg 360
gaggagcagt tcaacagcac cttcaggagc gtgagcgagc tgcccatcat gcaccaggac 420
tggctgaacg gcaaggagtt caagtgcagg gtgaacagcg ccgccttccc cgcccccatc 480
gagaagacca tcagcaagac caagggcagg cccaaggccc cccaggtgta caccatcccc 540
ccccccaagg agcagatggc caaggacaag gtgagcctga cctgcatgat caccgacttc 600
ttccccgagg acatcaccgt ggagtggcag tggaacggcc agcccgccga gaactacaag 660
aacacccagc ccatcatgga caccgacggc agctacttcg tgtacagcaa gctgaacgtg 720
cagaagagca actgggaggc cggcaacacc ttcacctgca gcgtgctgca cgagggcctg 780
cacaaccacc acaccgagaa gagcctgagc cacagccccg gcaag 825
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 引物A
<400> 47
gctctagagc caccatgcag actcagcata ccaagg 36
<210> 48
<211> 42
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 引物B
<400> 48
cgggatccac cggtttagag agctgtacaa gattctttct tg 42
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 引物C
<400> 49
cccaagcttg ccaccatgca tagcaaagtc acaatc 36
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 引物D
<400> 50
acgcgtcgac ttagagaccc acacaacttt ctttcttg 38
<210> 51
<211> 1701
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> PAL
<400> 51
atgaagacgc tgtcacaggc ccagtccaag acctcctccc agcagttctc cttcaccggc 60
aactcctccg ccaacgtgat catcggcaac cagaagctga ccatcaacga cgtggcccgc 120
gtggcccgca acggcaccct ggtgtccctg accaacaaca ccgacatcct gcagggcatc 180
caggcctcct gcgactacat caacaacgcc gtggagtccg gcgagcccat ctacggcgtg 240
acctccggct tcggcggcat ggccaacgtg gccatctccc gcgagcaggc ctccgagctg 300
cagaccaacc tggtgtggtt cctgaagacc ggcgccggca acaagctgcc cctggccgac 360
gtgcgcgccg ccatgctgct gcgcgccaac tcccacatgc gcggcgcctc cggcatccgc 420
ctcgagctga tcaagcgcat ggagatcttc ctgaacgccg gcgtgacccc ctacgtgtac 480
gagttcggct ccatcggcgc ctccggcgac ctggtgcccc tgtcctacat caccggctcc 540
ctgatcggcc tggacccctc cttcaaggtg gacttcaacg gcaaggagat ggacgccccc 600
accgccctgc gccagctgaa cctgtccccc ctgaccctgc tgcccaagga gggcctggcc 660
atgatgaacg gcacctccgt gatgaccggc atcgccgcca actgcgtgta cgacacccag 720
atcctgaccg ccatcgccat gggtgtacac gctctggaca tccaggccct gaacggcacc 780
aaccagtcct tccacccctt catccacaac tccaagcccc accccggcca gctgtgggcc 840
gccgaccaga tgatctccct cctcgccaac tcccagctgg tgcgcgacga gctggacggc 900
aagcacgact accgcgacca cgagctgatc caggaccgct actccctgcg ctgcctgccc 960
cagtacctgg gccccatcgt ggacggcatc tcccagatcg ccaagcagat cgagatcgag 1020
atcaactccg tgaccgacaa ccccctgatc gacgtggaca accaggcctc ctaccacggc 1080
ggcaacttcc tgggccagta cgtgggcatg ggcatggacc acctgcgcta ctacatcggc 1140
ctgctggcca agcacctgga cgtgcagatc gccctgctgg cctcccccga gttctccaac 1200
ggcctgcccc cctccctgct gggcaaccgc gagcgcaagg tgaacatggg cctgaagggc 1260
ctgcagatct gcggtaactc gataatgccc ctgctgacct tctacggcaa ctccatcgcc 1320
gaccgcttcc ccacccacgc cgagcagttc aaccagaaca tcaactccca gggctacacc 1380
tccgccaccc tggcccgccg ctccgtggac atcttccaga actacgtggc catcgccctg 1440
atgttcggcg ttcaagctgt agacctgcgc acctacaaga agaccggcca ctacgacgcc 1500
cgcgcctccc tgtcccccgc caccgagcgc ctgtactccg ccgtgcgcca cgtggtgggc 1560
cagaagccca cctccgaccg cccctacatc tggaacgaca acgagcaggg cctggacgag 1620
cacatcgccc gcatctccgc cgacatcgca gcaggtggcg tgatcgtgca ggccgtgcag 1680
gacatcctgc cctccctgca c 1701
<210> 52
<211> 1128
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> HSV-TK
<400> 52
atggcttcgt accccggcca tcagcacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcccggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc ccacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcgggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct tgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat gatccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080
atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaac 1128
<210> 53
<211> 474
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> yCD
<400> 53
atggtgaccg gcggcatggc ctccaagtgg gaccagaagg gcatggacat cgcctacgag 60
gaggccgccc tgggctacaa ggagggcggc gtgcccatcg gcggctgcct gatcaacaac 120
aaggacggct ccgtgctggg ccgcggccac aacatgcgct tccagaaggg ctccgccacc 180
ctgcacggcg agatctccac cctggagaac tgcggccgcc tggagggcaa ggtgtacaag 240
gacaccaccc tgtacaccac cctgtccccc tgcgacatgt gcaccggcgc catcatcatg 300
tacggcatcc cccgctgcgt ggtgggcgag aacgtgaact tcaagtccaa gggcgagaag 360
tacctgcaga cccgcggcca cgaggtggtg gtggtggacg acgagcgctg caagaagatc 420
atgaagcagt tcatcgacga gcgcccccag gactggttcg aggacatcgg cgag 474
<210> 54
<211> 1356
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> PAH
<400> 54
atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60
gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120
ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180
aacctgaccc acattgaatc tagaccttct cgtttaaaga aagatgagta tgaatttttc 240
acccatttgg ataaacgtag cctgcctgct ctgacaaaca tcatcaagat cttgaggcat 300
gacattggtg ccactgtcca tgagctttca cgagataaga agaaagacac agtgccctgg 360
ttcccaagaa ccattcaaga gctggacaga tttgccaatc agattctcag ctatggagcg 420
gaactggatg ctgaccaccc tggttttaaa gatcctgtgt accgtgcaag acggaagcag 480
tttgctgaca ttgcctacaa ctaccgccat gggcagccca tccctcgagt ggaatacatg 540
gaggaagaaa agaaaacatg gggcacagtg ttcaagactc tgaagtcctt gtataaaacc 600
catgcttgct atgagtacaa tcacattttt ccacttcttg aaaagtactg tggcttccat 660
gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcaattcc tgcagacttg cactggtttc 720
cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780
cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840
cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900
cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960
ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020
aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080
aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140
gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200
aactttgctg ccacaatacc tcggcccttc tcagttcgct acgacccata cacccaaagg 1260
attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320
attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaag 1356
<210> 55
<211> 723
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> GTPCH
<400> 55
atggagaagc cgcggggagt caggtgcacc aatgggttct ccgagcgtga actacctcgt 60
cctggagcaa gcccacctgc agagaagtcc cgacctcctg aagcaaaggg cgcacagccg 120
gccgacgcct ggaaggcagg gcggcaccgc agcgaggagg aaaaccaggt gaacctcccc 180
aaactggcgg ccgcttactc gtccattctg ctctcgctgg gcgaggaccc ccagcggcag 240
gggctgctca agacgccctg gagggcggcc accgccatgc agtacttcac caagggatac 300
caggagacca tctcagatgt cctgaatgat gctatatttg atgaagatca tgacgagatg 360
gtgattgtga aggacataga tatgttctcc atgtgtgagc atcaccttgt tccatttgta 420
ggaagggtcc atattggcta tcttcctaac aagcaagtcc ttggtctcag taaacttgcc 480
aggattgtag aaatctacag tagacgacta caagttcaag agcgcctcac caaacagatt 540
gcggtggcca tcacagaagc cttgcagcct gctggcgttg gagtagtgat tgaagcgaca 600
cacatgtgca tggtaatgcg aggcgtgcag aaaatgaaca gcaagactgt cactagcacc 660
atgctgggcg tgttccggga agaccccaag actcgggagg agttcctcac actaatcagg 720
agc 723
<210> 56
<211> 432
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> PTPS
<400> 56
atgagcgctg ctggtgatct tcgtcgtcgt gcgcgactgt cgcgcctcgt gtccttcagc 60
gcgagccacc ggctgcacag cccatctctg agcgatgaag agaacttaag agtgtttggg 120
aaatgcaaca atccgaatgg ccacgggcac aactataaag ttgtggtgac agtccatgga 180
gagattgatc ctgttacagg aatggttatg aatttgaccg acctcaaaga atacatggag 240
gaggccatca tgaagcctct tgatcacaag aacctggacc tggatgtgcc gtactttgcg 300
gatgctgtga gcacgacaga aaatgtagct gtctacatct gggaaagcct ccagaaactt 360
cttccagtgg gagctcttta taaagtaaaa gtgtttgaaa ccgacaacaa catcgtagtc 420
tataaaggag aa 432
<210> 57
<211> 783
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> SR (墨蝶蛉还原酶)
<400> 57
atggagggcg ggctggggcg tgctgtgtgc ttgctgaccg gggcctcccg cggcttcggc 60
cggacgctgg ccccgctcct ggcctcgctg ctgtcgcccg gctccgtgct tgtccttagc 120
gcccgcaacg acgaggcact gcgccagctg gaggccgagc tgggcgccga gcggtctggc 180
ctgcgcgtgg tgcgggtgcc cgccgacctg ggcgccgagg ccggcttgca gcagctgctc 240
ggcgccctgc gcgagctccc ccggcccaag gggctgcagc gactgctgct tatcaacaac 300
gcgggctctc ttggggatgt gtccaaaggc ttcgtggacc tgagtgactc cactcaagtg 360
aacaactact gggcactgaa cttgacctcc atgctctgcc tgacttccag cgtcctgaag 420
gccttcccgg acagtcctgg cctcaacaga accgtggtta acatctcgtc cctctgtgcc 480
ctgcaacctt tcaaaggctg ggcgctgtac tgtgcaggaa aggctgctcg tgatatgctg 540
ttccaggtcc tggcgctgga ggaacctaat gtgagggtgc tgaactatgc cccaggtcct 600
ctggacacag acatgcagca gttggcccgg gagacctccg tggacccaga catgcgaaaa 660
gggctgcagg agctgaaggc aaaggggaag ctggtggatt gcaaggtgtc agcccagaaa 720
ctgctgagct tactggaaaa ggacgagttc aagtctggag cccacgtgga cttctatgac 780
aaa 783
<210> 58
<211> 4413
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 因子VIII减去B
<400> 58
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccccacca 2340
gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 2400
attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 2460
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 2520
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 2580
gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 2640
tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 2700
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 2760
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 2820
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 2880
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 2940
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 3000
acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 3060
atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 3120
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 3180
aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 3240
tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 3300
gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 3360
gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 3420
attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 3480
cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 3540
caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 3600
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 3660
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 3720
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 3780
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 3840
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 3900
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 3960
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 4020
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 4080
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 4140
ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 4200
atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 4260
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 4320
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 4380
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tac 4413
<210> 59
<211> 7053
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 因子VIII
<400> 59
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340
ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400
atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460
gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520
cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580
catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640
aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700
tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760
agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820
tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880
aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940
aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000
gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060
aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120
attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180
gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240
aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300
gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360
ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420
caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480
aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540
ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600
ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660
gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720
aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780
ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840
aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900
aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960
agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020
ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080
aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140
aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200
caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260
atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320
agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380
aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440
ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500
aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560
cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620
gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680
ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740
ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800
tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860
aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920
atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980
gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040
attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220
gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280
tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640
acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700
atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820
aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880
tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940
gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000
gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060
attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120
cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180
caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780
ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840
atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tac 7053
<210> 60
<211> 1827
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 白蛋白
<400> 60
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60
gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120
gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180
gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240
gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300
gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360
gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420
agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480
aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540
tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600
tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660
agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720
gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780
gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840
agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900
gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960
gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020
aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080
aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140
ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200
tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260
cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320
caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380
tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440
ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500
tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560
tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620
tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680
cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740
aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800
gctgcaagtc aagctgcctt aggctta 1827
<210> 61
<211> 1389
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 因子IX
<400> 61
gccaccatgc agcgcgtgaa catgatcatg gcagaatcac caggcctcat caccatctgc 60
cttttaggat atctactcag tgctgaatgt acagtttttc ttgatcatga aaacgccaac 120
aaaattctga atcggccaaa gaggtataat tcaggtaaat tggaagagtt tgttcaaggg 180
aaccttgaga gagaatgtat ggaagaaaag tgtagttttg aagaagcacg agaagttttt 240
gaaaacactg aaagaacaac tgaattttgg aagcagtatg ttgatggaga tcagtgtgag 300
tccaatccat gtttaaatgg cggcagttgc aaggatgaca ttaattccta tgaatgttgg 360
tgtccctttg gatttgaagg aaagaactgt gaattagatg taacatgtaa cattaagaat 420
ggcagatgcg agcagttttg taaaaatagt gctgataaca aggtggtttg ctcctgtact 480
gagggatatc gacttgcaga aaaccagaag tcctgtgaac cagcagtgcc atttccatgt 540
ggaagagttt ctgtttcaca aacttctaag ctcacccgtg ctgagactgt ttttcctgat 600
gtggactatg taaattctac tgaagctgaa accattttgg ataacatcac tcaaagcacc 660
caatcattta atgacttcac tcgggttgtt ggtggagaag atgccaaacc aggtcaattc 720
ccttggcagg ttgttttgaa tggtaaagtt gatgcattct gtggaggctc tatcgttaat 780
gaaaaatgga ttgtaactgc tgcccactgt gttgaaactg gtgttaaaat tacagttgtc 840
gcaggtgaac ataatattga ggagacagaa catacagagc aaaagcgaaa tgtgattcga 900
attattcctc accacaacta caatgcagct attaataagt acaaccatga cattgccctt 960
ctggaactgg acgaaccctt agtgctaaac agctacgtta cacctatttg cattgctgac 1020
aaggaataca cgaacatctt cctcaaattt ggatctggct atgtaagtgg ctggggaaga 1080
gtcttccaca aagggagatc agctttagtt cttcagtacc ttagagttcc acttgttgac 1140
cgagccacat gtcttcgatc tacaaagttc accatctata acaacatgtt ctgtgctggc 1200
ttccatgaag gaggtagaga ttcatgtcaa ggagatagtg ggggacccca tgttactgaa 1260
gtggaaggga ccagtttctt aactggaatt attagctggg gtgaagagtg tgcaatgaaa 1320
ggcaaatatg gaatatatac caaggtatcc cggtatgtca actggattaa ggaaaaaaca 1380
aagctcact 1389
<210> 62
<211> 432
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> H-FABP
<400> 62
atggtggacg ctttcctggg cacctggaag ctagtggaca gcaagaattt cgatgactac 60
atgaagtcac tcgctcatat actcataacc ttccccctac cctcaggtgt gggttttgct 120
accaggcagg tggccagcat gaccaagcct accacaatca tcgaaaagaa tggggacatt 180
ctcaccctaa aaacacacag caccttcaag aacacagaga tcagctttaa gttgggggtg 240
gagttcgatg agacaacagc agatgacagg aaggtcaagt ccattgtgac actggatgga 300
gggaaacttg ttcacctgca gaaatgggac gggcaagaga ccacacttgt gcgggagcta 360
attgatggaa aactcatcct gacactcacc cacggcactg cagtttgcac tcgcacttat 420
gagaaagagg ca 432
<210> 63
<211> 462
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 心肌肌红蛋白
<400> 63
atggggctca gcgacgggga atggcagttg gtgctgaacg tctgggggaa ggtggaggct 60
gacatcccag gccatgggca ggaagtcctc atcaggctct ttaagggtca cccagagact 120
ctggagaagt ttgacaagtt caagcacctg aagtcagagg acgagatgaa ggcgtctgag 180
gacttaaaga agcatggtgc caccgtgctc accgccctgg gtggcatcct taagaagaag 240
gggcatcatg aggcagagat taagcccctg gcacagtcgc atgccaccaa gcacaagatc 300
cccgtgaagt acctggagtt catctcggaa tgcatcatcc aggttctgca gagcaagcat 360
cccggggact ttggtgctga tgcccagggg gccatgaaca aggccctgga gctgttccgg 420
aaggacatgg cctccaacta caaggagctg ggcttccagg gc 462
<210> 64
<211> 1293
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> GFAP
<400> 64
atggagagga gacgcatcac ctccgctgct cgccgctcct acgtctcctc aggggagatg 60
atggtggggg gcctggctcc tggccgccgt ctgggtcctg gcacccgcct ctccctggct 120
cgaatgcccc ctccactccc gacccgggtg gatttctccc tggctggggc actcaatgct 180
ggcttcaagg agacccgggc cagtgagcgg gcagagatga tggagctcaa tgaccgcttt 240
gccagctaca tcgagaaggt tcgcttcctg gaacagcaaa acaaggcgct ggctgctgag 300
ctgaaccagc tgcgggccaa ggagcccacc aagctggcag acgtctacca ggctgagctg 360
cgagagctgc ggctgcggct cgatcaactc accgccaaca gcgcccggct ggaggttgag 420
agggacaatc tggcacagga cctggccact gtgaggcaga agctccagga tgaaaccaac 480
ctgaggctgg aagccgagaa caacctggct gcctatagac aggaagcaga tgaagccacc 540
ctggcccgtc tggatctgga gaggaagatt gagtcgctgg aggaggagat ccggttcttg 600
aggaagatcc acgaggagga ggttcgggaa ctccaggagc agctggcccg acagcaggtc 660
catgtggagc ttgacgtggc caagccagac ctcaccgcag ccctgaaaga gatccgcacg 720
cagtatgagg caatggcgtc cagcaacatg catgaagccg aagagtggta ccgctccaag 780
tttgcagacc tgacagacgc tgctgcccgc aacgcggagc tgctccgcca ggccaagcac 840
gaagccaacg actaccggcg ccagttgcag tccttgacct gcgacctgga gtctctgcgc 900
ggcacgaacg agtccctgga gaggcagatg cgcgagcagg aggagcggca cgtgcgggag 960
gcggccagtt atcaggaggc gctggcgcgg ctggaggaag aggggcagag cctcaaggac 1020
gagatggccc gccacttgca ggagtaccag gacctgctca atgtcaagct ggccctggac 1080
atcgagatcg ccacctacag gaagctgcta gagggcgagg agaaccggat caccattccc 1140
gtgcagacct tctccaacct gcagattcga gggggcaaaa gcaccaaaga cggggaaaat 1200
cacaaggtca caagatatct caaaagcctc acaatacgag ttataccaat acaggctcac 1260
cagattgtaa atggaacgcc gccggctcgc ggt 1293
<210> 65
<211> 276
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> S100B
<400> 65
atgtctgagc tggagaaggc catggtggcc ctcatcgacg ttttccacca atattctgga 60
agggagggag acaagcacaa gctgaagaaa tccgaactga aggagctcat caacaatgag 120
ctttcccatt tcttagagga aatcaaagag caggaggttg tggacaaagt catggaaaca 180
ctggacaatg atggagacgg cgaatgtgac ttccaggaat tcatggcctt tgttgccatg 240
gttactactg cctgccacga gttctttgaa catgag 276
<210> 66
<211> 1069
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> PYY (智人)
<400> 66
gcccctggag gaactgaacc cactatcggt catggggccg agactaaatg tggcgggttg 60
tctttaatct gctgccaaga ggaaactcat tcaggcaagt tcagcccttt atgaggaatt 120
cccctgtggt cacattccaa ttcctggacc tgctgccacc ctcagaactg catgctcctt 180
cttcagactt tctaagaatg actcaggtca ttggtggagt gaagtcaaga tttccaactc 240
agtcacctga agagatggag ataccattca tggagctgga ggtccctgga gatttgggaa 300
ttcagataac aagctaagat aaggagtttg cctacctctg tcctagagcg aagcctgagc 360
cttgggcgcg cagcacacca caagtatctg ttactgtgtt ttgcagaagc ttcaggcggg 420
gatataagcc ccacaaggaa agcgctgagc agaggaggcc tcagcttgac ctgcggcagt 480
gcagcccttg ggacttccct cgccttccac ctcctgctcg tctgcttcac aagctatcgc 540
tatggtgttc gtgcgcaggc cgtggcccgc cttgaccaca gtgcttctgg ccctgctcgt 600
ctgcctaggg gcgctggtcg acgcctaccc catcaaaccc gaggctcccg gcgaagacgc 660
ctcgccggag gagctgaacc gctactacgc ctccctgcgc cactacctca acctggtcac 720
ccggcagcgg tatgggaaaa gagacggccc ggacacgctt ctttccaaaa cgttcttccc 780
cgacggcgag gaccgccccg tcaggtcgcg gtcggagggc ccagacctgt ggtgaggacc 840
cctgaggcct cctgggagat ctgccaacca cgcccacgtc atttgcatac gcactcccga 900
ccccagaaac ccggattctg cctcccgacg gcggcgtctg ggcagggttc gggtgcggcc 960
ctccgcccgc gtctcggtgc ccccgccccc tgggctggag ggctgtgtgt ggtccttccc 1020
tggtcccaaa ataaagagca aattccacag aaacggaaaa aaaaaaaaa 1069
<210> 67
<211> 3670
<212> DNA
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> TIMP2 (智人)
<400> 67
cgcagcaaac acatccgtag aaggcagcgc ggccgccgag aaccgcagcg ccgctcgccc 60
gccgcccccc accccgccgc cccgcccggc gaattgcgcc ccgcgcccct cccctcgcgc 120
ccccgagaca aagaggagag aaagtttgcg cggccgagcg gggcaggtga ggagggtgag 180
ccgcgcggga ggggcccgcc tcggccccgg ctcagccccc gcccgcgccc ccagcccgcc 240
gccgcgagca gcgcccggac cccccagcgg cggcccccgc ccgcccagcc ccccggcccg 300
ccatgggcgc cgcggcccgc accctgcggc tggcgctcgg cctcctgctg ctggcgacgc 360
tgcttcgccc ggccgacgcc tgcagctgct ccccggtgca cccgcaacag gcgttttgca 420
atgcagatgt agtgatcagg gccaaagcgg tcagtgagaa ggaagtggac tctggaaacg 480
acatttatgg caaccctatc aagaggatcc agtatgagat caagcagata aagatgttca 540
aagggcctga gaaggatata gagtttatct acacggcccc ctcctcggca gtgtgtgggg 600
tctcgctgga cgttggagga aagaaggaat atctcattgc aggaaaggcc gagggggacg 660
gcaagatgca catcaccctc tgtgacttca tcgtgccctg ggacaccctg agcaccaccc 720
agaagaagag cctgaaccac aggtaccaga tgggctgcga gtgcaagatc acgcgctgcc 780
ccatgatccc gtgctacatc tcctccccgg acgagtgcct ctggatggac tgggtcacag 840
agaagaacat caacgggcac caggccaagt tcttcgcctg catcaagaga agtgacggct 900
cctgtgcgtg gtaccgcggc gcggcgcccc ccaagcagga gtttctcgac atcgaggacc 960
cataagcagg cctccaacgc ccctgtggcc aactgcaaaa aaagcctcca agggtttcga 1020
ctggtccagc tctgacatcc cttcctggaa acagcatgaa taaaacactc atcccatggg 1080
tccaaattaa tatgattctg ctcccccctt ctccttttag acatggttgt gggtctggag 1140
ggagacgtgg gtccaaggtc ctcatcccat cctccctctg ccaggcacta tgtgtctggg 1200
gcttcgatcc ttgggtgcag gcagggctgg gacacgcggc ttccctccca gtccctgcct 1260
tggcaccgtc acagatgcca agcaggcagc acttagggat ctcccagctg ggttagggca 1320
gggcctggaa atgtgcattt tgcagaaact tttgagggtc gttgcaagac tgtgtagcag 1380
gcctaccagg tccctttcat cttgagaggg acatggccct tgttttctgc agcttccacg 1440
cctctgcact ccctgcccct ggcaagtgct cccatcgccc cggtgcccac catgagctcc 1500
cagcacctga ctccccccac atccaagggc agcctggaac cagtggctag ttcttgaagg 1560
agccccatca atcctattaa tcctcagaat tccagtggga gcctccctct gagccttgta 1620
gaaatgggag cgagaaaccc cagctgagct gcgttccagc ctcagctgag tctttttggt 1680
ctgcacccac ccccccaccc cccccccccc gcccacatgc tccccagctt gcaggaggaa 1740
tcggtgaggt cctgtcctga ggctgctgtc cggggccggt ggctgccctc aaggtccctt 1800
ccctagctgc tgcggttgcc attgcttctt gcctgttctg gcatcaggca cctggattga 1860
gttgcacagc tttgctttat ccgggcttgt gtgcagggcc cggctgggct ccccatctgc 1920
acatcctgag gacagaaaaa gctgggtctt gctgtgccct cccaggctta gtgttccctc 1980
cctcaaagac tgacagccat cgttctgcac ggggctttct gcatgtgacg ccagctaagc 2040
atagtaagaa gtccagccta ggaagggaag gattttggag gtaggtggct ttggtgacac 2100
actcacttct ttctcagcct ccaggacact atggcctgtt ttaagagaca tcttattttt 2160
ctaaaggtga attctcagat gataggtgaa cctgagttgc agatatacca acttctgctt 2220
gtatttctta aatgacaaag attacctagc taagaaactt cctagggaac tagggaacct 2280
atgtgttccc tcagtgtggt ttcctgaagc cagtgatatg ggggttagga taggaagaac 2340
tttctcggta atgataagga gaatctcttg tttcctccca cctgtgttgt aaagataaac 2400
tgacgatata caggcacatt atgtaaacat acacacgcaa tgaaaccgaa gcttggcggc 2460
ctgggcgtgg tcttgcaaaa tgcttccaaa gccaccttag cctgttctat tcagcggcaa 2520
ccccaaagca cctgttaaga ctcctgaccc ccaagtggca tgcagccccc atgcccaccg 2580
ggacctggtc agcacagatc ttgatgactt ccctttctag ggcagactgg gagggtatcc 2640
aggaatcggc ccctgcccca cgggcgtttt catgctgtac agtgacctaa agttggtaag 2700
atgtcataat ggaccagtcc atgtgatttc agtatataca actccaccag acccctccaa 2760
cccatataac accccacccc tgttcgcttc ctgtatggtg atatcatatg taacatttac 2820
tcctgtttct gctgattgtt tttttaatgt tttggtttgt ttttgacatc agctgtaatc 2880
attcctgtgc tgtgtttttt attacccttg gtaggtatta gacttgcact tttttaaaaa 2940
aaggtttctg catcgtggaa gcatttgacc cagagtggaa cgcgtggcct atgcaggtgg 3000
attccttcag gtctttcctt tggttctttg agcatctttg ctttcattcg tctcccgtct 3060
ttggttctcc agttcaaatt attgcaaagt aaaggatctt tgagtaggtt cggtctgaaa 3120
ggtgtggcct ttatatttga tccacacacg ttggtctttt aaccgtgctg agcagaaaac 3180
aaaacaggtt aagaagagcc gggtggcagc tgacagagga agccgctcaa ataccttcac 3240
aataaatagt ggcaatatat atatagttta agaaggctct ccatttggca tcgtttaatt 3300
tatatgttat gttctaagca cagctctctt ctcctatttt catcctgcaa gcaactcaaa 3360
atatttaaaa taaagtttac attgtagtta ttttcaaatc tttgcttgat aagtattaag 3420
aaatattgga cttgctgccg taatttaaag ctctgttgat tttgtttccg tttggatttt 3480
tgggggaggg gagcactgtg tttatgctgg aatatgaagt ctgagacctt ccggtgctgg 3540
gaacacacaa gagttgttga aagttgacaa gcagactgcg catgtctctg atgctttgta 3600
tcattcttga gcaatcgctc ggtccgtgga caataaacag tattatcaaa gagaaaaaaa 3660
aaaaaaaaaa 3670

Claims (49)

1.一种生理学定制的组织类器官，其包含：
多个基因工程细胞，所述多个基因工程细胞包含至少一种编码报告分子的重组基因，
其中所述报告分子在与预定血液因子结合和/或接触时产生可检测信号。
2.如权利要求1所述的生理学定制的组织类器官，其中所述组织类器官包含从取自个体的细胞生长成的分层的皮肤移植物。
3.如权利要求2所述的生理学定制的组织类器官，其中所述组织类器官包含从胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、表皮干细胞或角质形成细胞生长成的培养的皮肤移植物。
4.如权利要求1所述的生理学定制的组织类器官，其中当所述组织类器官被生物整合到个体中时，所述组织类器官表达与所述个体血液中血液因子的浓度成比例的所述报告分子。
5.如权利要求1所述的生理学定制的组织类器官，其中所述血液因子包含细胞、酶、蛋白质、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸、糖、脂质、代谢物、合成化合物、天然存在的化合物、矿物质、金属、细菌、病毒、朊病毒、疾病指示物或其组合。
6.如权利要求1所述的生理学定制的组织类器官，其中所述生理学定制的组织类器官被生物整合到个体中。
7.如权利要求6所述的生理学定制的组织类器官，其中所述个体是动物。
8.如权利要求1所述的生理学定制的组织类器官，其中所述预定血液因子是葡萄糖。
9.一种生理学定制的组织类器官，其包含：
多个基因工程细胞，所述多个基因工程细胞包含至少一种编码治疗剂的重组基因，
其中当将所述治疗剂施用于有需要的个体时，所述治疗剂改善所述个体的健康。
10.如权利要求9所述的生理学定制的组织类器官，其中所述治疗剂包含酶、蛋白质、凝血因子、维生素、肽、脂质、毒素或其组合。
11.如权利要求10所述的生理学定制的组织类器官，其中所述治疗剂的表达可由诱导因子诱导。
12.如权利要求11所述的生理学定制的组织类器官，其中所述诱导因子包括以下的一种或多种：热、冷、光、蛋白质、激素、脂质、化学物质、代谢变化、电势或电场及其组合。
13.如权利要求11所述的生理学定制的组织类器官，其中当诱导所述治疗剂的表达时，所述治疗剂被释放到所述个体的循环中。
14.如权利要求9所述的生理学定制的组织类器官，其中所述生理学定制的组织类器官被生物整合到个体中。
15.如权利要求14所述的生理学定制的组织类器官，其中所述个体是动物。
16.一种生理学定制的组织类器官，其包含：
多个基因工程细胞，所述多个基因工程细胞包含至少一种编码报告分子的重组基因和至少一种编码治疗剂的重组基因，
其中所述治疗剂作为所述报告分子的表达的函数表达。
17.一种监测血液因子的方法，其包括：
将根据权利要求1-8或16中任一项的组织类器官生物整合到个体中；以及
检测由所述组织类器官响应于血液因子而表达的报告分子所产生的可检测信号，
其中所述可检测信号与所述个体中所述血液因子的浓度成比例。
18.如权利要求17所述的方法，其中将所述组织类器官通过移植或手术植入生物整合到个体中。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述可检测信号由荧光计、色度计、生物发光监测系统和具有适当电极的电系统中的一种或多种检测。
20.一种治疗有需要的个体的疾病的方法，其包括：
将根据权利要求9-16中任一项的组织类器官生物整合到个体中；以及
向所述个体施用治疗剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述个体是人。
22.一种生理学定制的组织类器官，其包含：
基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因；
其中所述治疗剂包含mGLP1和hBChE中的至少一种，以及
其中当将所述治疗剂施用于有需要的个体时，所述治疗剂改善所述个体的健康。
23.如权利要求22所述的生理学定制的组织类器官，其中所述治疗剂通过降低所述个体对尼古丁、酒精、可卡因和苯丙胺中的至少一种的寻求和/或消耗来改善所述个体的健康。
24.一种治疗有需要的个体的可卡因成瘾的方法，其包括：
使组织类器官与所述个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含hBChE。
25.如权利要求24所述的方法，其中将所述组织类器官移植到所述个体中。
26.如权利要求24所述的方法，其中hBChE组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。
27.如权利要求24所述的方法，其中hBChE的所述表达水解所述个体的血液中的可卡因。
28.如权利要求27所述的方法，其中hBChE的所述表达使得所述个体的可卡因寻求和/或消耗降低。
29.一种治疗有需要的个体的AUD的方法，其包括：
使组织类器官与所述个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含mGLP1或其类似物。
30.如权利要求29所述的方法，其中将所述组织类器官移植到所述个体中。
31.如权利要求29所述的方法，其中mGLP1或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。
32.如权利要求31所述的方法，其中mGLP1或其类似物的所述表达使得所述个体的酒精寻求和/或消耗降低。
33.一种治疗有需要的个体的尼古丁成瘾的方法，其包括：
使组织类器官与所述个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含mGLP1或其类似物。
34.如权利要求33所述的方法，其中将所述组织类器官移植到所述个体中。
35.如权利要求33所述的方法，其中mGLP1或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。
36.如权利要求35所述的方法，其中mGLP1的所述表达使得所述个体的尼古丁寻求和/或消耗降低。
37.一种治疗有需要的个体的苯丙胺成瘾的方法，其包括：
使组织类器官与所述个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含mGLP1或其类似物。
38.如权利要求37所述的方法，其中将所述组织类器官移植到所述个体中。
39.如权利要求37所述的方法，其中mGLP1或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。
40.如权利要求39所述的方法，其中mGLP1的所述表达使得所述个体的苯丙胺寻求和/或消耗降低。
41.一种治疗有需要的个体的肥胖的方法，其包括：
使组织类器官与所述个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含肽酪氨酸酪氨酸(PYY)或其类似物。
42.如权利要求41所述的方法，其中将所述组织类器官移植到所述个体中。
43.如权利要求41所述的方法，其中PYY或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。
44.如权利要求43所述的方法，其中PYY的所述表达使得所述个体的食物寻求和/或消耗降低。
45.一种治疗有需要的个体的抗衰老作用的方法，其包括：
使组织类器官与所述个体接触，所述组织类器官包含基因工程细胞群，所述基因工程细胞群包含至少一种编码治疗剂的重组基因，其中所述治疗剂包含TIMP2或其类似物。
46.如权利要求45所述的方法，其中将所述组织类器官移植到所述个体中。
47.如权利要求45所述的方法，其中TIMP2或其类似物组成型表达或通过用诱导因子诱导表达。
48.如权利要求47所述的方法，其中TIMP2的所述表达使得个体中衰老的负面影响降低。
49.如权利要求48所述的方法，其中衰老的所述负面影响包括记忆丧失、血管响应降低和/或免疫响应降低。
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