CN110279765A - 黄连解毒汤效应组分群及其制备方法和治疗阿尔茨海默病的应用 - Google Patents

黄连解毒汤效应组分群及其制备方法和治疗阿尔茨海默病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药技术领域，尤其是涉及一种黄连解毒汤效应组分群及其制备方法和治疗阿尔茨海默病的应用。黄连解毒汤效应组分群的制备方法，包括如下步骤：采用水对黄连解毒汤干粉进行回流提取过滤得水提液；将所述水提液洗脱分离，收集分子量≤1500的成分，合并，得到所述黄连解毒汤效应组分群。本发明的黄连解毒汤效应组分群可用于制备治疗阿尔茨海默症的药物，以及制备用于提高肠道中毛螺菌科丰度、螺杆菌科丰度、乳杆菌科丰度和/或普雷沃氏菌科_UCG_001丰度的药物，以及制备用于降低肠道中拟杆菌科丰度的药物。本发明的黄连解毒汤效应组分群的制备方法，分离得到特定的小分子部位群，能够改善活性和功效，同时减轻对机体的副作用。

Description

黄连解毒汤效应组分群及其制备方法和治疗阿尔茨海默病的 应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其是涉及一种黄连解毒汤效应组分群及其制备方法和治疗阿尔茨海默病的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)习称老年痴呆，是一种神经退行性疾病，多发于65岁以上的老年人。AD以老年斑、神经纤维缠结和广泛地海马神经元缺失为其主要的病理特征。现代医学将老年痴呆主要分为AD、血管性痴呆、混合性痴呆及其他痴呆。其中最常见的两种是AD和血管性痴呆。AD发病隐匿，病程长，一旦发生极难逆转。AD发病历程较为复杂，目前在医学界关于其发病和预防机制的研究正如火如荼地进行，然而关于其真正的发病原因尚不明确，多集中在以下几种假说：Aβ的神经毒性假说、Tau蛋白过度磷酸化假说、基因突变假说、胆碱能神经元受损假说、兴奋性氨基酸毒性假说、神经细胞钙平衡失调假说和高胆固醇假说等等。
黄连解毒汤是清热解毒的代表方，主要是以黄芩、黄连、黄柏、栀子以2:3:2:3的比例进行配制而成。在传统中医药理论指导下，以上四味药均有苦寒之性，易伤脾胃，不易过量或者久服。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种黄连解毒汤效应组分群的制备方法，以解决现有技术中存在的黄连解毒汤久服伤脾胃，影响生活状态的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种采用上述制备方法制备得到的黄连解毒汤效应组分群，该黄连解毒汤效应组分群为小分子部位群，相对于普通的黄连解毒汤呈现出不同的生物活性等，在更低的剂量下具有更优或相应的功效。
本发明的第三目的在于提供一种上述黄连解毒汤效应组分群在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种上述黄连解毒汤效应组分群在制备用于提高肠道中毛螺菌科丰度、螺杆菌科丰度、乳杆菌科丰度和/或普雷沃氏菌科_UCG_001丰度的药物中的应用。以及上述黄连解毒汤效应组分群在制备用于降低肠道中拟杆菌科丰度的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种黄连解毒汤效应组分群的制备方法，包括如下步骤：
采用水对黄连解毒汤干粉进行回流提取过滤得水提液；
将所述水提液洗脱分离，收集分子量≤1500的成分，合并，得到所述黄连解毒汤效应组分群。
黄芩、黄连、黄柏、栀子四味药均有苦寒之性，易伤脾胃，不易过量或者久服。在采用现有技术中的黄连解毒汤进行实验时，以黄连解毒汤的临床折合剂量作用于Aβ25-35和鹅膏蕈氨酸联合用药诱导AD大鼠一周后，发现其生活状态明显下降(包括毛色萎黄)。
本发明通过对黄连解毒汤进一步处理，获取小分子部位群，以改善现有黄连解毒汤的活性和功效，同时减轻对脾胃等的副作用。在较低的剂量条件下，即可具有良好的功效。
在本发明一些具体实施方式中，在回流提取时，黄连解毒汤干粉和水的质量比为1﹕(100～400)，优选1﹕(200～400)，更优选为1﹕300。
如在不同实施方式中，黄连解毒汤干粉和水的质量比可以为1﹕100、1﹕120、1﹕140、1﹕160、1﹕180、1﹕200、1﹕220、1﹕240、1﹕260、1﹕280、1﹕300、1﹕320、1﹕340、1﹕360、1﹕380、1﹕400等等。
在本发明一些具体实施方式中，回流提取的时间为0.5～2h，优选为1～1.5h。
如在不同实施方式中，回流提取的时间可以为0.5h、0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等等。采用上述回流提取时间，能够有效提取出黄连解毒汤干粉中的小分子部位群成分。
优选的，所述洗脱分离包括：采用葡聚糖凝胶作为填料装柱，以水为流动相进行洗脱分离。
葡聚糖凝胶是一种多孔性网状结构的凝胶，含有大量的羟基，具有亲水性，在水中溶胀。利用其分子筛作用，同时利用水提液中的成分与葡聚糖凝胶相互作用，能够分离得到水提液中的目标成分。通过上述填料装柱洗脱分离后，得到的黄连解毒汤效应组分群具有良好的功效。
优选的，所述葡聚糖凝胶的分离分子量≤2000。更优选的，所述葡聚糖凝胶的分离分子量≤1500。
通过采用上述分离分子量的葡聚糖凝胶作为填料，能够提高对黄连解毒汤效应组分群的分离效率和准确率。利用葡聚糖凝胶填料的分子筛作用，对成分进行有效洗脱分离。
在本发明的一些具体实施方式中，所述葡聚糖凝胶为G-15规格的葡聚糖凝胶，能够将水提液中的大分子部位和小分子部分有效分离。
优选的，所述收集分子量≤1500的成分的方法包括：收集流出量为1.8～5倍柱体积之间的洗脱液。更优选的，收集流出量为2～4倍柱体积之间的洗脱液。
通过葡聚糖凝胶的分子筛作用，将水提液中的成分进行分离，分子量大的成分通过葡聚糖凝胶之间的孔隙通过，流程短，移动速度快，先流出凝胶柱；分子量小的成分通过葡聚糖凝胶内部的孔隙通过，流程长，移动速度慢，后流出凝胶柱。通过收集上述流出量的洗脱液，将分子量1500及以下的成分收集，除溶剂得到所述黄连解毒汤效应组分群。
在本发明一些具体实施方式中，除去收集的洗脱液中的溶剂，得到小分子部位群。可通过浓缩、干燥等方法除去溶剂。
在本发明一些具体实施方式中，所述柱的内径为2.5～2.7cm，柱高为55～65cm。优选的，所述柱的内径为2.6cm，柱高为60cm。
优选的，在所述洗脱分离前，对所述水提液进行浓缩处理。将所述水提液浓缩后再进行洗脱分离，能够提高水提液中小分子部位的分离效率。
所述浓缩可采用常规的浓缩操作，以实现除去部分溶剂即可。
在本发明的一些具体实施方式中，所述浓缩处理的浓缩率为2～15，优选为5～10。浓缩率是指浓缩前的液体体积与浓缩后的液体体积之比。
如在不同实施方式中，浓缩处理的浓缩率可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等等。
优选的，浓缩处理后，静置，分别收集上清液和沉淀；将所述沉淀加水超声处理，得到澄清液，与上清液合并，进行洗脱分离。
通过对浓缩液中的易沉淀物质进行再次溶解，使其上样后能够通过填料有效分离，避免沉淀上样，分离不均，且降低黄连解毒汤效应组分群的得率。
当将沉淀加少量水超声处理一次后，仍旧含有沉淀，可先离心分离，分别收集上清液和沉淀；再将沉淀重新加少量水超声溶解，得到澄清液，与上清液合并即可。该步骤可重复多次，使沉淀溶解即可。其中的少量水可根据实际操作进行选择，尽可能少加水，但保证重复2～3次超声、离心等处理后全部溶解即可。
本发明采用的黄连解毒汤干粉为常规的黄连解毒汤制备方法制备得到的。在本发明优选的实施方式中，所述黄连解毒汤干粉的制备方法包括如下步骤：
黄芩、黄连、黄柏、栀子按质量比为2﹕3﹕2﹕3，采用水煎煮，收集滤液浓缩，减压干燥制粉。
优选的，所述水煎煮的方法包括：依次采用10倍量、8倍量水煎煮。每次优选煎煮1～2h，更优选1.5h。分两次煎煮后，合并两次收集的滤液。
优选的，所述减压干燥的时间为75～85℃，优选为80℃。
本发明还提供了黄连解毒汤效应组分群，所述黄连解毒汤效应组分群采用上述任一制备方法制备得到。
通过上述方法制备得到的黄连解毒汤效应组分群为小分子部位群，能够在更低的剂量下具有更优或至少等同的功效。同时避免了现有技术中服用黄连解毒汤损伤脾胃的问题。
优选的，所述黄连解毒汤效应组分群包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、黄柏内酯、巴马亭、小檗碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、京尼平苷、京尼平-1-O-β-龙胆双糖苷。
本发明还提供了一种上述黄连解毒汤效应组分群或上述任一方法制备得到的黄连解毒汤效应组分群在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
本发明还提供了一种上述黄连解毒汤效应组分群或上述任一方法制备得到的黄连解毒汤效应组分群在制备用于提高动物肠道中毛螺菌科、螺杆菌科、乳杆菌科、普雷沃氏菌科_UCG_001中的一种或多种微生物丰度的药物中的应用。
其中，所述螺杆菌科优选包括螺杆菌属(g_Helicobacter)。所述乳杆菌科优选包括乳杆菌属(g_lactobacillus)。
本发明还提供了一种上述黄连解毒汤效应组分群或上述任一方法制备得到的黄连解毒汤效应组分群在制备用于降低动物肠道中拟杆菌科微生物丰度的药物中的应用。
调节上述肠道中菌群的丰度，能够改善肠道环境，使肠道菌群平衡，避免肠道菌群失调。可用于制备治疗肠道菌群失调的药物。
优选的，所述动物为AD动物。
与现有技术相比，本发明具有以下有效效果：
(1)本发明的黄连解毒汤效应组分群的制备方法，通过一定的水提取和洗脱处理，分离得到特定的小分子部位群，能够改善活性和功效，同时减轻对机体的副作用；
(2)本发明的黄连解毒汤效应组分群，能够在更低的剂量下具有更优的功效；
(3)本发明的黄连解毒汤效应组分群可用于制备治疗阿尔茨海默症的药物，能够在较低剂量下，具有更好的效果；同时还能够调节肠道中特定菌群的丰度，使肠道菌群平衡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的黄连解毒汤效应组分群的ESI正离子模式下的总离子流图；
图2为本发明实施例提供的黄连解毒汤效应组分群的ESI负离子模式下的总离子流图；
图3为本发明实验组Con、Mod、XYZ、H-Z、Ber、Don的Morris水迷宫实验；其中，A为各组在第一天、第二天、第三天的潜伏期；B为各组的运动轨迹；C为各组的小鼠的路程百分比；D为各组的小鼠的时间百分比；E为各组小鼠的穿越平台次数；
图4本发明实验组Con、Mod、XYZ、H-Z、Ber、Don的PLS-DA分析图；
图5本发明实验组Con、Mod、XYZ、H-Z、Ber、Don的OTU在科水平的柱状图分析；
图6本发明实验组Con、Mod、XYZ、H-Z、Ber、Don的OUT在属水平的柱状图分析。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
各实施例采用的黄连解毒汤干粉可通过如下方法制备得到：
(1)按质量比为2﹕3﹕2﹕3取黄芩、黄连、黄柏、栀子四味药材，采用10倍质量的水对上述药材进行煎煮1.5h，过滤收集滤液；然后再采用8倍质量的水对上述过滤后药材再次煎煮1.5h，过滤收集滤液；合并两次煎煮的滤液；
(2)将步骤(1)合并的滤液浓缩，于80℃下减压干燥制备得到黄连解毒汤干粉。
黄连解毒汤干粉的制备方法优选为上述制备方法，但不局限于此。
实施例1
本实施例提供了一种黄连解毒汤效应组分群及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)取黄连解毒汤干粉和水按质量比为1﹕300，加热回流提取1h后，趁热过滤，收集水提液，将水提液旋蒸浓缩至30mL；
(2)浓缩后，静置过夜，离心分别得到上清液和沉淀；向沉淀中加入少量水超声使沉淀溶解，离心分别得到上清液和沉淀，再将沉淀中加入少量水超声使沉淀溶解，离心得到上清液；合并所有上清液得到样品；
(3)采用葡聚糖凝胶G-15作为填料装柱(柱内径2.6cm，柱高60cm)，以纯净水作为流动相，将步骤(2)得到的样品上样洗脱；每30mL洗脱液为一流份进行分接，收集流出量为2～4倍柱体积之间的洗脱液，其中的成分分子量≤1500；
如收集的洗脱液中仍旧存在分子量＞1500的成分，重复上述洗脱程序，直至得到的洗脱液中无分子量＞1500的成分；
(4)将步骤(3)中收集得到的洗脱液(其中成分的分子量≤1500)旋蒸浓缩、蒸干，得到所述黄连解毒汤效应组分群。
本实施例得到的黄连解毒汤效应组分群的质量为最初黄连解毒汤干粉的质量的51.6％。
实施例2
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(1)中，黄连解毒汤干粉和水的质量比为1﹕200。
实施例3
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(1)中，黄连解毒汤干粉和水的质量比为1﹕400。
实施例4
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(1)中，回流提取的时间为1.5h。
实验例1
利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS对实施例1制备得到的黄连解毒汤效应组分群进行检测分析，分别得到其正、负离子模式下的总离子流图，如图1和2所示。
根据精确相对分子质量并结合相关离子碎片信息，对其中的化学成分进行分析鉴定在正、负离子模式下从黄连解毒汤效应组分群中共分析鉴定了13个化学成分，包括6个黄酮类化合物，5个生物碱类化合物，2个环烯醚萜类化合物，结果详见表1。
表1黄连解毒汤效应组分群在正、负离子模式下的化合物鉴定
其中，检测分析中采用的色谱条件和质谱条件分别如下：
色谱条件：色谱柱：Waters HSS T3-C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)；梯度洗脱：洗脱程序见表2；流速：0.3mL/min；进样量：8uL；柱温：35℃。
表2流动相梯度洗脱程序
t<sub>R</sub>(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 5 95
2 10 95
5 12 88
15 20 80
20 20 80
25 30 70
30 95 5
35 95 5
质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正、负离子分别检测，一级、多级模式分别扫描；离子源电压3.5kV，毛细管加热温度为350℃，鞘气压力0.24MPa，辅气压力为0.07MPa，离子源温度350℃，鞘气、辅助气均为氮气；一级全扫质量扫描m/z 50～1500，分辨率30000；二级质谱采用data dependent数据依赖性扫描，在一级扫描基础上选取其前三强进行诱导碰撞解离(CID)获取其二级质谱数据。
实验例2
取盐酸小檗碱片和盐酸多奈哌齐片研碎成粉末，称取适量的黄连解毒汤干粉(H-Z)、实施例1制备得到的黄连解毒汤效应组分群(XYZ)、盐酸小檗碱片粉末(Ber)和盐酸多奈哌齐粉末(Don)，分别用生理盐水配制成适量浓度的混悬溶液，给药前混匀。
1、实验动物分组及处理
4月龄SPF级C57BL/6J-TgN(APP/PS1)双转基因小鼠55只和4月龄C57BL/6J野生型小鼠11只，体重在(30±5)g购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号为(2005674)。其中，购买的4月龄的66只C57BL/6小鼠适应性饲养4天后，在SPF(SpecificPathogen Free)级别的动物房饲养，开始给药，一天一次，每天光照12h，保持20±1℃和50±10％相对湿度，于SPF屏障实验室饲养4个月。本研究中所有实验和动物护理均按照美国国家卫生研究院《实验动物护理和使用卫生指南》(NIH出版物第8023号，1978年修订版)和中国实验动物管理立法的规定和一般建议进行。本实验共分为6组：野生型的C57BL/6小鼠作为正常组(Con组；n＝11)，剩余的AD小鼠随机分为模型组(Mod组；n＝11)、实施例1的黄连解毒汤效应组分群组(XYZ组；n＝11)、黄连解毒汤干粉组(H-Z组；n＝11)、小檗碱组(Ber组；n＝11)和盐酸多奈哌齐组(Don组；n＝11)。
其中正常组和模型组给予正常饮水饲养；XYZ组、H-Z组、Ber组、Don组均给予灌胃给药，给药剂量分别为2.5mg/kd/d、10mg/kd/d、100mg/kd/d、2mg/kd/d。连续给药16周。
2、各组对APP/PS1双转基因小鼠认知能力，中枢Aβ堆积和tau磷酸化的影响
2.1Morris水迷宫行为研究
(1)定位航行实验：如图3A所示，在第一天的训练中，正常组小鼠和模型组小鼠逃避潜伏期已表现出显著不同(P＜0.05)，各给药组小鼠和模型小鼠的逃避潜伏期相似无显著性差异。随着训练时间的次数增加，每组小鼠的逃避潜伏期逐渐减小，正常小鼠与模型小鼠空间记忆能力的差距越来越显著，给药组的优势也越来越明显。第三天训练结束后，模型组小鼠的潜伏期远远大于正常小鼠(P＜0.001)，XYZ组、H-Z组、Ber组和Don组小鼠的潜伏期均显著低于模型组小鼠(P＜0.001)。
(2)空间探索实验：如图3B所示，从运动轨迹图来看，正常组与各给药组小鼠运动轨迹看似“杂乱无章”但具有目的性，而模型组小鼠运动轨迹“有章可循”却无目的性。如图3C～3E所示，正常组与模型组相比，模型组小鼠在目标象限的路程百分比(P＜0.05)、时间百分比(P＜0.05)和穿越平台次数(P＜0.05)显著降低。给药后，各给药组小鼠的路程百分比、时间百分比和穿越平台次数均发生显著性回转。不同药物对以上三个指标的回转程度均遵循以下顺序：XYZ组＞H-Z组＞Don组＞Ber组。
H-Z组和XYZ组能够改善APP/PS1转基因小鼠认知功能，XYZ组的效果更佳。
2.2中枢Aβ、Tau蛋白和氧化应激状态研究
在AD小鼠大脑的海马区和皮层区均发现了大量的Aβ堆积诱导的老年斑，XYZ和H-Z给药组海马区和皮层区的Aβ的沉积显著减少，值得注意的是XYZ组的作用优于H-Z组、Ber组和Don组。同时在小鼠的皮层区观察到了TNFs但并未在海马区观察到。整体来说，各组小鼠脑部并未出现明显的TNFs聚集情况，但组间表现仍有差异，其中AD小鼠皮层中TNFs最为显著。与正常组比，APP/PS1转基因小鼠中枢过氧化物歧化酶(SOD)显著下降，而谷胱甘肽过氧化物酶(GPX1)和丙二醛(MDA)变化不明显。给药四个月后，XYZ组和Ber组能够显著升高AD小鼠脑组织中SOD的水平；XYZ组能够显著降低脑组织中MDA的水平；H-Z组和Ber组具有升高GPX1的趋势。
2.3中枢神经递质水平研究
与正常组相比，APP/PS1AD小鼠中枢谷氨酸、蛋氨酸和天冬酰胺水平发生显著变化。XYZ组和H-Z组能够显著升高中枢大部分的所检测的神经递质的水平(苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、苏氨酸和天冬酰胺)，以及显著降低L-半胱氨酸。另外H-Z组还可以显著升高AD鼠脑组织中谷氨酸、胆碱、γ-氨基丁酸(GABA)水平，XYZ组显著降低脑组织中尿素的水平。Ber组能够显著降低中枢瓜氨酸、蛋氨酸、尿素的水平。
3、各组对APP/PS1转基因小鼠中枢和外周炎症环境及脂质代谢的影响
3.1中枢和外周炎症因子的表达研究
与Con组相比，在AD小鼠脑组织和外周血清系统中分别发现3个和4个差异性细胞因子。其中IFN-γ(Mod：下降，P＜0.05)和IL-6(Mod：上升，P＜0.05)在AD小鼠脑组织和外周血清中均发生了显著性的变化。此外，还发现AD小鼠的脑组织中IL-12p70显著性降低(P＜0.01)，外周血清IL-13水平显著降低(P＜0.01)、MCP-1显著升高(P＜0.01)。给药后，AD小鼠中枢和外周细胞因子水平均发生不同程度的变化。XYZ和H-Z能够回调中枢IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和MIP-2的水平，同时还能回调外周IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12p70、IL-13、MCP-1和MIP-2。
3.2中枢和外周脂质代谢研究
靶向脂质：中枢系统共发现40个病理markers(PCs＝21；PEs＝5；GlcCer＝3；Cers＝4；SM＝7)，外周系统共发现13个病理markers(PCs＝11；PEs＝1；GlcCer＝1；Cers＝4)。与Con组相比，17/21PCs，5/5PEs，3/3GlcCers，4/4Cers和5/7SMs在APP/PS1-AD小鼠中枢系统中显著下降，其余的显著上升。XYZ组和H-Z组给药后，18/21PCs，3/5PEs，1/3GlcCers，3/4Cers和2/7SMs具有不同回调趋势。同时，在外周系统中，除了PC(20:4/18:0)，其他的病理markers在Mod组中均下降，XYZ组和H-Z组对外周所有病理markers具有回调作用。结合有监督的偏最小二乘(PLS-DA)分析，如图4所示，相对于Ber组来说，XYZ组和H-Z组对AD小鼠中枢和外周系统脂质代谢调节机制相似，但XYZ组和H-Z组对外周脂质代谢调节的一致性不如对中枢脂质代谢调节。
多元不饱和脂肪酸：与正常组相比，AD小鼠中枢多元不饱和脂肪酸(PUFAs)的水平变化不明显，而外周亚油酸(LA)、花生四希酸(AA)、r-亚麻酸(GLA)和油酸(OLA)的水平显著降低。给药4个月后，XYZ组和H-Z组能够显著升高AD小鼠中枢AA、DHA、EPA、LA和OLA水平并显著降低GLA的含量，但对AD小鼠外周PUFAs的作用不明显。Ber组和Don组对AD小鼠中枢和外周多元不饱和脂肪酸的调节作用趋势与XYZ和H-Z相似，但Ber组对AD小鼠中枢和外PUFAs的调节作用明显不及XYZ组和H-Z组。
4、各组对APP/PS1双转基因小鼠外周血清胆汁酸代谢的影响
基于LC-QQQ-MS/MS技术，对AD小鼠血清的胆汁酸进行含量测定。通过结果分析发现AD小鼠外周血清胆汁酸代谢出现异常。与正常组相比，AD小鼠血清中DCA(P＜0.001)、T-MCA(P＜0.05)、THDCA(P＜0.05)显著升高。在药物的干预下，AD小鼠血清中胆汁酸水平均有不同程度的回调。XYZ组能够显著下调AD模型鼠血清中DCA(P＜0.05)、T-MCA(P＜0.05)、THDCA(P＜0.05)的水平；H-Z组能够显著降低血清中THDCA的水平(P＜0.05)；Ber组对AD小鼠血清中T-MCA(P＜0.05)和THDCA(P＜0.05)具有显著下调作用；而Don组对THDCA(P＜0.05)下调作用较大。
5、各组对APP/PS1转基因小鼠肠道菌群结构的影响
采用16SRNA高通量测序技术研究各组对APP/PS1小鼠肠道菌群的影响。根据PCA得分统计分析图，可以直观地发现所有检测的样品主要分为三大阵营，其中Con组和Mod组的样品较其他组来说虽然相互接近，但是能够明显分离，表明APP/PS1小鼠肠道微生物结构发生紊乱。XYZ、H-Z和Don对APP/PS1小鼠肠道菌群的调节作用相似，Ber对APP/PS1小鼠肠道菌群的调节机制有别于XYZ、H-Z和Don。与正常组相比：模型组拟杆菌门和放线菌门相对丰度降低，而变形菌门和厚壁菌门的相对丰度升高。给药后，与模型组相比，拟杆菌门的相对丰度在XYZ组、H-Z组和Don组降低，在Ber组升高；厚壁菌门相对丰度在H-Z组和Ber组降低，在XYZ组和Don组升高；变形菌门和放线菌门的相对丰度在XYZ组、H-Z组、Ber组和Don组均升高。
分别从科和属的水平上对样本OTU的丰度进行柱状图分析，如图5和6所示，从不同的菌在不同组间的不同颜色分布可以直观的发现一定的规律即：Ber组在科水平上的菌群的结构变化明显有别于其他组。
在科的水平上，利用One-away ANOVA进行显著性分析，结果表明：与正常组相比：f__Bacteroidales_S24-7_group(P＜0.0001)在模型组显著性升高，毛螺菌科(f-Lachnospiraceae：P＜0.01)在模型组中显著降低。给药后，XYZ组和Ber组能够显著回调f-Lachnospiraceae的相对丰度；f_Bacteroidales_S24-7_group能够被Ber组显著回调。除此之外，与模型组相比，XYZ组螺杆菌科(f_Helicobacteraceae)和乳杆菌科(f_Lactobacillaceae)相对丰度显著升高，f_Bacteroidetes显著降低；H-Z组和Ber组普雷沃氏菌科(f_Prevotellaceae)相对丰度显著升高；Don组f_Helicobacteraceae，f_Prevotellaceae相对丰度升高，f_Bacteroidetes相对丰度降低。
在属的水平上，利用One-away ANOVA进行显著性分析，显示了前20名的属，结果表明：与正常组相比：g_Unidentified(P＜0.0001)和g-Lachnospiraceae_NK4A136_group(P＜0.05)在模型组显著性升高。除此之外，与模型组相比，XYZ组g_Helicobacter、g_lactobacillus和g_prevotellaceae_UCG_001相对丰度升高，Ber组g_Bacteroides相对丰度升高；Don组g_Helicobacter、g_prevotellaceae_UCG_001相对丰度显著升高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种黄连解毒汤效应组分群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用水对黄连解毒汤干粉进行回流提取，过滤得水提液；
将所述水提液洗脱分离，收集分子量≤1500的成分，合并，得到所述黄连解毒汤效应组分群。
2.根据权利要求1所述的黄连解毒汤效应组分群的制备方法，其特征在于，所述洗脱分离包括：采用葡聚糖凝胶作为填料装柱，以水为流动相进行洗脱分离；
优选的，所述葡聚糖凝胶的分离分子量≤2000；
更优选的，所述葡聚糖凝胶的分离分子量≤1500；
优选的，所述葡聚糖凝胶为葡聚糖凝胶G-15。
3.根据权利要求2所述的黄连解毒汤效应组分群的制备方法，其特征在于，所述收集分子量≤1500的成分的方法包括：收集流出量为1.8～5倍柱体积之间的洗脱液；
优选的，收集流出量为2～4倍柱体积之间的洗脱液。
4.根据权利要求2所述的黄连解毒汤效应组分群的制备方法，其特征在于，所述柱的内径为2.5～2.7cm，柱高为55～65cm；
优选的，所述柱的内径为2.6cm，柱高为60cm。
5.根据权利要求1所述的黄连解毒汤效应组分群的制备方法，其特征在于，在回流提取时，所述黄连解毒汤干粉和水的质量比为1﹕(100～400)；
优选的，所述黄连解毒汤干粉和水的质量比为1﹕(200～400)；
优选的，所述回流提取的时间为0.5～2h；
更优选的，所述回流提取的时间为1～1.5h。
6.根据权利要求1所述的黄连解毒汤效应组分群的制备方法，其特征在于，在所述洗脱分离前，对所述水提液进行浓缩处理；
优选的，所述浓缩处理的浓缩率为2～15；
优选的，所述浓缩处理后，静置，分别收集上清液和沉淀；将所述沉淀加水超声处理，得到澄清液，与上清液合并，进行洗脱分离。
7.采用权利要求1-6任一项所述的黄连解毒汤效应组分群的制备方法制备得到的黄连解毒汤效应组分群。
8.根据权利要求7所述的黄连解毒汤效应组分群，其特征在于，所述黄连解毒汤效应组分群包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、黄柏内酯、巴马亭、小檗碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、京尼平苷、京尼平-1-O-β-龙胆双糖苷。
9.权利要求7或8任一项所述的黄连解毒汤效应组分群在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
10.权利要求7或8任一项所述的黄连解毒汤效应组分群在制备用于提高动物肠道中毛螺菌科、螺杆菌科、乳杆菌科、普雷沃氏菌科-UCG-001中的一种或多种微生物丰度的药物，和/或在制备用于降低动物肠道中拟杆菌科微生物丰度的药物中的应用；
优选的，所述动物为AD动物。
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