CN106501409B - 一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法 - Google Patents

一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法 Download PDF

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Abstract

一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法，本发明涉及基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法。本发明的目的是为了解决现有老年痴呆症的尿液代谢标志物尚未阐明的缺点。一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法具体过程为：步骤一、老年痴呆大鼠模型的建立及评价；步骤二、利用生物标记物评价开心散对AD大鼠模型建立不同阶段的干预作用。本发明用于代谢标志物鉴定领域。

Description

一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法
技术领域
本发明涉及基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法。
背景技术
老年性痴呆(AD)是一种慢性神经系统退行性疾病。AD不仅严重影响人类的身体健康和生活质量，同时也给患者家庭和社会带来沉重负担。AD是一种复杂性疾病，其发生发展是一种连续的病理生理过程，由于其发病的不可逆性，AD基础和临床研究的窗口应该前移，因此对AD早期的发生发展机制、早期诊断和早期干预就尤为重要。目前，AD的诊断标准主要包括量表的简易精神状态评价量表(MMSE)测试，以及amyloid-β的神经元成像。开心散是中医益智、安神定惊、治疗健忘的基本方，具有养心、益智、益气、安神定志和祛痰之功效，主要用于治疗心气不足，神志不宁，健忘失眠，心怯怔忡等证，是治疗痴呆的经典方剂。现代药理研究结果证明，开心散四味药材均能在不同程度上起到益智的作用，开心散对AD的治疗有多靶点、多方位的优势，但开心散治疗AD的药效物质基础及作用机制仍然不清楚。反映药物作用效果的生物标志物尚未阐明。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有老年痴呆症的尿液代谢标志物无法准确鉴定的缺点，而提出一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法。
一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法具体过程为：
步骤一、老年痴呆大鼠模型的建立及评价；
步骤二、利用生物标记物评价开心散对AD大鼠模型建立不同阶段的干预作用。
本发明的有益效果为：
本发明对开心散干预AD的机制及药效物质基础进行评价。以氯化铝联合D-半乳糖诱导老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)大鼠模型及开心散为研究对象，运用UPLC-MS技术和代谢组学方法分析AD发生发展的潜在代谢生物标记物以及基于生物标记物评价开心散对AD大鼠模型不同阶段干预作用。
液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分进行分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用利用了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点。它对化合物的结构破坏性很小，因而，适合生物分子和有机分子的分离。与其他分析方法相比，质谱具有更高的灵敏度。因为质谱和色谱灵敏度基本相同，质谱的进样系统可以用分离效果很好的色谱来实现，质谱作为色谱的鉴定仪也有分离好，速度快，应用广等优点。
液质联用技术具有高分离度，可快速分离能的LC与高灵敏度的MS或是MS结合，即可定性也可定量。超高效液相色谱技术的快速发展，其优势更加得以凸显，样品分析时间大大缩短，从小时缩短为数分钟。同时超高效液相使用比传统液相更小的粒径，可达到获得更好的分离效果。在质谱方面，本实验所选用的G2-Si质谱借助高效T-Wave离子淌度技术，可提供高水平的选择性、特异性和灵敏度。这些技术的发展，助推代谢组学技术平台向更高的灵敏度、高通量及高分辨率方向发展。液质联用技术可直接分析尿液样本、需要除去蛋白的血液样本、组织样本、或是直接检测脑脊液样本，可适用于中等及弱极性样本的分离。将液质联用技术应用于老年痴呆的研究中，利用其能发现差异标记物并追溯其相关标记物信息，描述代谢产物在疾病发生发展中的变化，从小分子代谢产物终端阐释疾病病理生理学机制，有助于AD生物标记物的发现。
附图说明
图1a为AD大鼠模型Morris水迷宫定位航行实验结果图；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；
图1b为AD模型大鼠Morris水迷宫空间搜索实验结果图；；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；
图2a为空白对照组(模型复制第91天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×40)图；
图2b为AD大鼠模型第1组(模型复制第16天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×40)图；
图2c为AD大鼠模型第2组(模型复制第46天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×40)图；
图2d为AD大鼠模型第3组(模型复制第61天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×40)图；
图2e为AD大鼠模型第4组(模型复制第91天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×40)图；
图3a为空白对照组(模型复制第91天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×100)图；
图3b为AD大鼠模型第1组(模型复制第16天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×100)图；
图3c为AD大鼠模型第2组(模型复制第46天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×100)图；
图3d为AD大鼠模型第3组(模型复制第61天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×100)图；
图3e为AD大鼠模型第4组(模型复制第91天)大鼠脑组织海马CA3区HE染色结果(×100)图；
图4a为空白对照组(模型复制第91天)大鼠脑组织海马CA3区Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图4b为AD大鼠模型第1组(模型复制第16天)大鼠脑组织海马CA3区Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图4c为AD大鼠模型第2组(模型复制第46天)大鼠脑组织海马CA3区Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图4d为AD大鼠模型第3组(模型复制第61天)大鼠脑组织海马CA3区Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图4e为AD大鼠模型第4组(模型复制第91天)大鼠脑组织海马CA3区Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图5a为空白对照组(模型复制第91天)大鼠脑组织皮层Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图5b为AD大鼠模型第1组(模型复制第16天)大鼠脑组织皮层Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图5c为AD大鼠模型第2组(模型复制第46天)大鼠脑组织皮层Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图5d为AD大鼠模型第3组(模型复制第61天)大鼠脑组织皮层Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图5e为AD大鼠模型第4组(模型复制第91天)大鼠脑组织皮层Aβ1-40免疫组化结果(×100)图；
图6为大鼠脑组织免疫组化测得Aβ1-40蛋白表达含量(与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01)结果图；
图7为AD模型复制过程中各组大鼠血清中T-SOD水平(*P<0.05，**P<0.01,与空白组比较)结果图；
图8为AD模型复制过程中各组大鼠脑组织中T-SOD水平(*P<0.05，**P<0.01,与空白组比较)结果图；
图9为AD模型复制过程中各组大鼠血清中GSH-PX活力(*P<0.05，**P<0.01，与空白组比较)结果图；
图10为AD模型复制过程中各组大鼠脑组织中GSH-PX活力(*P<0.05，**P<0.01，与空白组比较)结果图；
图11为AD模型复制过程中各组大鼠血清中MDA水平(*P<0.05，**P<0.01，与空白组比较)结果图；
图12为AD模型复制过程中各组大鼠脑组织中MDA水平(*P<0.05，**P<0.01，与空白组比较)结果图；
图13为AD模型复制过程中各组大鼠血清中IL-6水平(*P<0.05，**P<0.01，与空白组比较)
图14为AD大鼠模型复制过程中各组大鼠脑组织中IL-6水平(*P<0.05，**P<0.01，与空白组比较)结果图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法具体过程为：
步骤一、老年痴呆大鼠模型的建立及评价；
步骤一一、利用腹腔注射D-半乳糖联合灌胃三氯化铝诱导大鼠，建立AD大鼠模型；
步骤一二、利用行为学、组织病理学及临床生化指标评价AD大鼠模型的建立过程；
步骤二、利用生物标记物评价开心散对AD大鼠模型建立不同阶段的干预作用；
步骤二一、制备开心散冻干粉和开心散灌胃溶液，得到体内含有开心散的大鼠；
步骤二二、对空白组大鼠和D大鼠模型进行分组及设计；
取9周龄雄性Wistar大鼠100只(体重260±20g)，适应环境一周，先将动物进行Morris水迷宫初筛，通过初筛，去除先天痴呆(潜伏期平均值>50s)和游泳姿势不良者，将合格大鼠随机分为空白对照组10只，AD大鼠模型组1-4组各10只，开心散干预组(人体等效12倍量，5.4g/kg)1-4组各10只。
AD大鼠模型组和干预组于每天下午2：00按1.2.3项下复制AD大鼠模型，空白对照组每天给予等量生理盐水；空白对照组于实验第85d，AD模型1-4组、开心散干预组1-4组分别于实验第10d，40d，55d，85d，进行6天行为学评价(Morris水迷宫)。
AD大鼠模型的复制具体过程为：
大鼠灌胃给予氯化铝(aluminum chloride，AlCl3)(28mg/kg/day)，同时腹腔注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal)(63mg/kg/day)，共90天；
步骤二三、根据步骤二二对空白组大鼠和AD大鼠模型进行尿液样品采集及前处理，得到滤液；
步骤二四、对步骤二三得到的滤液经UPLC-MS分析处理，鉴定潜在的生物标记物；
步骤二五、对步骤二四鉴定的潜在生物标记物进行潜在生物标记物的筛选、鉴定及开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述步骤一一中利用腹腔注射D-半乳糖联合灌胃三氯化铝诱导大鼠，建立AD大鼠模型；具体过程为：
实验动物
Wistar大鼠，雄性，9周龄，体重260±20g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。室温饲养，动物自由摄食饮水。
1.1实验方法
1.1.1实验分组及设计；Wistar大鼠70只，适应环境一周，先将动物进行Morris水迷宫初筛，去除先天痴呆(潜伏期平均值>50s)和游泳姿势不良者，将合格大鼠随机分为空白对照组10只，AD模型1-4组(M 1-4)各10只。AD模型组于每天下午2：00按1.1.2项下复制AD大鼠模型，空白对照组每天给予等量生理盐水。
1.1.2AD大鼠模型的建立；大鼠灌胃给予氯化铝(aluminumchloride，AlCl3)(28mg/kg/day)，同时腹腔注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal)(63mg/kg/day)，共90天。
Morris水迷宫结果显示，从实验的第90天之后，AD大鼠模型逃避潜伏期时间延长及穿越平台次数减少，与空白对照大鼠相比具有显著性差异；HE染色及免疫组化结果显示，模型大鼠脑组织神经元细胞减少，坏死神经元增多并出现Aβ1-40阳性反应的棕黄色斑块；临床生化指标显示，模型大鼠血清中的T-SOD水平在第16天、第46天、第61天成极显著性上升趋势，第91天产生了极显著下降；在脑组织中T-SOD含量呈下降趋势。与空白组大鼠相比，模型组血清中的GSH-PX含量显著上升；脑组织中GSH-PX含量明显下降。模型组大鼠的血清及脑中的IL-6含量与空白对照组大鼠相比均显著上升。
综合上述评价指标，说明利用灌胃氯化铝联合腹腔注射D-半乳糖的方法诱导大鼠，使AD大鼠模型逐渐出现的学习认知能力下降，脑组织神经元受损，Aβ阳性斑块氧化应激损伤及炎症反应，与人类老年痴呆的病理特征相似。并明确诱导大鼠第15天大鼠进入轻度认知障碍前期(pre-MCI期)，诱导大鼠第45天大鼠进入轻度认知障碍期(MCI期)，造模第60天进入轻度认知障碍中期(MCI中期)，诱导大鼠第90天大鼠进入痴呆期(AD)，得到AD大鼠模型；
大鼠为Wistar大鼠，雄性，9周龄，体重260±20g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。室温饲养，动物自由摄食饮水。
所述步骤一二中利用行为学、组织病理学及临床生化指标评价AD大鼠模型的建立过程；具体过程为：
a)根据Morris水迷宫行为学对AD大鼠模型的建立过程进行评价：
所述Morris水迷宫实验用来评价大鼠(实验动物)的空间学习记忆能力，通过实验大鼠(动物)学习在水中寻找隐藏平台并分析其(大鼠)寻找平台所用时间来判断其(大鼠)记忆功能的好坏，其中定位航行实验中得到的逃避潜伏期(即大鼠从入水到找到平台的时间)值与学习记忆能力成反比；而空间搜索实验中，穿越平台的次数与学习记忆能力成正比；
1)定位航行实验；与空白组大鼠相比，AD大鼠模型各组大鼠在定位航行实验的逃避潜伏期时间均有延长，但模型第4组(M 4)大鼠的逃避潜伏期时间显著延长，5天训练中其中第1天、第4天和第5天AD模型有显著性差异(P<0.05)，第2天和第3天AD模型有极显著性差异(P<0.01)；而AD模型第1组(M 1)仅在训练第3天有显著性差异(P<0.05)，AD模型第2、3组(M 2、M 3)仅在训练第4天有显著性差异(P<0.05)，具体结果见图1a；
2)空间搜索实验；在最后一天(90天)撤去水中隐藏平台的空间搜索实验中，与空白对照组相比，各模型组大鼠穿越平台的次数均有所降低，但AD模型第4组大鼠穿越平台次数显著减少，差异具有统计学意义，结果有显著差异(P<0.05)，而模型第1、2、3组的结果并无显著差异(P>0.05)，具体结果见图1b；
提示腹腔注射D-gal联合灌胃AlCl3影响了模型大鼠的学习记忆能力，其毒性长期累积造成了模型大鼠认知功能障碍加剧，以第90天达到最大；
b)脑组织病理学结果
1)脑组织HE染色结果；结果显示：空白对照组(Control；图2a，图3a)大鼠脑组织海马区神经元细胞排列紧密，形态规则，层次清晰，数量较多；细胞体大而饱满，核仁清晰。AD模型1-4组大鼠随着造模的进程，脑组织海马区逐渐出现病变情况。与空白对照组相比，模型1组(M 1；图2b，图3b)即AD大鼠模型建立的第16天的AD大鼠模型大鼠脑组织神经元变化并不明显；AD大鼠模型建立的第46天(M 2；图2c，图3c)大鼠脑组织开始出现神经元细胞数量明显减少，细胞排列松散，胞间出现空隙；造模第61天(M3；图2d，图3d)可见海马CA3区出现神经元大量丢失；AD大鼠模型建立的第91天(M4；图2e，图3e)大鼠脑组织神经元细胞核呈现固缩状，胞浆深紫，核膜胞膜界限模糊。
2)脑组织Aβ1-40免疫组化结果；免疫组化结果显示：空白对照组(Control；图4a，图5a)大鼠脑组织皮层及海马区Aβ1-40反应呈阴性，AD模型1组即造模第16天大鼠脑组织中开始出现Aβ1-40阳性反应的棕黄色斑块，阳性反应物多聚集在神经元胞体，未见较大的阳性斑块积聚。由图4a、4b、4c、4d、4e，图5a、5b、5c、5d、5e可见各模型组大鼠脑组织Aβ1-40阳性表达的棕黄色逐渐增多，以第91天斑块变化差异最明显。对Aβ1-40蛋白的相对含量(阳性目标面密度)进行统计学分析发现，随着模型的复制进程，AD模型1-4组大鼠脑组织Aβ1-40蛋白相对含量逐渐增加，第16天(M 1)大鼠脑组织中已出现与正常组差异显著的Aβ1-40蛋白累积，至造模的第91天(M 4)达到最多；各AD模型组的统计学数据与空白组相比，差异具有显著性(图6)。
提示腹腔注射D-gal联合灌胃AlCl3造成了模型大鼠脑组织神经元的损伤，脑内Aβ沉积加剧，逐渐表现出AD的脑内病理样变。
c)临床化学指标评价结果
1)氧化损伤相关指标含量的测定；氧化应激损伤被认为是AD发展的一个重要因素，氧化应激来源于自由基的过度积累。自由基能导致神经元过氧化损伤，引起神经元内Aβ的聚集，过量的沉积加剧神经元的损伤，导致神经细胞退行性变而发生AD[i][ii]。机体在正常状态下有一个由酶组成的抗氧化防御系统，帮助清除氧自由基而防止氧化损伤[iii]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物岐化酶(SOD)就是氧自由基清除剂。所以对机体内GSH-PX以及SOD的含量进行测试可以间接反映机体清除自由基的能力。氧自由基会攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，在生物膜质中发生的氧自由基链式反应，会损害生物膜及其功能，以致形成细胞透明性病变、纤维化，大面积细胞损伤造成神经、组织、器官等损伤，引发脂质过氧化反应，并形成脂质过氧化物，而丙二醛(MDA)就是脂质过氧化反应的终产物。故对机体内MDA的含量进行测试可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度[iv]。
与空白组比较，模型组血清中第16天、第46天、第61天的T-SOD水平成极显著性上升趋势(P<0.01)，第91天产生了极显著下降(P<0.01)，见图7；而脑组织中T-SOD含量在整个造模过程中呈下降趋势，见图8。与空白组比较，模型组血清中第16天、第46天、第61天和第91天的GSH-PX呈高水平表达(P<0.01)，见图9；脑组织中GSH-PX含量则处于下降趋势，在第91天具有显著性差异(P<0.05)，见图10。推测其可能的原因，T-SOD与GSH-PX主要分布于肝脏和血液中，腹腔注射D-半乳糖在体内产生氧化应激时，血液中反馈性上调T-SOD及GSH-PX水平以减少氧化损伤。而脑中可能分布较少，所以并未有反馈性上调现象。与空白组比较，MDA在整个造模过程中则一直处于高水平表达，尤其在脑组织中各个阶段都有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，见图11，图12。以上结果提示氯化铝与D-半乳糖联合刺激造成体内氧自由基清除能力下降，表明了机体受到了造模导致的氧化应激损伤。
2)炎症相关指标含量的测定；炎性反应也是AD的病因之一[v]，AD患者脑中的病理特点之一为胶质细胞介导的炎性反应，胶质细胞经Aβ刺激后，会诱导促炎因子的合成和分泌，而白细胞介素6(IL-6)就是一种促炎因子[vi]。也就是说机体内IL-6水平的上升，表明着炎性反应的发生。
与空白组相比，模型组血清中IL-6含量具有明显上升趋势，差异具有显著性(P<0.05)，见图13；脑中IL-6水平在模型复制早期如第16天和第46天升高明显(P<0.01)，但随着时间延长有降低趋势，见图14。以上结果提示氯化铝与D-半乳糖联合刺激造成机体炎症反应发生，表明了机体受到了造模导致的炎症反应损伤。
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述步骤二一中制备开心散冻干粉和开心散灌胃溶液，得到体内含有开心散的大鼠；具体过程为：
步骤二一一、开心散冻干粉的制备；
按原方比例，即药材粗粉按质量份数比为：人参：茯苓：远志：石菖蒲＝3:3:2:2，称取500g药材粗粉，混匀，用6倍量的质量浓度为70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并滤液，浓缩，并用冷冻干燥法干燥，得疏松粉末，密封置于干燥器中备用并计算出粉率，出粉率为23.4％；以4粒准1g计算，每人每天给生药量21粒＝5g/天，大鼠等倍给药量为5g×0.018/0.2kg＝0.45g/kg；
步骤二一二、开心散灌胃溶液的制备；
取开心散冻干粉适量，溶于适量蒸馏水中，配制成生药浓度为0.54g/mL(开心散干预组)的开心散灌胃溶液，大鼠灌胃10mL/kg体重。
其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述步骤二三中根据步骤二二对空白组大鼠和AD大鼠模型进行尿液样品采集及前处理，得到滤液；具体过程为：
实验开始后，于AD大鼠模型复制第15天(M 1)、第45天(M 2)、第60天(M 3)、第90天(M 4)晚8:00将AD大鼠模型和空白组大鼠于置于大鼠代谢笼中，次日早8:00收集夜尿；
对收集得到的尿液样品于4℃，13000rpm离心15min后取上层清液，蒸馏水稀释一倍，混悬振荡30s后，0.22μm微孔滤膜过滤，得到滤液。
其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述步骤二四中对步骤二三得到的滤液经UPLC-MS分析处理，鉴定潜在的生物标记物；具体过程为：
滤液经UPLC-MS分析得到代谢指纹图谱，代谢指纹图谱数据采用WatersQI软件进行预处理，如色谱峰提取、峰对齐及归一化等。进行多变量分析前对每个检测峰的离子强度进行标准化处理，然后将峰面积、样品名称和离子强度组成的数据导入EZinfo2.0进行多维模式识别分析，包括PCA和OPLS-DA等，鉴定潜在的生物标记物；
AD大鼠模型建立过程第15天尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物；第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物；第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物；第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物；其中，第15天及45天重叠标记物10个，15天与60天重叠标记物3个，15天与90天重叠标记物8个，45天与60天共重叠标记物13个，45天与90天重叠标记物16个，60天与90天重叠标记物11个，顺-4-癸烯酸为从AD大鼠模型建立的起始阶段就出现直至痴呆期的标记物。如表1、表2、表3、表4；
所述UPLC-MS为超高效液相色谱-质谱联用；
表1 AD模型大鼠复制第15天尿液中潜在生物标记物的具体信息表
注：“↑↓”在模型中代谢水平上升或下降
表2 AD模型大鼠第45天尿液中潜在生物标记物的具体信息表
注：“↑↓”在模型中代谢水平上升或下降。
表3 AD模型大鼠第60天尿液中潜在生物标记物的具体信息表
注：“↑↓”在模型中代谢水平上升或下降。
表4 AD模型大鼠第90天尿液中潜在生物标记物的具体信息表
注：“↑↓”在模型中代谢水平上升或下降。
色谱分析条件为：
色谱仪：AcquityTM UPLC液相色谱仪(四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱)；色谱柱：ACQUITYUPLCTM HSS T3column(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)(Waters集团公司，美国)；流动相：流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水；柱温预设：45℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.4mL/min；进样体积：2μL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；梯度洗脱程序见表5。
表5超高效液相梯度洗脱条件
流动相A:0.1％甲酸乙腈；流动相B:0.1％甲酸水
质谱分析条件
正离子扫描模式：电喷雾离子源(ESI)：采用SynaptTM G2-Si质谱分析系统(高分辨四级杆串联飞行时间质谱仪)；脱溶剂气流量：800L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3.0kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肽(leueine-enkephalin，[M+H]+＝556.2771)，溶液浓度为1ng/μL，流速为5μL/min；质量扫描范围：m/z 50-1000Da，扫描时间0.2s；以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。
负离子扫描模式：脱溶剂气流量：800L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3.0kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肽(leueine-enkephalin，[M-H]-＝554.2771)，溶液浓度为1ng/μL，流速为5μL/min；其余参数条件同正离子扫描模式。
其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述步骤二五中对步骤二四鉴定的潜在生物标记物进行潜在生物标记物的筛选、鉴定及开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；
步骤二五一、筛选出潜在生物标记物；
为了找到对代谢轮廓变化起关键性作用的内源性代谢物，进一步对各不同时期AD模型组大鼠与空白组大鼠尿液代谢轮廓数据进行OPLS-DA分析，并获得能够直观反映对代谢轮廓轨迹变化贡献率的S-Plot以及VIP-Plot；PCA分析一般用来初步分析各组样品间的总体分布状况及是否有离群样本存在，而配对偏最小二乘判别分析(Orthonal PartialLeast Square-Discriminate Analysis,OPLS-DA)则进一步放大了组间差异，使得相关信息更为集中地表现在第一主成分上。在VIP散点图中，离子碎片呈V型排列，顶端离子(VIP值大)，对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献率大。在S-Plot图中，距离原点越远的离子对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献度越大，越有可能是潜在的特征代谢物。同时对各组所获得信息数据进行统计学分析，比较AD模型组和空白组各离子含量差别是否具有统计学意义，基于P<0.05作为筛查条件，并利用其在引起组内聚类和组间分离的贡献度VIP值来作为其在疾病发展过程中的重要程度的评价因子，筛选出这些差异离子(P<0.05)作为潜在生物标记物集合；
AD造模过程第15天尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物；第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物；第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物；第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物。其中，第15天及45天重叠标记物10个，15天与60天重叠标记物3个，15天与90天重叠标记物8个，45天与60天共重叠标记物13个，45天与90天重叠标记物16个，60天与90天重叠标记物11个，顺-4-癸烯酸(cis-4-Decenoic acid)为从AD的起始阶段就出现直至痴呆期的标记物。
步骤二五二、对潜在生物标记物进行鉴定；
对潜在的生物标记物，利用Progenesis QI软件峰提取(Peak picking)过程中得到的保留时间(RT)和质核比(m/z)数据，结合软件中化合物鉴定功能(Indentifycompounds)与代谢产物数据库(HMDB：http://www.hmdb.ca/)搜索，对这些差异离子(P<0.05)进行初步确认；再通过UPLC-MS/MS技术对潜在的离子在一定碰撞能下进行二级数据扫描，获得二级质谱信息，最终通过碎片信息及其可能的裂解方式进行匹配，或结合文献报道，鉴定或表征各潜在生物标记物；
步骤二五三、根据步骤二五一和步骤二五二确定开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响。
其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：所述步骤二五三中根据步骤二五一和步骤二五二确定开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；具体过程为：
根据以上步骤，AD大鼠模型建立过程第15天(轻度认知障碍前期)尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量显著上升的20个，含量显著下降的15个；
AD大鼠模型建立过程第45天(轻度认知障碍期)尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量显著上升的21个，含量显著下降的27个；
AD大鼠模型建立过程第60天(轻度认知障碍中期)尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量显著上升的22个，含量显著下降的18个；
AD大鼠模型建立过程第90天(痴呆期)尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量显著上升的18个，含量显著下降的24个；
开心散对AD大鼠模型建立的第15天大鼠尿液生物标记物的影响的过程为：
在D-gal联合AlCl3诱导的AD大鼠模型建立过程第15天尿液的35个潜在的生物标记物中，开心散对其中31个具有调节作用，7个具有统计学意义，包括3-甲基二氧吲哚(3-Methyldioxyindole)，苏氨脯氨酸(Threoninyl-Proline)，N-乙酰基-4-O-乙酰神经氨酸(N-Acetyl-4-O-acetylneuraminic acid)，咪唑丙酸(Imidazolepropionic acid)，3-羟癸二酸(3-Hydroxysebacic acid)，色氨酸(L-Tryptophan)，甲硫蛋氨酸(Methionyl-Methionine)；见表6。
表6开心散干预AD模型复制第15天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表
注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
开心散对AD大鼠模型建立的第45天大鼠尿液生物标记物的影响的过程为：
模型复制过程第45天(轻度认知障碍期)尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物，开心散对其中34个具有调节作用，21个具有统计学意义，包括甲酰邻氨基苯甲酸(Formylanthranilic acid)，十二碳二元酸(Dodecanedioic acid)，2-甲基马尿酸(2-Methylhippuric acid)，异高香草酸(Isohomovanillic acid)，5-甲氧色醇(5-Methoxytryptophol)，褪黑素(Melatonin)，香草丙酮酸(Vanilpyruvic acid)，4-羟基-5-(苯基)-戊酸-O-葡萄糖苷酸(4-Hydroxy-5-(phenyl)-valeric acid-O-glucuronide)，邻苯三酚-2-O-葡萄糖苷酸(Pyrogallol-2-O-glucuronide)，高柠檬酸(Homocitric acid)，二甲基精氨酸(Dimethyl-L-arginine)，3,4-二羟基苯基乙醛(3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde)，酪氨酸(L-Tyrosine)，肉碱(L-Carnitine)，酪氨酸胺(Tyrosinamide)，5-羟色醇(5-Hydroxytryptophol)，4-(2-氨基苯基)-2，4-二氧丁酸(4-(2-Aminophenyl)-2,4-dioxobutanoic acid)，犬尿胺(Kynuramine)，犬尿酸(Kynurenicacid)，2-羟癸酸(2-Hydroxydecanedioic acid)，色氨酸(L-Tryptophan)；见表7。
表7开心散干预AD模型复制第45天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表
Table 7Trend ofAD urine potential biomarkers called back after KXSadministration on 45th day
注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
开心散对AD大鼠模型建立第60天大鼠尿液生物标记物的影响；
模型复制过程第60天(轻度认知障碍中期)尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物，开心散对其中29个具有调节作用，9个具有统计学意义，包括3,4-二羟苯基乙醛(3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde)，4,6-二羟基喹啉(4,6-Dihydroxyquinoline)，羟脯氨酰基-异亮氨酸(Hydroxyprolyl-Isoleucine)，2-辛烯酸(2-Octenoic acid)，(9s,10s)-10-羟-9-(膦羧氧基)十八碳酯((9S,10S)-10-hydroxy-9-(phosphonooxy)octadecanoate)，二甲基精氨酸(Dimethyl-L-arginine)，4-羧苯基甘氨酸(4-Carboxyphenylglycine)，丙二酰肉碱(Malonylcarnitine)，3-甲氧基酪氨酸(3-Methoxytyrosine)。见表8。
表8开心散干预AD模型复制第60天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表
注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
开心散对AD大鼠模型建立第90天大鼠尿液生物标记物的影响；
AD模型复制过程第90天(痴呆期)尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物，开心散对其中22个具有调节作用，7个具有统计学意义，包括羟脯氨酰基组氨酸(Hydroxyprolyl-Histidine)，2-异丙基苹果酸(2-Isopropylmalic acid)，4,6-二羟喹啉(4,6-Dihydroxyquinoline)，十二烷二酸(Dodecanedioic acid)，3-甲基二氧吲哚(3-Methyldioxyindole)，2-辛烯酸(2-Octenoic acid)，肾上腺乙醇酰胺(Adrenoylethanolamide)。见表9。
表9开心散干预AD模型复制第90天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表
注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
分析开心散对各阶段标记物的调节情况，其中第15天及45天重叠标记物6个，15天与60天重叠标记物3个，15天与90天重叠标记物5个，45天与60天共重叠标记物10个，45天与90天重叠标记物5个，60天与90天重叠标记物6个。
其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

Claims (1)

1.一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法，其特征在于：一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法具体过程为：
步骤一、老年痴呆大鼠模型的建立及评价；
步骤一一、利用腹腔注射D-半乳糖联合灌胃三氯化铝诱导大鼠，建立AD大鼠模型；
步骤一二、利用行为学、组织病理学及临床生化指标评价AD大鼠模型的建立过程；
步骤二、利用生物标记物评价开心散对AD大鼠模型建立不同阶段的干预作用；
步骤二一、制备开心散冻干粉和开心散灌胃溶液，得到体内含有开心散的大鼠；
步骤二二、对空白组大鼠和D大鼠模型进行分组及设计；
步骤二三、根据步骤二二对空白组大鼠和AD大鼠模型进行尿液样品采集及前处理，
得到滤液；
步骤二四、对步骤二三得到的滤液经UPLC-MS分析处理，鉴定潜在的生物标记物；
步骤二五、对步骤二四鉴定的潜在生物标记物进行潜在生物标记物的筛选、鉴定及开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；
所述步骤一一中利用腹腔注射D-半乳糖联合灌胃三氯化铝诱导大鼠，建立AD大鼠模型；具体过程为：
利用灌胃氯化铝联合腹腔注射D-半乳糖的方法诱导大鼠，诱导大鼠第15天大鼠进入轻度认知障碍前期，诱导大鼠第45天大鼠进入轻度认知障碍期，造模第60天进入轻度认知障碍中期，诱导大鼠第90天大鼠进入痴呆期，得到AD大鼠模型；
所述步骤二一中制备开心散冻干粉和开心散灌胃溶液，得到体内含有开心散的大鼠；具体过程为：
步骤二一一、开心散冻干粉的制备；
药材粗粉按质量份数比为：人参：茯苓：远志：石菖蒲＝3:3:2:2，称取500g药材粗粉，混匀，用6倍量的质量浓度为70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并滤液，浓缩，并用冷冻干燥法干燥，得疏松粉末，密封置于干燥器中备用并计算出粉率，出粉率为23.4％；以4粒准1g计算，每人每天给生药量21粒＝5g/天，大鼠等倍给药量为5g×0.018/0.2kg＝0.45g/kg；
步骤二一二、开心散灌胃溶液的制备；
取开心散冻干粉，溶于蒸馏水中，配制成生药浓度为0.54g/mL的开心散灌胃溶液，大鼠灌胃10mL/kg体重；
所述步骤二三中根据步骤二二对空白组大鼠和AD大鼠模型进行尿液样品采集及前处理，得到滤液；具体过程为：
AD大鼠模型建立第15天、第45天、第60天、第90天晚8:00将AD大鼠模型和空白组大鼠于置于大鼠代谢笼中，次日早8:00收集夜尿；
对收集得到的尿液样品于4℃，13 000rpm离心15min后取上层清液，蒸馏水稀释一倍，混悬振荡30s后，0.22μm微孔滤膜过滤，得到滤液；
所述步骤二四中对步骤二三得到的滤液经UPLC-MS分析处理，鉴定潜在的生物标记物；具体过程为：
滤液经UPLC-MS分析得到代谢指纹图谱，代谢指纹图谱数据采用WatersQI软件进行预处理，对预处理后的每个检测峰的离子强度进行标准化处理，然后将峰面积、样品名称和离子强度组成的数据导入EZinfo2.0进行多维模式识别分析，鉴定潜在的生物标记物；
AD大鼠模型建立过程第15天尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物；第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物；第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物；第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物；其中，第15天及45天重叠标记物10个，15天与60天重叠标记物3个，15天与90天重叠标记物8个，45天与60天共重叠标记物13个，45天与90天重叠标记物16个，60天与90天重叠标记物11个，顺-4-癸烯酸为从AD大鼠模型建立的起始阶段就出现直至痴呆期的标记物；
色谱分析条件为：
色谱仪：AcquityTM UPLC液相色谱仪；色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3 column；流动相：流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水；柱温预设：45℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.4mL/min；进样体积：2μL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；
梯度洗脱程序为：
初始时刻，流速为0.4mL/min，1％流动相A，99％流动相B，无洗脱曲线；
洗脱时间为2.5min时，流速为0.4mL/min，11％流动相A，89％流动相B，洗脱曲线为6；
洗脱时间为4.5min时，流速为0.4mL/min，21％流动相A，79％流动相B，洗脱曲线为7；
洗脱时间为7min时，流速为0.4mL/min，40％流动相A，60％流动相B，洗脱曲线为6；
洗脱时间为8.5min时，流速为0.4mL/min，99％流动相A，1％流动相B，洗脱曲线为6；
洗脱时间为10.5min时，流速为0.4mL/min，99％流动相A，1％流动相B，洗脱曲线为6；
洗脱时间为10.6min时，流速为0.4mL/min，1％流动相A，99％流动相B，洗脱曲线为6；
洗脱时间为13min时，流速为0.4mL/min，1％流动相A，99％流动相B，洗脱曲线为6；
质谱分析条件
正离子扫描模式：电喷雾离子源：采用SynaptTM G2-Si质谱分析系统；脱溶剂气流量：800L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3.0kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肽，溶液浓度为1ng/μL，流速为5μL/min；质量扫描范围：m/z50-1000Da，扫描时间0.2s；以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站；
负离子扫描模式：脱溶剂气流量：800L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3.0kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肽，溶液浓度为1ng/μL，流速为5μL/min；其余参数条件同正离子扫描模式；
所述步骤二五中对步骤二四鉴定的潜在生物标记物进行潜在生物标记物的筛选、鉴定及开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；
步骤二五一、筛选出潜在生物标记物；
对各不同时期AD大鼠模型组大鼠与空白组大鼠尿液代谢轮廓数据进行OPLS-DA分析，对各组所获得信息数据进行统计学分析，比较AD模型组和空白组各离子含量差别是否具有统计学意义，基于P<0.05作为筛查条件，筛选出差异离子作为潜在生物标记物集合；
步骤二五二、对潜在生物标记物进行鉴定；
步骤二五三、根据步骤二五一和步骤二五二确定开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；
所述步骤二五三中根据步骤二五一和步骤二五二确定开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；具体过程为：
AD大鼠模型建立过程第15天尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的有20个，含量下降的有15个；
AD大鼠模型建立过程第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的21个，含量下降的有27个；
AD大鼠模型建立过程第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的有22个，含量显著下降的有18个；
AD大鼠模型建立过程第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的有18个，含量下降的有24个；
开心散对AD大鼠模型建立的第15天大鼠尿液生物标记物的影响的过程为：
在D-gal联合AlCl3诱导的AD大鼠模型建立过程第15天尿液的35个潜在的生物标记物中，开心散对其中31个具有调节作用，7个具有统计学意义，包括3-甲基二氧吲哚，苏氨脯氨酸，N-乙酰基-4-O-乙酰神经氨酸，咪唑丙酸，3-羟癸二酸，色氨酸，甲硫蛋氨酸；
开心散对AD大鼠模型建立的第45天大鼠尿液生物标记物的影响的过程为：
AD大鼠模型建立第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物，开心散对其中34个具有调节作用，21个具有统计学意义，包括甲酰邻氨基苯甲酸，十二碳二元酸，2-甲基马尿酸，异高香草酸，5-甲氧色醇，褪黑素，香草丙酮酸，4-羟基-5-苯基-戊酸-O-葡萄糖苷酸，邻苯三酚-2-O-葡萄糖苷酸，高柠檬酸，二甲基精氨酸，3,4-二羟基苯基乙醛，酪氨酸，肉碱，酪氨酸胺，5-羟色醇，4-(2-氨基苯基)-2，4-二氧丁酸，犬尿胺，犬尿酸，2-羟癸酸，色氨酸；
开心散对AD大鼠模型建立第60天大鼠尿液生物标记物的影响；
AD大鼠模型建立第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物，开心散对其中29个具有调节作用，9个具有统计学意义，包括3,4-二羟苯基乙醛，4,6-二羟基喹啉，羟脯氨酰基-异亮氨酸，2-辛烯酸-10-羟-9-十八碳酯，二甲基精氨酸，4-羧苯基甘氨酸，丙二酰肉碱，3-甲氧基酪氨酸；
开心散对AD大鼠模型建立第90天大鼠尿液生物标记物的影响；
AD大鼠模型建立第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物，开心散对其中22个具有调节作用，7个具有统计学意义，包括羟脯氨酰基组氨酸，2-异丙基苹果酸，4,6-二羟喹啉，十二烷二酸，3-甲基二氧吲哚，2-辛烯酸，肾上腺乙醇酰胺；
分析开心散对各阶段标记物的调节情况，其中第15天及45天重叠标记物6个，15天与60天重叠标记物3个，15天与90天重叠标记物5个，45天与60天共重叠标记物10个，45天与90天重叠标记物5个，60天与90天重叠标记物6个。
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