CN110291080B

CN110291080B - 布鲁顿酪氨酸激酶的咪唑并吡嗪抑制剂

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Publication number: CN110291080B
Application number: CN201780086892.3A
Authority: CN
Inventors: T.波多尔; J.埃瓦茨; A.卡普坦
Original assignee: Acerta Pharma BV
Current assignee: Acerta Pharma BV
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: EP3558968A1; ES2856248T3; IL267374B; KR102559851B1; EP3558968B1; US10858364B2; AU2017383236A1; JP7022131B2; JP2020514264A; MX2019007156A; ZA201903932B; KR20190095403A; CN110291080A; AU2017383236B2; WO2018116259A1; BR112019012604A2; US20190345164A1; CL2019001674A1; IL267374A; CA3046578A1

Abstract

在一些实施方案中，本发明涉及式(I)和(II)的化合物或其药学上可接受的盐，或涉及包含这些化合物的药物组合物，并涉及它们在治疗中的用途。特别地，在一些实施方案中，本发明涉及式(I)和(II)的化合物、其药物组合物和所述化合物和药物组合物在过度增殖病症、炎性病症、免疫病症或自身免疫病症的治疗中的用途。

Description

布鲁顿酪氨酸激酶的咪唑并吡嗪抑制剂

发明领域

在一些实施方案中，本发明涉及式(I)和(II)的化合物，涉及包含这些化合物的药物组合物，并涉及它们在治疗中的用途。在一些实施方案中，本发明涉及式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐在过度增殖病症、炎性病症、免疫病症或自身免疫病症的治疗中的用途。

发明背景

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是在B细胞和髓系细胞中表达的Tec家族非受体蛋白激酶。研究结果支持了BTK在调节自身免疫性疾病中自身抗体生产中的关键作用。此外，如Davis等人, Nature, 2010, 463, 88-94中所述，抑制BTK由于慢性活性BCR信号传导而似乎特别与B细胞淋巴瘤相关。

在许多实体瘤中，支持性微环境（可以构成大部分肿瘤块）是使肿瘤能够存活的动力。如Swartz等人, Cancer Res., 2012, 72, 2473中所述，肿瘤微环境通常定义为“促进致瘤性转化、支持肿瘤生长与侵袭、保护肿瘤免于宿主免疫、促进治疗抗性并提供使占优势的转移灶得以迅速生长的小环境（niches）的细胞、可溶性因子、信号传导分子、细胞外基质和机械诱因”的复杂混合物。尽管肿瘤表达应当被T细胞识别的抗原，由于微环境的免疫抑制，肿瘤被免疫系统清除非常罕见。采用例如化疗解决肿瘤细胞自身也被证实不足以克服微环境的保护效果。由此迫切需要更有效地治疗实体瘤的新方法，该方法考虑了微环境的作用。

发明概述

在一个方面中，该BTK抑制剂是具有下列结构的式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在另一方面中，该BTK抑制剂是具有下列结构的式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在再一方面中，本发明涉及式(I)或(II)的化合物在过度增殖病症、炎性病症、免疫病症或自身免疫病症的治疗中的用途。

附图简述

当联系附图阅读时将更好地理解本发明的上文的概述，以及下列详述。

图1图解了式(I)的化合物的¹H-¹³C二键/三键相关NMR谱。

图2图解式(I)的化合物的活性，其中预培养时间（0、30或60 min）和ATP浓度（5、25或100 µM）在BTK IMAP测定中变化。

图3图解了采用LanthaScreen测定，式(I)的化合物在BTK野生型（BTK-WT）和BTK突变体Cys481Ser（BTK-C481S）上随时间经过而变化的表观IC50。

图4图解了式(I)的化合物对Ramos B细胞中的BTK靶标占据的剂量反应。

图5图解了阿卡替尼（acalabrutinib）的主要代谢途径。

图6图解了由阿卡替尼至M27的主要氧化代谢途径。

图7图解了由阿卡替尼至M23的代谢途径。

图8A和图8B一起图解了阿卡替尼在人体中的生物转化途径。

图9图解了阿卡替尼和M27是BTK的共价抑制剂。左图显示由于随时间经过而变化的共价结合，BTK-WT随时间经过而变化的效力提高。右图显示化合物与BTK-C481S的可逆结合（亲和力），并且不随时间经过而改变。BTK-WT和BTK-C481S之间效力的差异显示了共价结合的影响。

图10图解了阿卡替尼和M27在Ramos细胞中的BTK靶标占据（BTK TO）。

图11图解了M27在单剂量（1 µM）下的KINOME扫描分析（DiscoveRx scanMAX）。

图12图解了由式(III)至式(II)的化合物的代谢途径。

发明详述

尽管本文中显示和描述了本发明的优选实施方案，但是此类实施方案仅作为实例提供，而非意在另行限制本发明的范围。所描述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。

除非另行定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文中提及的所有专利和出版物通过引用以其整体并入。

术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域已知的多种有机和无机抗衡离子的盐。药学上可接受的酸加成盐可以用无机酸和有机酸形成。可以由其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。可以由其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。药学上可接受的碱加成盐可以用无机碱和有机碱形成。可以由其衍生盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝。可以由其衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺（包括天然存在的取代的胺）、环胺和碱性离子交换树脂。具体实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。在选择的实施方案中，药学上可接受的碱加成盐选自铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。

“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则设想其用在本发明的治疗组合物中。补充的活性成分也可以混入所述组合物中。

当在本文中使用范围来描述例如物理或化学性质，如分子量或化学式时，意在包括其中的范围与具体实施方案的所有组合和子组合。当提及数字或数值范围时使用术语“大约”意味着所提及的数字或数值范围是在实验可变性内（或在统计试验误差内）的近似值，且由此数字或数值范围可以在例如所述数字或数值范围的1%至15%之间变化。术语“包含”(以及诸如“包含”或“含有”或“具有”或“包括”的相关术语)包括那些实施方案，如由所述特征“组成”或“基本上”由所述特征“组成”的任何物质的组合、方法或过程的实施方案。

化合物

在第一实施方案中，提供了式(I)的化合物，也称为M27：

或其药学上可接受的盐；或

式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，该BTK抑制剂是选自以下的化合物：4-(8-氨基-3-(4-(丁-2-炔酰氨基)丁酰基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺和4-(8-氨基-3-(4-(丁-2-炔酰氨基)丁酰基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基)-2-甲氧基-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺。

在一个实施方案中，该化合物是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，该化合物是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。

式(I)和(II)的化合物和盐可以以溶剂化形式和非溶剂化形式存在。例如，溶剂化形式可以是水合形式，如半水合物、一水合物、二水合物、三水合物或其替代量。

式(I)和(II)的化合物和盐同样包括式(I)和(II)的化合物的结晶和无定形形式，包括例如该化合物的多晶型物、假多晶型物、溶剂合物、水合物、未溶剂化多晶型物（包括无水物）、构象多晶型物和无定形形式，以及其混合物。“结晶形式”和“多晶型物”意在包括该化合物的所有结晶和无定形形式，包括例如多晶型物、假多晶型物、溶剂合物、水合物、未溶剂化多晶型物（包括无水物）、构象多晶型物和无定形形式，以及其混合物，除非提到特定的结晶或无定形形式。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物为分离形式。

“分离形式”的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐是基本不含其它组分，例如存在于活生物体中的有机组分的形式。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物呈通过HPLC测得的至少90%纯的高纯度。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物呈通过HPLC测得的至少95%纯的高纯度。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物呈通过HPLC测得的至少96%纯的高纯度。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物呈通过HPLC测得的至少97%纯的高纯度。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物呈通过HPLC测得的至少98%纯的高纯度。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物呈通过HPLC测得的至少99%纯的高纯度。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物为通过HPLC测得的100%纯。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物离体产生。

“离体”是指在存活的生物体（例如治疗癌症或其它疾病的人类患者）外部。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物通过有机合成制得。有机合成路线可用于以相对纯的形式，例如以通过HPLC测得的80%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、和99%或更高的纯度制备式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐。可以进行重结晶和其它提纯方法以提供基本100%纯的化合物。此类合成方法与提纯技术在本领域中是已知的，并以非限制性方式描述在下面的实施例中。

“有机合成”是指在实验室或制造场合中进行合成反应以获得产物。

在一个实施方案中，以基本纯的形式提供式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐。基本纯是指该化合物足够纯净以获得FDA批准，并且基本上不含污染物或其它材料，或者含有在安全性、有效性、稳定性和其它期望性质方面不会对化合物的性质产生不利或不可接受的影响的水平的杂质。

药物组合物

在所选实施方案中，本发明提供了用于治疗实体瘤癌症、淋巴瘤和白血病的药物组合物。

通常配制该药物组合物以提供治疗有效量的作为活性成分的式(I)或(II)的化合物，或其药学上可接受的盐。当需要时，该药物组合物含有其药学上可接受的盐和/或配位络合物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体（包括惰性固体稀释剂和填充剂）、稀释剂（包括无菌水溶液和各种有机溶剂）、渗透促进剂、增溶剂和佐剂。

当需要时，可以将其它药剂（多种）混入制剂中，或可以将两种组分配制成单独的制剂以便分开或同时组合使用。

在所选实施方案中，本发明的药物组合物中提供的每一种式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的浓度独立地小于例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v(相对于该药物组合物的总质量或体积)。

在所选实施方案中，本发明的药物组合物中提供的每一种式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的浓度独立地大于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25% 19%、18.75%、18.50%、18.25% 18%、17.75%、17.50%、17.25% 17%、16.75%、16.50%、16.25% 16%、15.75%、15.50%、15.25% 15%、14.75%、14.50%、14.25% 14%、13.75%、13.50%、13.25% 13%、12.75%、12.50%、12.25% 12%、11.75%、11.50%、11.25% 11%、10.75%、10.50%、10.25% 10%、9.75%、9.50%、9.25% 9%、8.75%、8.50%、8.25% 8%、7.75%、7.50%、7.25%7%、6.75%、6.50%、6.25% 6%、5.75%、5.50%、5.25% 5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v(相对于该药物组合物的总质量或体积)。

在所选实施方案中，本发明的每一种式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的浓度独立地为大约0.0001%至大约50%、大约0.001%至大约40%、大约0.01%至大约30%、大约0.02%至大约29%、大约0.03%至大约28%、大约0.04%至大约27%、大约0.05%至大约26%、大约0.06%至大约25%、大约0.07%至大约24%、大约0.08%至大约23%、大约0.09%至大约22%、大约0.1%至大约21%、大约0.2%至大约20%、大约0.3%至大约19%、大约0.4%至大约18%、大约0.5%至大约17%、大约0.6%至大约16%、大约0.7%至大约15%、大约0.8%至大约14%、大约0.9%至大约12%或大约1%至大约10% w/w、w/v或v/v(相对于该药物组合物的总质量或体积)。

在所选实施方案中，本发明的每一种式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的浓度独立地为大约0.001%至大约10%、大约0.01%至大约5%、大约0.02%至大约4.5%、大约0.03%至大约4%、大约0.04%至大约3.5%、大约0.05%至大约3%、大约0.06%至大约2.5%、大约0.07%至大约2%、大约0.08%至大约1.5%、大约0.09%至大约1%、大约0.1%至大约0.9% w/w、w/v或v/v(相对于该药物组合物的总质量或体积)。

在所选实施方案中，本发明的每一种式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的量独立地等于或小于3.0克、2.5克、2.0克、1.5克、1.0克、0.95克、0.9克、0.85克、0.8克、0.75克、0.7克、0.65克、0.6克、0.55克、0.5克、0.45克、0.4克、0.35克、0.3克、0.25克、0.2克、0.15克、0.1克、0.09克、0.08克、0.07克、0.06克、0.05克、0.04克、0.03克、0.02克、0.01克、0.009克、0.008克、0.007克、0.006克、0.005克、0.004克、0.003克、0.002克、0.001克、0.0009克、0.0008克、0.0007克、0.0006克、0.0005克、0.0004克、0.0003克、0.0002克或0.0001克。

在所选实施方案中，本发明的每一种式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的量独立地大于0.0001克、0.0002克、0.0003克、0.0004克、0.0005克、0.0006克、0.0007克、0.0008克、0.0009克、0.001克、0.0015克、0.002克、0.0025克、0.003克、0.0035克、0.004克、0.0045克、0.005克、0.0055克、0.006克、0.0065克、0.007克、0.0075克、0.008克、0.0085克、0.009克、0.0095克、0.01克、0.015克、0.02克、0.025克、0.03克、0.035克、0.04克、0.045克、0.05克、0.055克、0.06克、0.065克、0.07克、0.075克、0.08克、0.085克、0.09克、0.095克、0.1克、0.15克、0.2克、0.25克、0.3克、0.35克、0.4克、0.45克、0.5克、0.55克、0.6克、0.65克、0.7克、0.75克、0.8克、0.85克、0.9克、0.95克、1克、1.5克、2克、2.5克或3克。

根据本发明的每一种式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐在宽剂量范围内有效。例如，在成年人的治疗中，剂量独立地为每天0.01至1000毫克、0.5至100毫克、1至50毫克，且每天5至40毫克是可以采用的剂量的实例。确切的剂量将取决于施用途径、施用该化合物的形式、待治疗的对象的性别和年龄、待治疗的对象的体重、以及主治医师的偏好和经验。

下面描述非限制性的药物组合物和制备其的方法。

剂量和给药方案

施用的式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的量将取决于所治疗的哺乳动物、病症或状况的严重程度、施用速率、化合物的处置和处方医师的判断。但是，有效剂量的范围为每天每千克体重大约0.001至大约100毫克，如大约1至大约35毫克/千克/天，呈单一剂量或分剂量。对于70千克的人，这将等同于大约0.05至7克/天、如大约0.05至大约2.5克/天。在一些情况下，低于前述范围的下限的剂量水平可能超过足够量，而在其它情况下，可以使用仍然更大的剂量而不引起任何有害副作用——例如通过将此类较大剂量分为多个小剂量以便在全天内施用。

在所选实施方案中，式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐以单一剂量施用。通常，此类施用将通过注射进行，例如通过静脉内注射，以便快速引入药剂。但是，可以适当地使用其它途径。单一剂量的式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐也可用于治疗急性状况。

在所选实施方案中，式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐以多剂量施用。给药可以是每天大约一次、两次、三次、四次、五次、六次或多于六次。给药可以是大约每月一次、每两周一次、每周一次或每隔一天一次。在另一些实施方案中，式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐大约每天一次至大约每天6次施用。在另一实施方案中，式(I)或(II)的化合物的施用持续小于大约7天。在又一实施方案中，该施用持续超过约6、10、14、28天、两个月、六个月或一年。在某些情况下，实现连续给药并保持必要长的时间。

本发明的药剂的施用可以持续必要长的时间。在所选实施方案中，式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐施用超过1、2、3、4、5、6、7、14或28天。在一些实施方案中，式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐施用小于28、14、7、6、5、4、3、2或1天。在所选实施方案中，式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐持续地长期施用——例如用于治疗慢性影响。

有效量的式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐的组合可以通过具有相似效用的药剂的任何可接受的施用方式以单剂量或多剂量施用，所述施用包括直肠、含服、鼻内和透皮途径，通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、口服、局部或作为吸入剂施用。

基于体外研究，阿卡替尼主要通过CYP3A酶来代谢，并且在较小程度上通过谷胱甘肽缀合和酰胺水解来代谢。式(I)的化合物被识别为血浆中的主要代谢物，其几何平均暴露量（AUC）是阿卡替尼的暴露量的大约2至3倍高。关于生物化学测定中的BTK抑制而言，主要代谢物的效力是阿卡替尼的大约50%低。

阿卡替尼和主要代谢物与BTK活性位点中的半胱氨酸残基形成共价键，导致对BTK酶活性的抑制。阿卡替尼与半胱氨酸残基结合快速且不可逆地发生，并提供稳态下的高靶标占据。基于其中对象接受100毫克阿卡替尼的单次口服剂量的临床研究，阿卡替尼和主要代谢物的中位终末消除半衰期（t1/2）分别为0.9（范围：0.6至2.8）小时和6.9小时。阿卡替尼平均表观口服清除率（CL/F）为159 L/小时，基于群体药代动力学分析，患者与健康对象之间具有类似的药代动力学。

随着更快清除的阿卡替尼的血清水平降低，更慢清除的主要代谢物（其在更长时间段内可利用）可以通过抑制新合成的BTK酶和在给药间隔期内维持更高水平的有效BTK靶标占据而提供额外的益处。

阿卡替尼是CYP3A4/5、CYP2C8和CYP2C9的弱抑制剂，但是不抑制CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19和CYP2D6。其是CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的弱诱导剂。主要代谢产物是CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19的弱抑制剂，但是不抑制CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6和CYP3A4/5。其是CYP3A4的弱诱导剂。

治疗方法

在一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物的BTK介导的病症的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物的过度增殖病症、炎性病症、免疫病症或自身免疫病症的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明涉及用式(I)或(II)的化合物或药学上可接受的盐治疗哺乳动物的过度增殖病症的方法，所述过度增殖病症选自膀胱癌、头颈部癌、胰腺导管腺癌（PDA）、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、乳癌、纤维肉瘤、间皮瘤、肾细胞癌、肺癌、胸腺瘤（thyoma）、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、急性髓样白血病、胸腺癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、眼癌、视网膜母细胞瘤、黑素瘤、眼内黑素瘤、口腔和口咽癌、胃癌（gastric cancer）、胃癌（stomach cancer）、宫颈癌、头、颈、肾癌、肾脏癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食管癌、睾丸癌、妇科癌症、甲状腺癌、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）相关的癌症（例如淋巴瘤和卡波西肉瘤）、病毒诱导的癌症、胶质母细胞瘤、食管肿瘤、血液肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、慢性粒细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、食道肿瘤、滤泡中心淋巴瘤、头颈部肿瘤、丙型肝炎病毒感染、肝细胞癌、霍奇金病、转移性结肠癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肾细胞癌、小细胞肺癌或IV期黑素瘤。在所选实施方案中，本发明涉及用BTK抑制剂治疗病症的方法，所述病症如过度增殖病症，包括但不限于癌症如急性髓样白血病、胸腺、脑、肺、鳞状细胞、皮肤、眼、视网膜母细胞瘤、眼内黑素瘤、口腔和口咽、膀胱、胃（gastric）、胃（stomach）、胰腺、膀胱、乳房、宫颈、头、颈、肾、肾脏、肝、卵巢、前列腺、结直肠、食管、睾丸、妇科、甲状腺、CNS、PNS、AIDS-相关（例如淋巴瘤和卡波西肉瘤）或病毒诱导的癌症。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗非癌症的过度增殖病症，如皮肤良性增生（例如银屑病)、再狭窄或前列腺（例如良性前列腺肥大(BPH)）。在特定实施方案中，治疗过度增殖病症的方法包括向该哺乳动物施用本发明的化合物（例如式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐）。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但是不与另一种BTK抑制剂同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但是不与阿卡替尼同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐是直接施用于该哺乳动物的唯一的BTK抑制剂。

在一些实施方案中，本发明涉及用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐治疗哺乳动物的炎性、免疫性或自身免疫性病症的方法。在特定实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但是不与另一种BTK抑制剂同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但是不与阿卡替尼同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐是直接施用于该哺乳动物的唯一的BTK抑制剂。在所选实施方案中，本发明还涉及用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐治疗疾病的方法，其中该疾病选自肿瘤血管生成、慢性炎性疾病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、炎性肠病、皮肤病如银屑病、湿疹和硬皮病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、年龄相关性黄斑变性、血管瘤、神经胶质瘤和黑素瘤、溃疡性结肠炎、特应性皮炎、隐窝炎、椎关节炎、葡萄膜炎、白塞氏病、风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、结节病、川崎病、青少年特发性关节炎、化脓性汗腺炎、干燥综合征、银屑病关节炎、青少年类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、狼疮、狼疮性肾炎、人类白细胞抗原（HLA）相关疾病、自身抗体、免疫治疗、阿狄森氏病、自身免疫多内分泌综合征1型（APS-1）、自身免疫多内分泌综合征2型（APS-2）、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、多内分泌自身免疫、医源性自身免疫、特发性甲状旁腺功能减退症、白癜风和狼疮性肾炎。

“直接施用”是指式(I)的化合物、或式(II)的化合物、或其任一种的药学上可接受的盐直接给药于患者，而不是通过施用前体分子来间接给药。对于其中在一般意义上提及向温血动物施用式(I)的化合物、或式(II)的化合物、或其任一种的药学上可接受的盐的任何实施方案，提供进一步的实施方案，其中所述化合物或盐直接施用。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗炎性、免疫性或自身免疫性病症的方法，所述炎性、免疫性或自身免疫性病症选自类风湿性关节炎（RA）、青少年RA、青少年特发性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、寻常性银屑病、天疱疮、大疱性类天疱疮、骨关节炎、感染性关节炎、进行性慢性关节炎、风湿性多肌痛、变形性关节炎、创伤性关节炎、痛风性关节炎、莱特尔氏综合征、多软骨炎、急性滑膜炎、强直性脊柱炎、脊柱炎、干燥综合征（SS）、系统性红斑狼疮（SLE）、盘状红斑狼疮（盘状LE）、LE肿胀、狼疮性肾炎（LN）、抗磷脂沉积(antiphospholipidosis)、皮肌炎、多肌炎、自身免疫性血液病、血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、自身免疫（冷）凝集素疾病、自身免疫溶血性贫血、冷球蛋白血症、再生障碍性贫血、嗜中性白细胞减少症、自身免疫血管炎、白塞氏病、抗嗜中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关性血管炎、硬皮病、系统性硬化症、重症肌无力、多发性硬化症（MS）、慢性局灶性脑炎、吉兰-巴雷综合征、慢性疲劳综合征、系统性劳累不耐受疾病、视神经脊髓炎、自身免疫性葡萄膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、格雷夫斯病、甲状腺相关性眼病、慢性甲状腺炎、具有显微镜下多血管炎的肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿病、自身免疫胃炎、自身免疫炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、移植物抗宿主病、特发性口炎性腹泻、自身免疫性肝炎、活动性肝炎（急性和慢性）、特发性肺纤维化、支气管炎、肺间质纤维化、慢性炎性肺病、结节病、特发性膜性肾病、IgA肾病、肾小球硬化症、肾小球性肾炎（伴有或不伴有肾病综合征）、胰腺炎和1型或2型糖尿病。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗炎性、免疫性或自身免疫性病症的方法，所述炎性、免疫性或自身免疫性病症选自糖尿病性视网膜病、巨细胞动脉炎、川崎病、炎性肠病、肠易激综合征、特发性口炎性腹泻、肠病、疱疹后神经痛、风湿性多肌痛、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、炎性疼痛、恶病质、牙周病、中耳炎、尘肺病、单核细胞增多症、肺气肿、肺纤维化、硅肺病、慢性炎性肺病、慢性阻塞性肺病、肺功能不全、肺间质纤维化、惠普尔病、皮肤良性增生（例如银屑病）、由感染引起的肌痛、继发于感染的恶病质、系统性劳累不耐受疾病、动脉粥样硬化、肉芽肿病、具有显微镜下多血管炎的肉芽肿病、化脓性汗腺炎、年龄相关性黄斑变性和淀粉样变性。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗炎性、免疫性或自身免疫性病症的方法，其中所述炎性、免疫性或自身免疫性病症是皮肤病，其中BTK介导的信号参与炎性细胞的募集、活化和/或增殖和皮肤中炎症介质和抗微生物肽的产生。在一些实施方案中，本发明提供了治疗皮肤病的方法，其中所述皮肤病由以下产生：全身性疾病的皮肤表现，其中局部或淋巴结抗原呈递细胞的致敏、淋巴细胞募集、淋巴细胞偏移（skewing），皮肤驻留或皮肤归巢的淋巴细胞的活化，先天性免疫感应，角质形成细胞抗微生物反应，驻留或浸润的髓样树突状细胞、浆细胞样树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和/或朗格汉斯细胞的活化导致皮肤损伤的发展。在一些实施方案中，本发明提供了治疗皮肤病的方法，所述皮肤病选自寻常性银屑病、滴状银屑病、红皮病型银屑病、银屑病指甲、环状脓疱性银屑病、脓疱性银屑病、反转型银屑病、银屑病关节炎、脓溢性皮肤角化病、副银屑病、结节性红斑、掌跖汗腺炎、特应性皮炎、特应性湿疹、脂溢性湿疹、脂溢性皮炎、出汗障碍、酒渣鼻、皮肤红斑狼疮、急性皮肤红斑狼疮、亚急性皮肤红斑狼疮、盘状红斑狼疮、红斑狼疮肿胀、狼疮性肾炎（LN）、红斑狼疮性脂膜炎、多形性红斑、疣、疣状红斑狼疮、白癜风、斑秃、结节性痒疹、扁平苔癣、色素性瘙痒症（purigo pigmentosum）、寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮、红斑性天疱疮、结节性天疱疮、红皮病性结节病、肉芽肿性皮炎、硬皮病、系统性硬化症、系统性硬化症的皮肤表现、弥漫性皮肤肥大细胞增生病、红皮病性肥大细胞增生病、环状肉芽肿、结节性软骨皮炎、接触性皮炎、药疹、线状IgA大疱性皮肤病、嗜酸性粒细胞性皮炎、毛发角化病、淋巴瘤样丘疹病、急性苔藓痘疮样糠疹（PLEVA）、慢性苔藓样糠疹（PLC）、发热性溃疡坏死性穆-哈二氏病（FUMHD）、慢性荨麻疹、类风湿性中性粒细胞性皮炎、冷球蛋白血症性紫癜和高球蛋白血性紫癜。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗过度增殖病症的方法，其中所述过度增殖病症是骨骼的慢性自身免疫性和炎性病症，其中破骨细胞、肥大细胞和髓样细胞中的BTK信号传导参与骨溶解、破骨过程、骨重塑过程的不平衡或骨密度的损失。这种性质的疾病（通常也具有自身免疫性成分）包括骨关节炎、转移造成的骨损失、溶骨性病变、骨质疏松症、强直性脊柱炎、椎关节炎、弥漫性特发性骨骼骨肥厚、痛风性关节炎和与多发性骨髓瘤相关的骨病症。在一些实施方案中，本发明提供了治疗过度增殖病症的方法，其中所述过度增殖病症选自骨关节炎、转移造成的骨损失、溶骨性病变、骨质疏松症、强直性脊柱炎、椎关节炎、弥漫性特发性骨骼骨肥厚、痛风性关节炎和与多发性骨髓瘤相关的骨病症。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗过敏性和特应性疾病的方法，其中活化的B细胞产生IgE抗体且肥大细胞在FcεR接合后脱粒，导致释放促炎因子和急性激活局部组织反应以及慢性改变内皮细胞、神经受体和其它支配器官功能的近端结构。此类状况包括特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、特应性湿疹、寻常性天疱疮、大疱性天疱疮、结节性痒疹、史蒂芬斯-强森综合征、哮喘、气道超敏反应、支气管痉挛、支气管炎、反应性哮喘、慢性阻塞性肺病、1型超敏反应、2型超敏反应、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎和气道上的其它炎性或阻塞性疾病。可以治疗或预防的过敏症尤其包括对以下的过敏：食品、食品添加剂、昆虫毒素、尘螨、花粉、动物材料、金属和某些药物。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗移植物抗宿主病（GVHD）的方法，包括施用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐的步骤，其中该GVHD选自与干细胞移植相关的GVHD、与骨髓移植相关的GVHD、胸腺GVHD、皮肤GVHD、胃肠GVHD、肝GVHD、急性GVHD和慢性GVHD。在特定实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与另一种BTK抑制剂同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与阿卡替尼同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐是直接施用于该哺乳动物的唯一的BTK抑制剂。

在一个实施方案中，该药物抑制神经退行性疾病，所述神经退行性疾病涉及小胶质细胞的活化、巨噬细胞的募集和活化、包括髓样细胞的炎性细胞的浸润（其需要BTK信号传导以传递活化信号、识别活化内皮细胞上的整联蛋白、外渗或原位发育成产生细胞因子和/或趋化因子的细胞）。式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐对BTK的抑制作用将通过抑制与蛋白质毒性聚集，如β淀粉样蛋白沉积物的积聚（淀粉样蛋白斑块）、神经原纤维缠结、τ聚集和过度磷酸化、胞质内包涵体、胞质内双股螺旋形细丝、葡聚糖包涵体、Papp-Lantos体、含泛素的包涵体相关的神经退行性疾病以及其中蛋白质降解控制不足和/或不能处理错折叠蛋白导致神经变性的病症来抑制疾病活动或疾病进展。此类疾病包括散发性和家族性阿尔茨海默氏病、轻度认知缺损、脑淀粉样血管病、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变体、唐氏综合征、亨廷顿病、纹状体黑质变性、多系统萎缩（MSA-P、MSA-C、希-德二氏综合征）、散发性或遗传性肌萎缩侧索硬化（ALS或葛雷克氏症）、原发性侧索硬化、青少年原发性侧索硬化、神经退行性tau病变、散发性或遗传性共核蛋白病、神经元核内包涵体疾病、帕金森病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆（FTDP-17）。

在一个实施方案中，本发明涉及用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐治疗哺乳动物的神经退行性病症的方法，其中抑制胶质细胞、髓样细胞、施万细胞、少突神经胶质细胞和驻留于CNS中的其它骨髓衍生的细胞类型中的炎性过程通过其与BTK的共价相互作用和抑制通过BTK途径的信号传导来实现。施用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐将通过抑制对以下原因造成的错误折叠和/或积聚的细胞内蛋白的免疫识别和炎性反应来预防或减少神经变性：三核苷酸重复病症（聚谷氨酰胺疾病）、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调1、2、3（马查多-约瑟夫病）、6、7和17型；脊髓和延髓肌萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、神经元蜡样脂褐质（neuronal ceroid lipofucsinoses）、额颞叶痴呆（皮克氏病、原发性进行性失语和语义性痴呆）、皮质基底节变性和进行性核上性麻痹。在特定实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与另一种BTK抑制剂同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与阿卡替尼同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐是直接施用于该哺乳动物的唯一的BTK抑制剂。

在另一实施方案中，施用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐可用于抑制哺乳动物的BTK，并由此改善炎症介导的神经元死亡和散发性或遗传性朊病毒疾病、朊病毒病症如克雅二氏症、库鲁病、Gerstmann-Sträussler-Scheinker综合征和导致橄榄体脑桥小脑萎缩、散发性致命性失眠、致命性家族性失眠的病症造成的其它神经炎症效应。在家族性朊病毒病症的情况下，在哺乳动物中施用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐还可以用于预防和/或延迟疾病临床表现的发生，以及在临床迹象发作后减少疾病症状和延缓疾病进展。在特定实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与另一种BTK抑制剂同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与阿卡替尼同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐是直接施用于该哺乳动物的唯一的BTK抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐治疗中枢和/或外周神经系统中自身免疫介导的神经退行性病症的方法。通过抑制BTK介导的自身抗体产生，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐可以减少组织中驻留的骨髓衍生细胞的活化，并抑制循环髓样细胞的转胞吞作用、外渗和浸润，由此减少炎症。此外，用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐治疗可减少在内皮-小胶质细胞界面和间质间隙处的炎性过程的活化，其中已经在自身免疫神经病中观察到了淋巴细胞聚集，所述减少是通过以下方式进行的：1)改变小胶质细胞与内皮细胞之间的串话，2)抑制B淋巴细胞的活化及其同源抗原呈递给循环或浸润的T细胞，和3)减少细胞因子和/或趋化因子的产生。通过与式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐的共价相互作用抑制BTK的这些作用被认为通过抑制B细胞活化、细胞因子活化和APC功能，以及通过改变专业APC（包括浸润的单核细胞、活化的小胶质细胞和少突神经胶质细胞）的发育和成熟状态减少了自身免疫T细胞向灰质和白质中的浸润。由此，使用共价BTK抑制剂如式(I)和(II)的化合物治疗自身免疫介导的神经退行性病症的方法可以通过抑制先天性免疫过程以及减少抗体产生和自身免疫T细胞的活化而减弱疾病的进展。本发明可以减缓动物模型中实验性自身免疫脑病以及人类神经病的进展或诱导其好转，所述人类神经病包括视神经脊髓炎（德维克氏综合征）、格林-巴利综合征、多发性硬化症、临床孤立综合征、复发-缓解型多发性硬化症、恶性多发性硬化症、原发性进行性多发性硬化症、视神经脊髓炎谱疾病(neuromyelitis opticaspectrum diseases)、巴洛同心性硬化、马尔堡多发性硬化症、弥漫性髓鞘硬化症、慢性局灶性脑炎、拉斯穆森脑炎、僵人综合征、重症肌无力、与抗MAG IgM单克隆丙种球蛋白病相关的多发性神经病。在特定实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与另一种BTK抑制剂同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与阿卡替尼同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐是直接施用于该哺乳动物的唯一的BTK抑制剂。

在另一实施方案中，本发明涉及用式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐治疗哺乳动物感染或感染后神经炎症引起的多发性神经病的方法，所述多发性神经病包括Bannworth综合征（莱姆病）、慢性脑脊髓炎（莱姆病）；疱疹后神经痛；HTLV-1相关的脊髓病；进行性多灶性脑白质病；慢性疲劳综合征（CFS）、系统性劳累不耐受疾病（SEID）、肌痛性脑脊髓炎（ME）、病毒后疲劳综合征（PVFS）、慢性疲劳免疫功能失常综合征（CFIDS）；美尼尔症（眩晕-内耳内淋巴液调节）、格林-巴利综合征、肌萎缩侧索硬化、进行性延髓麻痹、婴儿进行性延髓麻痹（或青少年进行性延髓麻痹）、贝尔氏麻痹症、前庭神经炎、急性播散性脑脊髓炎、复发性或多相性播散性脑脊髓炎和慢性脑脊髓炎。在特定实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与另一种BTK抑制剂同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐直接施用于该哺乳动物，但不与阿卡替尼同时施用于该哺乳动物。在一个实施方案中，式(I)或(II)的化合物或其药学上可接受的盐是直接施用于该哺乳动物的唯一的BTK抑制剂。在一个实施方案中，该哺乳动物是人类。

在一些实施方案中，该过度增殖病症是实体瘤癌症，选自膀胱癌、鳞状细胞癌、头颈部癌、胰腺导管腺癌（PDA）、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、乳癌、纤维肉瘤、间皮瘤、肾细胞癌、肺癌、胸腺瘤（thyoma）、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、急性髓样白血病、胸腺癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、眼癌、视网膜母细胞瘤、黑素瘤、眼内黑素瘤、口腔癌症、口咽癌、胃癌（gastric cancer）、胃癌（stomach cancer）、宫颈癌、肾癌、肾脏癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食管癌、睾丸癌、妇科癌症、甲状腺癌、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）相关的癌症（例如淋巴瘤和卡波西肉瘤）、病毒诱导的癌症如宫颈癌（人乳头瘤病毒）、B细胞淋巴组织增生性疾病、鼻咽癌（爱泼斯坦-巴尔病毒）、卡波西肉瘤和原发性渗出性淋巴瘤（卡波西肉瘤疱疹病毒）、肝细胞癌（乙型肝炎和丙型肝炎病毒）和T细胞白血病（人类T细胞白血病病毒-1）、胶质母细胞瘤、食管肿瘤、头颈部肿瘤、转移性结肠癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肾细胞癌、血液肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、IV期黑素瘤和神经胶质瘤。

在一些实施方案中，该过度增殖病症是B细胞血液恶性肿瘤，选自慢性淋巴细胞白血病（CLL）、小淋巴细胞白血病（SLL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性成淋巴细胞白血病（B-ALL）、伯基特淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症（WM）、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征或骨髓纤维化。在一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物的癌症的方法，其中所述癌症是慢性粒细胞白血病、急性髓样白血病、DLBCL（包括活化的B细胞(ABC)和生发中心B细胞(GCB)亚型）、滤泡中心淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、惰性非霍奇金淋巴瘤和成熟B细胞ALL。

在一些实施方案中，该过度增殖病症是CLL的亚型。已经表征了CLL的许多亚型。CLL常常按照在白血病细胞中的免疫球蛋白重链可变区（IgV_H）突变状态分类。R. N. Damle等人, Blood 1999, 94, 1840-47；T. J. Hamblin等人, Blood 1999, 94, 1848-54。具有IgV_H突变的患者通常比没有IgV_H突变的患者存活时间更长。ZAP70表达（阳性或阴性）也用于表征CLL。L. Z. Rassenti等人, N. Engl. J. Med. 2004, 351, 893-901。CpG3处的ZAP-70的甲基化也用于表征CLL，例如通过焦磷酸测序。R. Claus等人, J. Clin. Oncol.2012, 30, 2483-91；J. A. Woyach等人, Blood 2014, 123, 1810-17。CLL也按Binet或Rai标准下疾病的阶段进行分类。J. L. Binet等人, Cancer 1977, 40, 855-64；K. R.Rai, T. Han, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 1990, 4, 447-56。其它常见的突变，如11q缺失、13q缺失和17p缺失可以使用公知的技术如荧光原位杂交（FISH）来评估。在一个实施方案中，本发明涉及治疗人的CLL的方法，其中该CLL选自IgV_H突变阴性CLL、ZAP-70阳性CLL、在CpG3处ZAP-70甲基化的CLL、CD38阳性CLL、以17p13.1（17p）缺失为特征的慢性淋巴细胞白血病和以11q22.3(11q)缺失为特征的CLL。

在一些实施方案中，该过度增殖病症是CLL，其中CLL经历了Richter转化。评估Richter转化（也称为Richter综合征）的方法描述在P.Jain和S.O′Brien, Oncology,2012, 26, 1146-52中。Richter转化是在5-10%的患者中观察到的CLL的亚型。其涉及由CLL的侵袭性淋巴瘤的发展并具有通常不佳的预后。

在一些实施方案中，该过度增殖病症是对淋巴细胞增多症敏感的患者中的CLL或SLL。在一个实施方案中，本发明涉及治疗患者中的CLL或SLL的方法，其中患者表现出由选自病毒感染、细菌感染、原生动物感染或脾切除术后状态的病症引起的淋巴细胞增多症。在一个实施方案中，任何前述实施方案中的病毒感染选自传染性单核细胞增多症、肝炎和细胞巨化病毒。在一个实施方案中，任何前述实施方案中的细菌感染选自百日咳、结核病和布鲁杆菌病。

在一些实施方案中，该过度增殖病症选自骨髓增殖性病症（MPD）、骨髓增殖性肿瘤、真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病（BCR-ABL1-阳性）、慢性中性粒细胞性白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病或肥大细胞增多症。

在一个实施方案中提供了用于治疗的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐在制造药物中的用途。

在一个实施方案中提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐在制造药物中的用途，其中所述药物离体制造。

在其中从一般意义上来说提及药物制造的任何实施方案中，存在进一步的实施方案，其中所述药物离体制造。

在一个实施方案中提供了用于治疗哺乳动物的过度增殖病症、炎性病症、免疫病症或自身免疫病症的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中提供了用于治疗BTK介导的疾病的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该疾病是过度增殖疾病。该过度增殖疾病可以是本文中提及的任何过度增殖疾病。

实施例

现在参照以下实施例描述本文包含的实施方案。仅为说明的目的提供这些实施例，并且本文中包含的公开内容决不应解释为限于这些实施例，而是应解释为包含因本文中提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。实施例中描述的试剂是市售的，或者可以根据文献中描述的程序来制备。

实施例1 –分析方法

以下液相色谱（LC）和质谱（MS）方法可用于表征本发明中包括的化合物。

方法A

LC-MS光谱仪(Agilent)

检测器：DAD (210、254和280 nm)

质量检测器：API-ES (10-2000 amu、正/负离子模式)

洗脱剂(流动相)：A: 在MilliQ-水中0.1%的甲酸，B: 乙腈

柱：Waters XTerra C18 MS，50×54.6 mm ID，2.5 µm

流速：0.5 mL/min

梯度洗脱程序：

方法B：

HPLC：Gilson分析型HPLC系统

柱：Phenomenex Luna C18(2) (100×2.00 mm，5 µm)

检测器：UV/Vis (210/240 nm)

流速：1 mL/min

洗脱剂(流动相)：A: 乙腈，B: 乙腈/MilliQ-水 = 1/9 (v/v)，C: 在MilliQ-水中0.1%的TFA。

梯度洗脱程序：

实施例2 –合成式(I)的化合物。

制备4-[8-氨基-3-(吡咯烷-2-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-N-吡啶-2-基苯甲酰胺。

基本根据WO2013/010868中描述的方法制备该化合物。

制备4-[8-氨基-3-(3,4-二氢-2H-吡咯-5-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-N-吡啶-2-基苯甲酰胺。

将4-[8-氨基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺（1.13克，2.83毫摩尔）悬浮在DCM（50毫升）中。加入N-氯代琥珀酰亚胺（416毫克，3.11毫摩尔），混合物在21℃下搅拌。在10分钟后，该反应混合物为澄清的淡黄色溶液。加入三乙基胺（868微升，6.23毫摩尔），混合物在21℃下持续搅拌。在搅拌15分钟后，形成白色沉淀物。在过滤器上收集沉淀物，用乙腈（20毫升）洗涤并空气干燥。获得白色固体形式的标题化合物（800毫克，70%）。MS (ESI+) m/z 398.2 (M+H)⁺; ¹H NMR (400 Mhz, DMSO-d6,300K): δ = 7.72 (1H, d, J = 5.0 Hz), 6.98 (1H, d, J = 5.0 Hz), 4.45 (1H, t, J= 6.9 Hz), 2.99 (1H, br s), 2.77 - 2.90 (2H, m), 2.09 - 2.20 (1H, m), 1.99 -2.09 (1H, m), 1.78 - 1.89 (1H, m), 1.66 - 1.78 (1H, m)。

制备4-(8-氨基-3-(4-(丁-2-炔酰氨基)丁酰基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺。

将4-[8-氨基-3-(3,4-二氢-2H-吡咯-5-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺（167毫克，1.69毫摩尔）分散在甲醇（26.8毫升）中。在搅拌的同时加入浓盐酸（12 M，670微升，8.04毫摩尔）。在30分钟后，形成白色沉淀物。蒸发所有溶剂，用甲苯（10毫升）冲洗并再次蒸发。所得白色固体分散在丙酮（70毫升）中，加入三乙基胺（705微升，5.06毫摩尔）。逐滴加入丁酰氯（207.4毫克，2.02毫摩尔）在丙酮（2毫升）中的溶液，白色固体逐渐溶解。真空除去挥发物，残余物溶解在氯仿（200毫升）中，用水（200毫升）和盐水洗涤。水相用氯仿（2×50毫升）萃取。合并的有机层用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩，获得657毫克的淡黄色固体。粗产物使用色谱法在硅胶（90克）上用在DCM中的2-5%MeOH（含有10%氢氧化铵）洗脱来提纯。汇集纯产物级分并真空浓缩，获得228毫克（27%）的淡黄色固体。LC-MS (方法A) Rt: 3.76分钟; m/z 482.1 (M+H)⁺; HPLC (方法B)Rt: 5.79分钟; 纯度99.8%; 1H NMR (400 Mhz, DMSO-d6, 300K): δ = 10.91 (1H, s),8.72 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.54 (1H, t, J = 6.0 Hz), 8.42 (1H, d, J = 4.9 Hz),8.22 (3H, t, J = 8.5 Hz), 7.87 (1H, dt, J1 = 1.9 Hz), 7.82 (2H, d, J = 8.5Hz), 7.51 (1H, d, J = 4.8 Hz), 7.19 (1H, dd, J1 = 0.9 Hz, J2 = 4.8 Hz), 6.47(2H, s), 3.11 - 3.26 (4H, m), 1.93 (3H, s), 1.83 (2H, m)。

实施例3 –合成式(II)的化合物。

向4-溴-2-甲氧基-苯甲酸（15.3克，66.2毫摩尔）在二氯甲烷（250毫升）中的溶液中加入吡啶-2-胺（6.9克，72.8毫摩尔）和DIPEA（34.6毫升，198.7毫摩尔）。加入HATU (32.7克，86.1毫摩尔），混合物在室温下搅拌整夜。加入水（200毫升），反应混合物搅拌1小时。在减压下浓缩有机层。加入DCM（50毫升），令溶液结晶整个周末。滤出固体，用二乙基醚（10毫升）洗涤两遍并在减压下干燥以获得浅棕色晶体形式的4-溴-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺（14.4克，66.8%）。LC-MS (方法A) Rt: 6.05分钟；m/z 307.0 + 309.0 (1:1) (M+H)⁺。

向4-溴-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺（14.4克，46.9毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（175毫升）中的溶液中加入双(频哪醇合)二硼（14.3克，56.3毫摩尔）和乙酸钾（9.2克，93.8毫摩尔）。加入 PdCl₂(dppf).DCM（1.9克，2.3毫摩尔），混合物在100℃下搅拌5小时。该反应混合物用水（150毫升）稀释并用乙酸乙酯（150毫升）萃取两遍。合并的有机层在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过快速柱色谱法（0至50%在庚烷中的乙酸乙酯）提纯。含有产物的级分在减压下浓缩。将残余物悬浮在庚烷（150毫升）中并搅拌30分钟。滤出固体，用庚烷（15毫升）洗涤两遍以获得白色固体形式的2-甲氧基-N-(2-吡啶基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺（10.4克，62.6%）。LC-MS (方法A) Rt:6.86分钟; m/z 355.2 (M+H)⁺. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300 K): δ = 10.51 (1H,s), 8.36 (1H, m), 8.26 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.89 (1H, d, J =7.6 Hz), 7.85(1H, m), 7.41 (1H, dd, J1 = 7.6 Hz, J2 = 0.9 Hz), 7.38 (1H, s), 7.17 (1H, m),4.01 (3H, s), 1.33 (12H, s)。

制备1-溴-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺。

向装有磁力搅拌器的2000毫升圆底烧瓶中装入37%的氯化氢（660毫升，7971毫摩尔）。逐份加入(2S)-2-(8-氨基-1-溴-咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯硫酸（205克，399毫摩尔）（大约30分钟），反应混合物在50℃下搅拌8小时。令反应混合物经8小时冷却至室温。反应混合物用MTBE（3×1200毫升）洗涤。向水相中逐滴加入33%在水中的氢氧化钠（~600毫升）直到达到大约14的pH，同时保持温度在20-30℃（出现MTBE层）。在添加后，水相搅拌1小时，并用二氯甲烷（2×1500毫升）萃取。向合并的DCM层中加入活性炭（10克），混合物在40℃下搅拌1小时。在dicalite上过滤除去固体，滤液在减压下浓缩以获得灰白色固体形式的1-溴-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺（112.3克，397.9毫摩尔，99.8%产率）。LC-MS (方法A) Rt: 0.673分钟; m/z 282.0 + 284.0 (1:1) (M+H)+; 1HNMR (400 Mhz, DMSO-d6, 300K): δ = 7.72 (1H, d, J = 5.0 Hz), 6.98 (1H, d, J =5.0 Hz), 4.45 (1H, t , J = 6.9 Hz), 2.99 (1H, br s), 2.77 - 2.90 (2H, m),2.09 - 2.20 (1H, m), 1.99 - 2.09 (1H, m), 1.78 - 1.89 (1H, m), 1.66 - 1.78(1H, m)。

制备4-[8-氨基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺。

将1-溴-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺（112.3克，398.03毫摩尔）、2-甲氧基-N-(2-吡啶基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺（148.04克，417.93毫摩尔）和碘化钾（19.82克，119.41毫摩尔）装载到三颈3升烧瓶中。加入2-丁醇（550毫升）和水（880毫升），所得悬浮液搅拌并同时通入氮气鼓泡。加入三乙胺（165.97毫升，1194.1毫摩尔），悬浮液缓慢溶解。加入双(叔丁基二环己基膦)二氯钯(II)（Pd-166，1.37克，1.99毫摩尔），反应混合物在10分钟内再次脱氧，并在82℃下搅拌整夜以获得棕褐色的悬浮液。令反应混合物冷却至室温。随后将混合物加热至40℃并加入水（1800毫升），在添加后再次令混合物冷却至室温。将该混合物过滤，滤饼用水（500毫升）和庚烷（300毫升）洗涤。固体悬浮在庚烷（500毫升）中并共同蒸发。固体用庚烷（500毫升）再次共同蒸发，并在50℃下在减压下干燥整夜以获得浅黄色固体形式的4-[8-氨基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺（142.11克，330.9毫摩尔，83.1%产率）。LC-MS (方法A) Rt: 2.885分钟; m/z 430.1 (M+H)+; HPLC (方法B)Rt: 1.483分钟; 纯度98.1%; 1H NMR (400 Mhz, DMSO-d6, 300K): δ = 10.49 (1H, s),8.37 (1H, m), 8.30 (1H, d, J = 8.3 Hz), 8.04 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.87 (1H,dt, J1 = 1.9 Hz, J2 = 7.8 Hz), 7.79 (1H, d, J = 5.0 Hz), 7.43 (1H, s), 7.39(1H, dd, J1 = 1.4 Hz, J2 = 8.0 Hz), 7.18 (1H, dd, J1 = 1.0 Hz, J2 = 8.0HzHz), 7.09 (1H, d, J = 4.9 Hz), 6.20 (2H, s), 4.55 (1H, t, J = 7.5 Hz), 4.07(3H, s), 2.90 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.25 (1H, m), 2.12 (1H, m), 1.89 (1H, m),1.78 (1H, m)。

制备4-[8-氨基-3-(3,4-二氢-2H-吡咯-5-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺。

取得4-[8-氨基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺（250毫克，0.58毫摩尔）并部分溶解在DCM（20毫升）中。加入N-氯代琥珀酰亚胺（85.1毫克，0.64毫摩尔），混合物在21℃下搅拌。在10分钟后，反应混合物为澄清黄色溶液。加入三乙胺（177.1微升，1.27毫摩尔），混合物在21℃下持续搅拌。在搅拌30分钟后，形成沉淀物。采用离心将沉淀物分离，获得灰白色固体形式的标题化合物（187.7毫克，75.8%）。HPLC (氯代中间体) (方法B) Rt: 5.596分钟。

制备4-[8-氨基-3-(4-氨基丁酰基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺三盐酸盐

将4-[8-氨基-3-(3,4-二氢-2H-吡咯-5-基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺（187.7毫克，0.44毫摩尔）溶解在甲醇（8毫升）中。加入浓盐酸（174.5微升，2.09毫摩尔）。混合物搅拌1.5小时。通过过滤获得固体，以定量收率获得浅黄色固体形式的标题化合物（269毫克）。HPLC (方法B) Rt: 3.790分钟。

制备4-(8-氨基-3-(4-(丁-2-炔酰氨基)丁酰基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基)-2-甲氧基-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺。

将4-[8-氨基-3-(4-氨基丁酰基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺三盐酸盐（250毫克，0.451毫摩尔）悬浮在含有丙酮（2毫升）的DCM（14毫升）中。加入HATU（289.7毫克，0.762毫摩尔）、三乙胺（254.7微升，1.833毫摩尔）和2-丁酸（64.1毫克，0.762毫摩尔）。混合物在21℃下搅拌整夜。该反应混合物真空浓缩。粗产物采用快速色谱法（0-7%在DCM中的甲醇）提纯。将产物级分合并并真空浓缩。将残余物悬浮在甲醇（2毫升）中，使用离心除去溶剂。固体用二乙醚（2毫升）洗涤并真空干燥，获得灰白色固体形式的标题化合物（76.2毫克，33.1%）。LC-MS (方法A) Rt: 4.300分钟; m/z 512.2 (M+H)⁺;HPLC (方法B) Rt: 6.499分钟; 纯度98.8%; 1H NMR (400 Mhz, DMSO-d6, 300K): δ =10.51 (1H, s), 8.73 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.55 (1H, t, J = 6.3 Hz), 8.38 (1H,m), 8.30 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.06 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.88 (1H, dt, J1 =1.9 Hz, J2 = 4.3 Hz), 7.52 (1H, d, J = 4.8 Hz), 7.50 (1H, d, J = 1.3 Hz),7.44 (1H, dd, J1 = 1.5 Hz, J2 = 8.0 Hz), 7.19 (1H, m), 6.55 (2H, s), 4.08(3H, s), 3.20 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.16 (2H, q, J = 6.0 Hz), 1.93 (3H, s),1.83 (2H, t, J = 7.9 Hz)。

实施例4 –测量BTK和在与BTK中的Cys481相同位置上具有半胱氨酸的其它激酶的激酶活性

。

使用如下概述的IMAP（基于固定化金属离子亲和力的荧光偏振）测定来测量BTK酶活性。

在KR缓冲液（10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，0.01% 吐温-20，0.05% NaN₃，1 mM DTT，2 mM MnCl₂，pH 7.2）中将BTK酶（His-BTK(Millipore catalog# 14-552)）稀释至0.4 U/mL。

在100%DMSO中制造测试化合物由2 mM到63.2 nM的连续稀释液log10。随后将在DMSO中的稀释液在KR缓冲液中稀释50倍。测定中的最终化合物浓度范围为10 μM至0.316nM。

该测定如下进行：5 μL/孔的在KR缓冲液中的测试化合物（测定中的最终DMSO浓度为1%）与5 μl/孔的0.4 U/mL BTK酶（测定中的最终浓度是0.1 U/mL）混合。测试化合物和BTK酶在室温下预培养60分钟，随后加入5 μL/孔的在KR-缓冲液中的200 nM荧光素标记的底物肽（Blk/Lyntide底物，例如#R7188/#R7233，Molecular Devices）。测定中的最终肽底物浓度是50 nM。通过加入5 μL/孔的在KR-缓冲液中的20 μM ATP（最终ATP浓度为5 μMATP，在BTK IMAP测定中的Km ATP）开始激酶测定。在室温下培养2小时后，通过加入40 μL/孔IMAP渐进结合溶液（根据供应商(Molecular Devices)规程，使用75%1×缓冲液A和25%1×缓冲液B与1:600的渐进结合溶液）停止酶反应。在室温下在黑暗中培养60分钟后，读取FP信号。使用平行和垂直滤波器测量535 nm处的荧光以确定磷酸化底物肽与珠粒的结合所导致的旋转差异。作为含有和不含有ATP的对照物的读数差异（ΔmPi）的百分比计算值。通过Dotmatics中的试验结果的曲线拟合来确定IC₅₀值。结果报告在表1中。

使用如下概述的IMAP（基于固定化金属离子亲和力的荧光偏振）测定来测量ITK酶活性。

在KR缓冲液（10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，0.01% 吐温-20，0.1% NaN₃，1 mMDTT，2 mM MnCl₂，pH 7.5）中将ITK酶（Millipore #14-660M）稀释至0.2 U/mL。

该测定如下进行：5 μL/孔的在KR缓冲液中的测试化合物（测定中的最终DMSO浓度为1%）与5 μl/孔的0.2 U/mL ITK酶（测定中的最终浓度是0.05 U/mL(8.4 nM)）混合。测试化合物和ITK酶在室温下预培养60分钟，随后加入5 μL/孔的在KR-缓冲液中的200 nM荧光素标记的底物肽（Blk/Lyntide底物#R8124，Molecular Devices）。测定中的最终肽底物浓度是50 nM。通过加入5 μL/孔的在KR-缓冲液中的20 μM ATP（最终ATP浓度为5 μM ATP，在ITK IMAP测定中的Km ATP）开始激酶测定。在室温下培养2小时后，通过加入40 μL/孔IMAP渐进结合溶液（根据供应商(Molecular Devices)规程，使用60%1×缓冲液A和40%1×缓冲液B与800×稀释珠粒(渐进结合系统，Molecular Devices #R8124)）停止酶反应。在室温下在黑暗中培养60分钟后，读取FP信号。使用平行和垂直滤波器测量535 nm处的荧光以确定磷酸化底物肽与珠粒的结合所导致的旋转差异。作为含有和不含有ATP的对照物的读数差异（ΔmPi）的百分比计算值。通过Dotmatics中的试验结果的曲线拟合来确定IC₅₀值。

使用如下概述的来自ThermoFisher的LanthaScreen测定来测量TEC酶活性。

在激酶缓冲液（50 mM Hepes pH 7.5 + 10 mM MgCl₂ + 1 mM EGTA + 0.01%Brij-35）中混合TEC酶（LifeTech #PV3269）和Eu-抗-HIS抗体（Invitrogen #PV5596）并分别稀释至3和6 nM。酶和抗体在测定中的最终浓度分别为1和2 nM。

示踪剂（激酶示踪剂178，Invitrogen #PV5593）在激酶缓冲液中稀释至3 nM。测定中的最终浓度为1 nM。

在100%DMSO中制造测试化合物由1 mM到3.16 nM的连续稀释液log10。随后将在DMSO中的稀释液在激酶缓冲液（50 mM Hepes pH 7.5 + 10 mM MgCl₂ + 1 mM EGTA +0.01% Brij-35）中稀释33倍。

该测定如下进行：5 μL/孔的TEC酶和EU-抗-His抗体稀释液与5 μL/孔示踪剂稀释液和5 μL/孔的化合物稀释液在激酶缓冲液中混合。测定中的最终化合物浓度为10 µM至0.316 nM，测定中具有1% DMSO最终浓度。在室内培养2小时后，读取615 nm和665 nm处的TR-FRET信号。比率665/615用于计算表示为含有和不含有示踪剂的对照物的读数差值（S/N）的百分比的值。通过Dotmatics中的试验结果的曲线拟合来确定IC₅₀值。

使用Thermo Fisher的Z’-LYTE测定测量BMX、TXK、EGFR、ERBB2、ERBB4、JAK3、BLK激酶活性。在通过加入ATP开始激酶反应前，在测试化合物与激酶一起培养1小时的情况下产生10点剂量响应（测定中的最终浓度为10 µM至0.5 nM，每个稀释步骤稀释3倍）。测定中的ATP浓度是对不同激酶的Km ATP。通过Thermo Fisher处的试验结果的曲线拟合来确定IC₅₀值。

实施例5 –具有ATP竞争的BTK IMAP以研究化合物的共价结合

使用IMAP（基于固定化金属离子亲和力的荧光偏振）测定来测量具有ATP竞争的BTK酶活性。

分别在激酶反应（KR）缓冲液（10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，0.01% Tween-20，0.1% NaN₃，1 mM DTT，2 mM MnCl₂，pH 7.5）中将BTK酶（Millipore）稀释至16 nM。

在100%DMSO中制造测试化合物由1 mM到31.6 nM的连续稀释液log10。随后将在DMSO中的稀释液在KR缓冲液中稀释25倍。最终化合物浓度为10 μM至0.316 nM。

该测定如下进行：5 μL/孔的在KR缓冲液中的测试化合物（测定中的最终DMSO浓度为1%）与5 μl/孔的BTK或ITK酶（测定中的最终浓度对BTK和ITK分别为4和8 nM）混合。测试化合物和激酶预培养0、30或60分钟，随后加入5 μL/孔的在KR-缓冲液中的200 nM荧光素标记的底物肽（Blk/Lyntide底物，Molecular Devices）。测定中的最终肽底物浓度是50 nM。通过加入5 μL/孔的在KR-缓冲液中的20、100或400 μM ATP（最终ATP浓度为5、25或100 μMATP）开始激酶测定。在室温下培养2小时后，通过加入40 μL/孔IMAP渐进结合溶液（Molecular Devices，根据产品说明书，使用60%1×缓冲液A和40%1×缓冲液B与800×稀释珠粒）停止酶反应。在室温下在黑暗中培养60分钟后，读取FP信号。使用平行和垂直滤波器测量535 nm处的荧光以确定磷酸化底物肽与珠粒的结合所导致的旋转差异。作为含有和不含有ATP的对照物的读数差异（ΔmPi）的百分比计算值。通过使用Dotmatics的试验结果的曲线拟合来确定IC₅₀值。

虽然标准IMAP测定显示代谢物M27为BTK抑制剂，需要进一步的测试来确定M27是否为共价抑制剂。在BTK IMAP ATP竞争测定中以可变的预培养时间（0、30和60分钟）和ATP浓度（5、25和100 µM）测试了M27。表2和图2中的结果证实M27是BTK的共价抑制剂。提高预培养时间导致M27的效力的变化。此外，在BTK与M27的预培养后存在ATP竞争的丧失，这是对共价结合的化合物而言的典型结果。

实施例6 - BTK-WT和BTK-C481S LanthaScreen以研究化合物的共价结合

根据制造商规程使用来自ThermoFisher的LanthaScreen测定技术测量对BTK野生型（BTK-WT）和BTK Cys481Ser突变体（BTK-C481S）的抑制活性。

将BTK-WT或BTK-C481S（Genscript）与激酶缓冲液（50 mM Hepes pH 7.5 + 10 mMMgCl₂ + 1 mM EGTA + 0.01% Brij-35）中的Eu-抗-GST抗体（Invitrogen）混合并分别稀释至15和6 nM。测定中对酶和抗体的最终浓度分别为5和2 nM。

示踪剂（激酶示踪剂236，Invitrogen）在激酶缓冲液中稀释至90 nM。测定中的最终浓度为30 nM。

该测定如下进行：5 μL/孔的BTK-WT或BTK-C481S酶和Eu-抗-GST抗体稀释液与5 μL/孔示踪剂稀释液和5 μL/孔的化合物稀释液在激酶缓冲液中混合。测定中的最终化合物浓度为10 µM至0.316 nM，测定中具有1% DMSO最终浓度。混合物在室温下在黑暗中并在不同的培养时间（5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟和300分钟）下培养，读取615 nm和665 nm处的TR-FRET信号。比率665/615用于计算表示为含有和不含有示踪剂的对照物的读数差值（S/N）的百分比的值。通过Dotmatics中的试验结果的曲线拟合来确定各时间点的IC₅₀值。

为了证实M27的共价抑制，根据制造商规程使用来自ThermoFisher的LanthaScreen测定技术研究M27对BTK-WT和BTK Cys481Ser突变体（BTK-C481S）的抑制活性。在用BTK和BTK-C481S培养化合物后在不同时间点进行IC₅₀的测量。图9中描绘的结果证实M27共价结合到BTK上。BTK-WT和BTK-C481S之间的效力差异显示了化合物共价结合到BTK上的效果。使用BTK-C481S的观察到的IC₅₀反映了可逆抑制效力，并且不随时间变化或几乎不随时间变化。用BTK-WT观察到的效力提高是由于在BTK的ATP袋中M27共价结合到C481上的能力。通过化合物对BTK的亲和力和通过亲电体的反应性来确定共价结合的动力学。

使用在BTK-WT上的来自LanthaScreen测定的M27的数据，可以对母体和代谢物计算抑制常数。为了更准确地确定抑制常数，在培养开始后重复LanthaScreen试验以包括额外的更早的时间点。这些试验的结果总结在表3中。根据Krippendorff等人（J BiomolScreen. 2009, 14(8):913-23）的方法，Ki和kinact参数得自随时间经过而变化的IC₅₀值，对于测定中使用的示踪剂，测得的Km = 102 nM。

实施例7 – Ramos B细胞中的BTK靶标占据

在900 µL DMEMF12 + 10% FBS + 2 mM L-谷氨酰胺 + Pen/Strep的总体积中，以每孔2×10⁶个细胞在24孔培养板中接种Ramos B细胞（ATCC，cat no. CRL-1923）。令细胞在5-7% CO₂和37℃下静置1小时。

在100%DMSO中制造测试化合物由10 mM到316 nM的连续稀释液log10，随后稀释100倍到培养基中。

对于每个孔，随后将100 μL转移至含有900 μL Ramos B细胞的孔板中。测定中的最终化合物浓度范围为10 μM至0.316 nM，最终DMSO浓度为0.1%，并在5-7% CO₂和37℃下培养2小时。然后，收集细胞以便使用如下概述的BTK靶标占据ELISA测量BTK靶标占据。

如下通过基于ELISA的方法测定Ramos B细胞样品中药物结合的BTK的百分比：用125 ng/孔抗-BTK Ab（BD Biosciences）涂布OptiPlate 96孔板（Perkin Elmer），并用BSA（Sigma-Aldrich）封闭。含有Ramos B细胞的样品在含有50 mM Tris-HCl pH 7.5、250 mM蔗糖、5 mM MgCl₂、1 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.05%洋地黄皂甙和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）的冰冷裂解缓冲液中裂解。细胞裂解物随后在不存在或存在1 µM 阿卡替尼（导致完全的BTK占据的饱和浓度）的情况下培养1小时。BTK靶标占据ELISA中每孔所用的细胞裂解物的最终量代表2×10⁵个Ramos B细胞。未用过量阿卡替尼培养的细胞裂解物的信号差值代表游离BTK（未被BTK抑制剂占据）。样品与式(II)的生物素标记化合物（100 nM）一起培养1小时。当ATP袋未被共价BTK抑制剂占据时，该探针将与BTK中的ATP袋中的Cys481共价结合。然后将各样品一式两份添加至制备的Optiplate中并在环境温度下培养2小时。该板用PBS + 0.05% 吐温20洗涤四遍。以100 µL/孔（120 ng/mL）加入链霉抗生物素蛋白-HRP（Invitrogen；ELISA级）并在室温下培养1小时。该板用PBS + 0.05% 吐温20洗涤三遍，随后用PBS（不含吐温20）洗涤两遍。加入100 µL/孔的SuperSignal ELISA Femto底物（ThermoFisher Scientific），随后在1分钟后测量化学发光（EnVision®读板器；PerkinElmer）。相对于媒介物对照计算各样品的BTK占据的百分比。来自不含外源性阿卡替尼的媒介物对照物的信号代表100%游离BTK（或0%占据的BTK），而来自含有外源性阿卡替尼的媒介物对照物的信号代表0%游离BTK（或100%占据的BTK）。每种细胞裂解物与1 µM 阿卡替尼的培养用于校正与游离BTK无关的背景信号：

%游离BTK样品X = (样品X – 样品X+药物[1uM]) / (第1天预剂量 – 第1天预剂量+药物[1uM]) × 100%

%占据的BTK = 100% -%游离BTK

使用Ramos（伯基特淋巴瘤）细胞系进行细胞中M27与BTK的结合。将Ramos细胞与一定剂量范围的M27一起培养，并通过ELISA测定BTK靶标占据。结果显示在图10和表4中。这些数据还证实M27在Ramos细胞中共价结合到BTK上，因为在BTK靶标占据ELISA的建立下，可逆的抑制剂将在测定过程中被洗掉。

实施例8 –人外周血单核细胞（PBMC）CD69测定和WB测定

在涂有肝素的Vacutainer管（BD Biosciences，San Jose，CA）中收集全血并用于采用Ficoll-Hypaque（Pharmacia，Uppsala，Sweden）的PBMC的分离。将分离的PBMC在90%FCS/10% DMSO中冷藏保存直至以后使用。

将来自低温储存的细胞在37℃水浴中解冻，用RPMI/1%FCS稀释，洗涤2遍，随后以2×10⁵个细胞/孔在96孔板中在RPMI/10%FCS中接种。

在100% DMSO中制造测试化合物由10 mM到316 nM的连续稀释液log10，随后100倍稀释到RPMI/1%FCS中。对于每个孔，随后将10 μL转移到含有90 μL PBMC细胞的深孔板中。该测定中的最终化合物浓度范围为10 μM至0.316 nM，最终的DMSO浓度为0.1%。随后在存在或不存在测试化合物的情况下将PBMC在37℃培养2小时，接着用山羊F(ab’)2抗-IgM（Southern Biotech，#2022-14，测定中的最终浓度5 μg/mL）刺激18小时。

在用抗-IgM刺激后，将PBMC与抗-CD69-FITC、抗-CD19-BV421（分别为BDBiosciences #555530和#562440）和7AAD（Life Technologies #A1310）一起在冰上培养30分钟。进行流式细胞术，由CD19+门控生命B细胞中的CD69-FITC通道获得荧光值。通过使用GraphPad Prism的试验结果的曲线拟合来确定EC₅₀值。

PBMC测定：将冷冻保存的PBMC解冻，洗涤，并以2×10⁵个细胞/孔在96孔板中悬浮在RPMI+10% FBS中。使用1/2对数剂量滴定（最终浓度为10 μM至0.316 nM）加入测试化合物，并在37℃、5%CO₂下培养2小时。该测定中的最终DMSO浓度为0.1%。对于试验的冲洗部分，将PBMC旋转沉淀，将细胞团块重新悬浮在不含测试化合物的培养基中。重复两次。向冲洗和未冲洗的PBMC中加入山羊抗人IgM F(ab')2抗体（Southern Biotech）（最终浓度5 μg/mL），并将细胞再培养18小时。然后用CD69-FITC和CD19-BV421抗体（BD Biosciences）在4℃下将细胞染色30分钟。洗去未结合的抗体后，加入7-AAD作为活力量度，接着使用FACSVerse仪器（BD Biosciences）进行流式细胞术。使用FCSExpress分析软件（De Novo Software）从CD19+ B淋巴细胞门获得CD69阳性细胞的百分比。通过使用Dotmatics的试验结果的曲线拟合确定EC₅₀值。

WB测定：如上所述，将45 μL血液在RPMI+1% FBS中以1:1稀释，并与测试化合物一起培养。用10 μg/mL小鼠抗人抗IgD抗体（BD Biosciences，测定中的最终浓度为10 μg/mL）刺激血细胞并培养18小时。用CD69-FITC、CD86-PE和CD19-BV421（BD Biosciences）在室温下将细胞染色15分钟，接着用FACS裂解溶液（BD Biosciences）裂解RBC。用1 mL/孔PBS +0.5% BSA洗涤细胞3遍，接着进行流式细胞术分析。使用FCSExpress分析软件（De NovoSoftware）从CD19+ B淋巴细胞门获得CD69的中值荧光强度值。通过使用Dotmatics的试验结果的曲线拟合确定EC₅₀值。

可以在存在抑制剂的情况下活化BCR后评估功能变化的测定中评估BTK抑制剂在原代B细胞中的效力。可以通过流式细胞术测量信号蛋白上的特异性磷酸化表位的抑制和细胞表面上的BCR活化的更远端测量，如CD86（B7-2）和CD69的提高的表达（参见报告R2013003A）。在该研究中，评估了M27对CD69表达的影响。表5中总结了人PBMC制剂和WB中CD69上调的结果。

数据（表5）证实了M27是BTK的共价抑制剂的发现，并且M27共价结合并完全占据Ramos B细胞中的BTK。

实施例9：M27的激酶组分析

对所有可用激酶以1 µM的单一剂量在DiscoveRx处进行采用M27的激酶分析（KINOMEscan）。整体激酶选择性得分在表6中。结果显示了在1 µM下M27的整体激酶选择性状况。在DiscoveRx处，追查在1 µM的M27下被抑制>65%的激酶的剂量响应。由该试验测定的Kd值列举在表7中。该M27对几乎相同的激酶组（除了TXK以外）具有<1 µM的IC₅₀值，但具有附加的BRK(PTK6)抑制。

Claims

1.具有下列结构的式(I)或式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

3.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。

4.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐用于制造药物的用途，所述药物用于治疗BTK介导的过度增殖病症、炎性病症或自身免疫病症。

5.权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐用于制造药物的用途，所述药物用于治疗选自下组的BTK介导的过度增殖病症：慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性成淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和骨髓纤维化。

6.权利要求5的用途，其中所述BTK介导的过度增殖病症是慢性淋巴细胞白血病。

7.权利要求5的用途，其中所述BTK介导的过度增殖病症是小淋巴细胞白血病。

8.权利要求5的用途，其中所述BTK介导的过度增殖病症是套细胞淋巴瘤。

9.权利要求5的用途，其中所述BTK介导的过度增殖病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

10.权利要求5的用途，其中所述BTK介导的过度增殖病症是瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。

11.权利要求3的化合物或其药学上可接受的盐用于制造药物的用途，所述药物用于治疗选自下组的BTK介导的疾病：肿瘤血管生成、慢性炎性疾病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、湿疹、硬皮病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、年龄相关性黄斑变性、血管瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、溃疡性结肠炎、特应性皮炎、隐窝炎、椎关节炎、葡萄膜炎、白塞氏病、风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、结节病、川崎病、青少年特发性关节炎、化脓性汗腺炎、干燥综合征、银屑病关节炎、青少年类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、狼疮、人类白细胞抗原相关疾病、阿狄森氏病、自身免疫多内分泌综合征1型、自身免疫多内分泌综合征2型、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、多内分泌自身免疫、医源性自身免疫、特发性甲状旁腺功能减退症、白癜风和狼疮性肾炎。

12.包含权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

13.权利要求12的药物组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗需要其的患者的BTK介导的过度增殖病症，其中所述BTK介导的过度增殖病症选自慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性成淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和骨髓纤维化。

14.包含权利要求3的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

15.权利要求14的药物组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗选自下组的BTK介导的疾病：肿瘤血管生成、慢性炎性疾病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、湿疹、硬皮病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、年龄相关性黄斑变性、血管瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、溃疡性结肠炎、特应性皮炎、隐窝炎、椎关节炎、葡萄膜炎、白塞氏病、风湿性多肌痛、巨细胞动脉炎、结节病、川崎病、青少年特发性关节炎、化脓性汗腺炎、干燥综合征、银屑病关节炎、青少年类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、狼疮、人类白细胞抗原相关疾病、阿狄森氏病、自身免疫多内分泌综合征1型、自身免疫多内分泌综合征2型、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、多内分泌自身免疫、医源性自身免疫、特发性甲状旁腺功能减退症、白癜风和狼疮性肾炎。