CN110279726A - 含有虎耳草科肾萼金腰提取物的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物，所述组合物包括：虎耳草肾萼金腰提取物、鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡以及2‑[(4‑叔丁基噻唑‑2‑基)亚氨基]噻唑啉‑4‑酮，其中所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的粒径介于50～300nm之间。所述组合物各组分间相互配伍可对5α‑还原酶具有不同程度的活性抑制作用，可以用作5α‑还原酶抑制剂，还可以应用于预防和/或治疗由5α‑还原酶所导致的机体不适如毛发脱落、毛发易脆易断、斑秃、痤疮、发色变淡、以及它们的组合，或者高水平的二氢睾酮容易引起的雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌。

Description

含有虎耳草科肾萼金腰提取物的组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有虎耳草科肾萼金腰提取物的组合物及其应用。
背景技术
肾萼金腰(Chrysosplenium delavayi)属于虎耳草科金腰属多年生草本，高4.5～13cm；不育枝出自茎下部叶腋，其叶对生，近扁圆形，先端钝圆，两面无毛。花茎无毛。茎生叶对生，叶片阔卵形、近圆形至扇形，长0.22～1.5cm，宽0.3～1.6cm，先端钝，边缘具7～12圆齿，基部宽楔形；叶柄长3～7mm。单花；或聚伞花序具2～5花；花序分枝无毛；苞叶通常阔卵形，长2～5mm，2.4～5mm，先端钝，边缘具6～9圆齿；花梗长2.5～19mm，无毛；花黄绿色，直径约8.7mm；萼片在花期开展，近扁圆形，长1.9～3mm，宽3～5mm，先端微凹；雄蕊8，长约0.6mm；子房近下位，花柱长约0.4mm；花盘8裂。蒴果先端近平截而微凹，2果瓣近等大且水平状叉开，喙长约0.4mm；种子黑褐色，卵球形，具纵肋13～15条，肋上有横纹。花果期3～6月，伴生植物有多脉榆、五裂槭、绢毛稠李、荞麦叶大百合、尾花细辛、竹叶吉祥草、红马蹄草、大叶金腰等。
目前，对于虎耳草科特别是肾萼金腰提取物的药理学研究较少，尚未发现其活性成分。本发明人经过广泛深入的研究，通过对肾萼金腰的提取物进行研究，制备得出包含所述肾萼金腰提取物的组合物的一些药理学应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有虎耳草科肾萼金腰提取物的组合物及其应用，所述组合物各组分间相互配伍可对5α-还原酶具有不同程度的活性抑制作用，可以用作5α-还原酶抑制剂，还可以应用于预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
[1]含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物，所述组合物包括：
-虎耳草肾萼金腰提取物；
-鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡；以及
-2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
本发明所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物对5α-还原酶具有不同程度的活性抑制作用，特别地，所述组合物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用几乎能媲美传统5α-还原酶抑制剂非那雄胺，因此所述组合物可为和/或可构成潜在的5α-还原酶抑制剂，这可能导致发展新的天然药物治疗雄激素相关疾病以及由不同的5α-还原酶所导致的诸如毛发脱落、毛发稀疏、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变淡以及高水平的二氢睾酮容易引起雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等。
为更详尽地展现本发明，在本申请的发明内容及优选实施方案中，还提供了所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物中的虎耳草肾萼金腰提取物的制备方法，所述方法包括下述步骤的至少一种：
a)肾萼金腰干燥全草粉碎后依次以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取，滤液均以针孔滤膜滤过，合并滤液并浓缩至无醇味、无酯味；
b)浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、氯仿萃取得五种组分并浓缩；
c)步骤b)的浓缩液完全溶解于甲醇，进YMC C18柱，以乙腈-1.1％乙酸水溶液作为流动相，收集10～45min的组分混合并浓缩；
d)以中压色谱塔对步骤c)的混合组分进行色谱分离，收集第五馏分浓缩至恒重即得。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述针孔滤膜的型号是0.42um。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取时的料液比是1:5～15，g/mL；所述回流提取温度是45～85℃；回流提取时间是1～5h。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中中压色谱塔色谱分离的工作参数是指装填MCI微孔树脂固定相；中压色谱塔内径为36.0～100.0mm；制备流动相A是水，B是乙醇；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254nm；流速为20～45.0mL/min。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的浓缩可为真空浓缩，所述真空浓缩的条件是指真空度为0.04～0.06MPa，温度为45～70℃。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的洗脱方式是：0～90min，体积浓度0％→100％B；90～120min，体积浓度100％→100％B。
以本发明方法中的提取方法制备得到虎耳草提取物，采用多级回流、多级萃取、多级色谱分离以及中亚色谱塔从虎耳草中定向分离提取物，均为可视化操作，不但快速、简单，而且易于规模化扩大；本提取方法的终产物虎耳草提取物中总黄酮的含量可达99wt％以上，其纯度较高，无需进一步纯化即可应用，大大提升了其进一步应用的运用领域和药理学功能。
为更详尽地展现本发明，在本申请的发明内容及优选实施方案中，还提供了所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物中的所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法，所述方法包括下述步骤的至少一种：
a)鼠伤寒沙门氏菌菌种复苏并扩大培养；
b)培养物经高速冷冻离心后取上清液，依次以0.45μm滤膜过滤、100Ku超滤膜超滤并浓缩，浓缩液超速冷冻离心取沉淀层；
c)步骤b)的沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液，依次加入40wt％碘克沙醇、25wt％碘克沙醇和150mMNaCl/20mMHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液，超速离心后获取顶部的胞外囊泡部分；
d)步骤c)之胞外囊泡部分以0.1mol/L的PBS溶液重悬沉淀物，超速离心后取沉淀即得；
所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的粒径介于50～300nm之间，当所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡粒浓度不低于1×1010Particles/mL时的蛋白质浓度为不低于8.0μg/mL。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤a)中扩大培养为将复苏后的鼠伤寒沙门氏菌菌种在新鲜LB液体培养基中于200r/min37℃的水平摇床上扩大培养。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤b)中的高速冷冻离心为在1～4℃、不低于5000g、优选5000～15000、更优选8000～10000g条件下高速冷冻离心15～30min。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤b)中的超速冷冻离心为在1～2℃、不低于50000g、优选50000～150000、更优选100000～140000g条件下超速冷冻柜离心2～8h。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述骤c)中的碘克沙醇梯度溶液和HEPES溶液的添加量可分别为所述由沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液的0.5～2倍体积，优选为1～1.5倍体积。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤c)中通过将混合溶液超速离心然后分离在碘克沙醇中浮力密度为1.00～1.20g/mL的部分来获得步骤c)中的胞外囊泡部分。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的超速离心为在1～2℃、不低于50000g、优选50000～150000、更优选100000～140000g条件下超速冷离心30min～5h。
本发明所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法简单，胞外囊泡的提取率高，所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡不仅对生物机体的免疫器官具有促发育作用，可显著提高机体血清的溶菌酶活力、血清蛋白含量以及超氧化物歧化酶活性，提高机体的抗感染能力以及免疫能力；此外，所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡还可通过与2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮联用配伍虎耳草肾萼金腰提取物发挥出优异的抑制5α-还原酶的作用，从而使得本发明所述组合物可用于5α-还原酶抑制以及预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适诸如毛发脱落、痤疮、女性多毛、毛色淡化以及高水平的二氢睾酮容易引起的雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述组合物中的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的结构式如式(1)所示：
同样为了更详尽地展现本发明，在本申请的发明内容及优选实施方案中，还提供了所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物中的所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的制备方法，所述制备方法可为公知常识技术中的任意方法，因此本申请仅列举但不限于下述方法：
a)25mmol4-叔丁基噻唑-2-胺溶解于30mL二氯甲烷中，加入25mmol无水碳酸钾，常温搅拌30min，滴加25mmol氯乙酰氯，常温反应1.5h；
b)反应液倒入冰水，二氯甲烷萃取，饱和碳酸钠水溶液洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶，乙醇重结晶得5.50g白色固体1；
c)9mmol化合物1和13.5mmol硫氰酸钾完全溶解于30mL乙醇，加热回流反应2.5h；冷却，析出固体，抽滤，干燥得2.10g黄色固体2即为2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的氢谱和碳谱分别为：
1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:1.33(s,9H,3×CH3),3.88(s,2H,CH2),6.64(s,1H,噻唑环),12.24(s,1H,NH)；
13CNMR(CDCl3,101MHz)δ:29.71,34.77,107.58,139.38,160.38,162.78,172.66.EI-MS m/z:255.3M+。
上述制备过程反应是如下：
在本申请的发明内容及优选实施方案中，本发明提供一种含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物，所述组合物由下述占所述组合物重量百分比的成分组成：
-0.01～99.99wt％的虎耳草肾萼金腰提取物；
-0.005～89.99wt％的鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡；以及
-0.005～10wt％的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物优选的由下述占所述组合物重量百分比的成分组成：
-10.00～99.99wt％的虎耳草肾萼金腰提取物；
-0.005～89.00wt％的鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡；以及
-0.005～1.00wt％的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物更优选的由下述占所述组合物重量百分比的成分组成：
-50.00～99.00wt％的虎耳草肾萼金腰提取物；
-0.005～49.00wt％的鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡；以及
-0.005～1.00wt％的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
本发明涉及一种以虎耳草肾萼金腰提取物作为主要成分、同时还包括鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡以及-2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的组合物，所述组合物各组分相互间配伍作用，可对5α-还原酶具有不同程度的活性抑制作用，特别地，所述组合物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用几乎能媲美传统5α-还原酶抑制剂非那雄胺，所述组合物可为和/或可构成潜在的5α-还原酶抑制剂，这可能导致发展新的天然药物治疗雄激素相关疾病以及由不同的5α-还原酶(Ⅰ型5α-还原酶或Ⅱ型5α-还原酶)所导致的诸如毛发脱落、毛发稀疏、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变淡以及高水平的二氢睾酮容易引起雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等。
[2]项[1]所述组合物的应用，所述应用包括但不限于：
-所述组合物在预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适中的应用，所述应用包括将所述组合物施用于所述机体；和/或
-所述组合物用于制备5α-还原酶抑制剂的应用；和/或
-所述组合物用于制备预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适的组合物的应用，所述应用包括将包含药物有效量项[1]所述组合物的组合物施用于所述机体；和/或
-所述组合物用于制备预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适的药物制剂的应用，所述应用包括将包含药物有效量项[1]所述组合物的药物制剂施用于所述机体；
所述5α-还原酶包括Ⅰ型5α-还原酶、Ⅱ型5α-还原酶以及两者的结合。
项[1]所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物对5α-还原酶(Ⅰ型5α-还原酶和Ⅱ型5α-还原酶)均具有不同程度的活性抑制作用，特别地，所述组合物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用几乎能媲美传统5α-还原酶抑制剂非那雄胺，因此所述组合物可作为5α-还原酶抑制剂应用或者作为5α-还原酶抑制剂的有效成分应用，并且所述组合物可用于预防和/或治疗由Ⅰ型5α-还原酶或Ⅱ型5α-还原酶所导致的诸如毛发脱落、毛发稀疏、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变淡以及高水平的二氢睾酮容易引起的雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等。
[3]一种5α-还原酶抑制剂，所述抑制剂中含有药物有效量的项[1]所述组合物，所述5α-还原酶抑制剂可选包括Ⅰ型5α-还原酶抑制剂、Ⅱ型5α-还原酶抑制剂或者两者的结合。
[4]一种药物组合物，所述药物组合物中含有药物有效量的项[1]所述组合物。
所述药物组合物组合物还可进一步包含或不包括一种或多种可药用赋形剂。
所述可药用赋形剂可选自粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、成粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、悬浮剂、调味剂中的一种或多种。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述药物组合物可经口服给药、胃肠外给药、吸入喷雾给药、直肠给药、鼻内给药、舌下给药、颊内给药、透皮给药或植入给药。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述药物组合物可制成适于通过所需的给药途径对患者给药的剂型，例如注射剂、胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、含片、糖浆、悬浮剂、溶液剂、乳剂、栓剂。
[5]项[4]所述药物组合物的应用，所述应用包括将所述药物组合物具有下述不适症状的个体以预防和/或治疗所述不适：由5α-还原酶异常引起的毛发脱落、毛发稀疏、毛发干燥、毛发易脆易断、毛发油腻、毛发自觉瘙痒、瘢痕性脱发、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变灰、发色变淡、发色变杂、以及它们的组合，或者高水平的二氢睾酮容易引起的雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌，还包括由5α-还原酶引起的其他机体不适，所述5α-还原酶包括Ⅰ型5α-还原酶和Ⅱ型5α-还原酶。
本发明中所述机体不适或者与5α-还原酶活性有关的机体不适可以选自或引起自毛发脱落、毛发稀疏、毛发干燥、毛发易脆易断、毛发油腻、毛发自觉瘙痒、瘢痕性脱发、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变灰、发色变淡、发色变杂，以及它们的组合，所述机体不适或者与5α-还原酶活性有关的机体不适可以选自或引起自由高水平的二氢睾酮引起的雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌。
本发明中，可以使用体外测定法检测5α-还原酶活性，并测定所述组合物对5α-还原酶活性的抑制作用及其相互间依赖性。
本发明中，可以使用体外测定法检测小鼠毛发的生长状况，并测定所述组合物对小鼠毛发的生发促发作用。
本发明的有益效果为：
1)本发明所述以耳草肾萼金腰提取物作为主要成分、同时还包括鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡以及-2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的组合物，所述组合物各组分相互间配伍作用，可对5α-还原酶具有不同程度的活性抑制作用，特别地，所述组合物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用几乎能媲美传统5α-还原酶抑制剂非那雄胺，所述组合物可为和/或可构成潜在的5α-还原酶抑制剂；
2)本发明所述组合物可发展新的天然药物治疗雄激素相关疾病以及由不同的5α-还原酶(Ⅰ型5α-还原酶或Ⅱ型5α-还原酶)所导致的诸如毛发脱落、毛发稀疏、斑秃、发色变淡以及高水平的二氢睾酮容易引起雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等；
3)以本发明方法中的提取方法制备得到虎耳草提取物，采用多级回流、多级萃取、多级色谱分离以及中亚色谱塔从虎耳草中定向分离提取物，均为可视化操作，不但快速、简单，而且易于规模化扩大；本提取方法的终产物虎耳草提取物中总黄酮的含量可达99％以上，其纯度较高，无需进一步纯化即可应用，大大提升了其进一步应用的运用领域和药理学功能；
4)本发明所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法简单，胞外囊泡的提取率高，所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡不仅对生物机体的免疫器官具有促发育作用，可显著提高机体血清的溶菌酶活力、血清蛋白含量以及超氧化物歧化酶活性，提高机体的抗感染能力以及免疫能力；
5)所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡还可通过与2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮联用配伍虎耳草肾萼金腰提取物发挥出优异的抑制5α-还原酶的作用，从而使得本发明所述组合物可用于5α-还原酶抑制以及预防和/治疗或由5α-还原酶所导致的机体不适。
本发明采用了上述技术方案提供范文，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为本发明中所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的结构示意图；
图2为本发明中的睾酮标准溶液的液相色谱图；
图3为本发明所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用示意图；
图4为本发明所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物对Ⅱ型5α-还原酶的抑制作用示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本发明使用本文中所描述的方法和材料；但本领域中已知的其他合适的方法和材料也可以被使用。本文中所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，并不是用来作为限制。所有出版物、专利申请案、专利案、临时申请案、数据库条目及本文中提及的其它参考文献等，其整体被并入本文中作为参考。若有冲突，以本说明书包括定义为准。
由下面的详述、附图及权利要求，本发明的其它特征和优点将变得很明显。
在本说明书中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的成分和/或方法步骤。当术语“基本上由……组成”在本文中与组合物、用途或方法结合使用时，表示可以存在另外的成分、方法步骤或成分和方法步骤都存在，但是这些添加物不会实质上影响所述组合物、方法或用途作用的模式。当术语“由……组成”在本文中与组合物、用途或方法结合使用时，排除了另外的成分和/或方法步骤的存在。
对于语词“例如”(“for example”)和“如”(“such as”)及其语法等同物，短语“而不限于”(“and without limitation”)应被理解为遵循一般用法，除非另有明确说明。如本文所用，语词“约”(“about”)是指考虑到由于实验误差的变化。除非另有明确说明，本文所述的所有测量，无论是否有明确地使用，都要被理解为被语词“约”一词所修正。如本文所用，单数形式“一”，“一个”，和“该”(“a，”“an，”and“the”)都包括复数用法，除非上下文另有明确规定。
当“一个(种)”在本文中与术语“包含”或“包括”结合使用时可以表示“一个(种)”，但是它也与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或一个(种)以上”的含义一致。以单数形式表达的任何元素也包括其复数形式。以复数形式表示的任何元素也包括其单数形式。这里使用的术语“多个(种)”意指一个(种)以上，例如，两个(种)或更多个(种)，三个(种)或更多个(种)，四个(种)或更多个(种)等。如本文所用，术语“约”是指与给定值的约+/-10％的变化。应当理解，无论是否具体提及，这种变化总是包括在本文提供的任何给定值中。
在本说明书中，术语“提取物”或“植物提取物”是指通过用一种或多种提取技术分离或纯化所需活性成分而获得的植物材料的浓缩制剂。提取技术的实例包括但不限于溶剂提取，例如但不限于使用水、乙醇、甲醇、水/乙醇混合物、水/甲醇混合物、乙酸乙酯、色谱法等提取。
在本说明书中，术语“药效有效量”指在技术人员的合理判断范围内，诸如局部施用或全身施用活性物质之类的化合物或组合物的足以显著诱导积极的有益效果(例如治疗脱发)但低至足以避免严重副作用的量，即提供合理的效险比的量。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述组合物中的虎耳草肾萼金腰提取物可选自自秦岭金腰(Chrysosplenium biondianum Engl)、肾萼金腰(Chrysospleniumdelavayi Franch)、理县金腰(Chrysosplenium lixianense Jien ex J.T.Pan)、陕甘金腰(Chrysosplenium qinlingense Jien ex J.T.Pan)、多枝金腰(Chrysosplenium ramosumMaxim)、滇黔金腰(Chrysosplenium cavaleriei Levl.et Vaniot)、毛金腰(Chrysosplenium pilosum Maxim)、林金腰(Chrysosplenium lectus-cochleaeKitagawa)、中华金腰(Chrysosplenium sinicum Maxim)、大武金腰(Chrysospleniumhebetatum Ohwi、山溪金腰(Chrysosplenium nepalense D.Don)至少一种虎耳草科植物提取所得的提取物；优选为自肾萼金腰(Chrysosplenium delavayi Franch)提取所得的提取物。
实施例1：
本实施例提供一种含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物，所述组合物包括：
1)虎耳草肾萼金腰提取物；
2)鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡；以及
3)2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
本发明所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物对5α-还原酶具有不同程度的活性抑制作用，特别地，所述组合物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用几乎能媲美传统5α-还原酶抑制剂非那雄胺，因此所述组合物可为和/或可构成潜在的5α-还原酶抑制剂，这可能导致发展新的天然药物治疗雄激素相关疾病以及由不同的5α-还原酶所导致的诸如毛发脱落、毛发稀疏、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变淡以及高水平的二氢睾酮容易引起雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等。
在本优选实施方案中，还提供了所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物中的虎耳草肾萼金腰提取物的制备方法，所述方法包括下述步骤：
a)肾萼金腰干燥全草粉碎后依次以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取，滤液均以针孔滤膜滤过，合并滤液并浓缩至无醇味、无酯味；
b)浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、氯仿萃取得五种组分并浓缩；
c)步骤b)的浓缩液完全溶解于甲醇，进YMC C18柱，以乙腈-1.1％乙酸水溶液作为流动相，收集10～45min的组分混合并浓缩；
d)以中压色谱塔对步骤c)的混合组分进行色谱分离，收集第五馏分浓缩至恒重即得。
在本优选实施方案中，所述针孔滤膜的型号是0.42um。
在本优选实施方案中，所述以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取时的料液比是1:10，g/mL；所述回流提取温度是60℃；回流提取时间是2h。
在本优选实施方案中，所述步骤d)中中压色谱塔色谱分离的工作参数是指装填MCI微孔树脂固定相；中压色谱塔内径为36.0～100.0mm；制备流动相A是水，B是乙醇；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254nm；流速为25.0mL/min。
在本优选实施方案中，所述步骤d)中的浓缩可为真空浓缩，所述真空浓缩的条件是指真空度为0.05MPa，温度为50℃。
在本优选实施方案中，所述步骤d)中的洗脱方式是：0～90min，体积浓度0％→100％B；90～120min，体积浓度100％→100％B。
以本发明方法中的提取方法制备得到虎耳草提取物，采用多级回流、多级萃取、多级色谱分离以及中亚色谱塔从虎耳草中定向分离提取物，均为可视化操作，不但快速、简单，而且易于规模化扩大；本提取方法的终产物虎耳草提取物中总黄酮的含量可达99.2wt％，其纯度较高，无需进一步纯化即可应用，大大提升了其进一步应用的运用领域和药理学功能。
在本优选实施方案中，还提供了所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物中的所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法，所述方法包括下述步骤：
a)鼠伤寒沙门氏菌菌种复苏并扩大培养；
b)培养物经高速冷冻离心后取上清液，依次以0.45μm滤膜过滤、100Ku超滤膜超滤并浓缩，浓缩液超速冷冻离心取沉淀层；
c)步骤b)的沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液，依次加入40wt％碘克沙醇、25wt％碘克沙醇和150mMNaCl/20mMHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液，超速离心后获取顶部的胞外囊泡部分；
d)步骤c)之胞外囊泡部分以0.1mol/L的PBS溶液重悬沉淀物，超速离心后取沉淀即得；
所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的粒径介于50～300nm之间，当所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡粒浓度为1×1010Particles/mL时的蛋白质浓度达8.2μg/mL。
在本优选实施方案中，所述步骤a)中扩大培养为将复苏后的鼠伤寒沙门氏菌菌种在新鲜LB液体培养基中于200r/min37℃的水平摇床上扩大培养。
在本优选实施方案中，所述步骤b)中的高速冷冻离心为在1℃、9000g条件下高速冷冻离心20min。
在本优选实施方案中，所述步骤b)中的超速冷冻离心为在1℃、120000g条件下超速冷冻柜离心4h。
在本优选实施方案中，所述骤c)中的碘克沙醇梯度溶液和HEPES溶液的添加量可分别为所述由沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液的1倍体积。
在本优选实施方案中，所述步骤c)中通过将混合溶液超速离心然后分离在碘克沙醇中浮力密度为1.00～1.20g/mL的部分来获得步骤c)中的胞外囊泡部分。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的超速离心为在1℃、100000g条件下超速冷离心1h。
本发明所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法简单，胞外囊泡的提取率高，所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡不仅对生物机体的免疫器官具有促发育作用，可显著提高机体血清的溶菌酶活力、血清蛋白含量以及超氧化物歧化酶活性，提高机体的抗感染能力以及免疫能力；此外，所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡还可通过与2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮联用配伍虎耳草肾萼金腰提取物发挥出优异的抑制5α-还原酶的作用，从而使得本发明所述组合物可用于5α-还原酶抑制以及预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适诸如毛发脱落、痤疮、女性多毛、毛色淡化以及高水平的二氢睾酮容易引起的雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述组合物中的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的结构式如式(1)所示：
在本优选实施方案中，还提供了所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物中的所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的制备方法如下：
a)25mmol4-叔丁基噻唑-2-胺溶解于30mL二氯甲烷中，加入25mmol无水碳酸钾，常温搅拌30min，滴加25mmol氯乙酰氯，常温反应1.5h；
b)反应液倒入冰水，二氯甲烷萃取，饱和碳酸钠水溶液洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶，乙醇重结晶得5.50g白色固体1；
c)9mmol化合物1和13.5mmol硫氰酸钾完全溶解于30mL乙醇，加热回流反应2.5h；冷却，析出固体，抽滤，干燥得2.10g黄色固体2即为2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的氢谱和碳谱分别为：
1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:1.33(s,9H,3×CH3),3.88(s,2H,CH2),6.64(s,1H,噻唑环),12.24(s,1H,NH)；
13CNMR(CDCl3,101MHz)δ:29.71,34.77,107.58,139.38,160.38,162.78,172.66.EI-MS m/z:255.3M+。
上述制备过程反应是如下：
在本优选实施方案中，所述含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物由下述占所述组合物重量百分比的成分组成：
1)85.00wt％的虎耳草肾萼金腰提取物；
2)14.00wt％的鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡；以及
3)1.00wt％的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
本发明涉及一种以虎耳草肾萼金腰提取物作为主要成分、同时还包括鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡以及-2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的组合物，所述组合物各组分相互间配伍作用，可对5α-还原酶具有不同程度的活性抑制作用，特别地，所述组合物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用几乎能媲美传统5α-还原酶抑制剂非那雄胺，所述组合物可为和/或可构成潜在的5α-还原酶抑制剂，这可能导致发展新的天然药物治疗雄激素相关疾病以及由不同的5α-还原酶(Ⅰ型5α-还原酶或Ⅱ型5α-还原酶)所导致的诸如毛发脱落、毛发稀疏、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变淡以及高水平的二氢睾酮容易引起雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌等。
实施例2：
本优选实施例提供一种虎耳草肾萼金腰提取物，其制备方法包括下述步骤：
a)肾萼金腰干燥全草粉碎后依次以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取，滤液均以针孔滤膜滤过，合并滤液并浓缩至无醇味、无酯味；
b)浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、氯仿萃取得五种组分并浓缩；
c)步骤b)的浓缩液完全溶解于甲醇，进YMC C18柱，以乙腈-1.1％乙酸水溶液作为流动相，收集10～45min的组分混合并浓缩；
d)以中压色谱塔对步骤c)的混合组分进行色谱分离，收集第五馏分浓缩至恒重即得。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述针孔滤膜的型号是0.42um。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取时的料液比是1:12，g/mL；所述回流提取温度是60℃；回流提取时间是1h。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中中压色谱塔色谱分离的工作参数是指装填MCI微孔树脂固定相；中压色谱塔内径为36.0～100.0mm；制备流动相A是水，B是乙醇；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254nm；流速为40mL/min。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的浓缩可为真空浓缩，所述真空浓缩的条件是指真空度为0.04MPa，温度为60℃。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的洗脱方式是：0～90min，体积浓度0％→100％B；90～120min，体积浓度100％→100％B。
实施例3：
本优选实施例提供一种虎耳草肾萼金腰提取物，其制备方法包括下述步骤：
a)肾萼金腰干燥全草粉碎后依次以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取，滤液均以针孔滤膜滤过，合并滤液并浓缩至无醇味、无酯味；
b)浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、氯仿萃取得五种组分并浓缩；
c)步骤b)的浓缩液完全溶解于甲醇，进YMC C18柱，以乙腈-0.1％乙酸水溶液作为流动相，收集10～45min的组分混合并浓缩；
d)以中压色谱塔对步骤c)的混合组分进行色谱分离，收集第五馏分浓缩至恒重即得。
在本实施方案中，所述针孔滤膜的型号是0.42um。
在本实施方案中，所述以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取时的料液比是1:14，g/mL；所述回流提取温度是65℃；回流提取时间是2h。
在本实施方案中，所述步骤d)中中压色谱塔色谱分离的工作参数是指装填MCI微孔树脂固定相；中压色谱塔内径为36.0～100.0mm；制备流动相A是水，B是乙醇；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254nm；流速为30mL/min。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的浓缩可为真空浓缩，所述真空浓缩的条件是指真空度为0.06MPa，温度为55℃。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的洗脱方式是：0～90min，体积浓度0％→100％B；90～120min，体积浓度100％→100％B。
实施例4：
本优选实施例提供一种虎耳草肾萼金腰提取物，其制备方法包括下述步骤：
a)肾萼金腰干燥全草粉碎后依次以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取，滤液均以针孔滤膜滤过，合并滤液并浓缩至无醇味、无酯味；
b)浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、氯仿萃取得五种组分并浓缩；
c)步骤b)的浓缩液完全溶解于甲醇，进YMC C18柱，以乙腈-2.5％乙酸水溶液作为流动相，收集10～45min的组分混合并浓缩；
d)以中压色谱塔对步骤c)的混合组分进行色谱分离，收集第五馏分浓缩至恒重即得。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述针孔滤膜的型号是0.42um。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取时的料液比是1:8，g/mL；所述回流提取温度是50℃；回流提取时间是1h。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中中压色谱塔色谱分离的工作参数是指装填MCI微孔树脂固定相；中压色谱塔内径为36.0～100.0mm；制备流动相A是水，B是乙醇；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254nm；流速为40mL/min。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的浓缩可为真空浓缩，所述真空浓缩的条件是指真空度为0.04MPa，温度为50℃。
在本申请的发明内容及优选实施方案中，所述步骤d)中的洗脱方式是：0～90min，体积浓度0％→100％B；90～120min，体积浓度100％→100％B。
对比实施例V5：
本对比实施例提供一种虎耳草肾萼金腰提取物，其制备方法包括下述步骤：
取肾萼金腰干燥全草适量，用碎样机粉碎，过筛，保存备用；称取粉碎后的样品于锥形瓶，加入70％的乙醇(料液比1:10，g/mL)，80℃回流提取1h，过滤，重复提取2次，合并2次滤液，减压浓缩至无醇味，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取得5个组分，浓缩即得。
对比实施例V6：
本对比实施例提供一种虎耳草肾萼金腰提取物，其制备方法包括下述步骤：
取肾萼金腰干燥全草适量，用碎样机粉碎，过筛，保存备用；称取粉碎后的样品于锥形瓶，加入70％的乙醇(料液比1:10，g/mL)，80℃回流提取1h，过滤，重复提取2次，合并2次滤液，减压浓缩至无醇味，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取得5个组分，减压浓缩后冻干，称重，保存；取适量薰衣草正丁醇组分提取物加甲醇超声溶解，定容，进制备液相(YMC C18柱，流动相：乙腈-0.2％甲酸水溶液，50min)按时间收集，得50个组分，混合后浓缩即得。
实验例1：
分别对实施例1～4以及对比实施例V5～V6进行总黄酮含量的测定，测定结果如表1所示。由表1可知，本发明的优选实施例1～4中所述虎耳草肾萼金腰提取物的得率与虎耳草肾萼金腰提取物中总黄酮的含量均较高，特别是优选实施例1和优选实施例2中的总黄酮含量均超过了99％，纯度较高，无需进一步纯化即可应用，大大提升了其进一步应用的运用领域和药理学功能。
表1、虎耳草肾萼金腰提取物的得率和纯度测试结果
实施例 得率(提取物/全草重)·mg/g 总黄酮含量·％
1 12.5 99.2
2 12.4 99.1
3 11.8 98.5
4 11.2 98.0
V5 13.1 70.6
V6 14.0 74.2
实施例7：
本优选实施方案提供一种鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法，所述方法包括下述步骤：
a)鼠伤寒沙门氏菌菌种复苏并扩大培养；
b)培养物经高速冷冻离心后取上清液，依次以0.45μm滤膜过滤、100Ku超滤膜超滤并浓缩，浓缩液超速冷冻离心取沉淀层；
c)步骤b)的沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液，依次加入40wt％碘克沙醇、25wt％碘克沙醇和150mMNaCl/20mMHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液，超速离心后获取顶部的胞外囊泡部分；
d)步骤c)之胞外囊泡部分以0.1mol/L的PBS溶液重悬沉淀物，超速离心后取沉淀即得；
所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的粒径介于50～300nm之间，当所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡粒浓度为1×1010Particles/mL时的蛋白质浓度为8.2μg/mL。
在本优选实施方案中，所述步骤a)中扩大培养为将复苏后的鼠伤寒沙门氏菌菌种在新鲜LB液体培养基中于200r/min37℃的水平摇床上扩大培养。
在本优选实施方案中，所述步骤b)中的高速冷冻离心为在1℃、9000g条件下高速冷冻离心30min。
在本优选实施方案中，所述步骤b)中的超速冷冻离心为在1℃、120000g条件下超速冷冻柜离心4h。
在本优选实施方案中，所述骤c)中的碘克沙醇梯度溶液和HEPES溶液的添加量可分别为所述由沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液的1.5倍体积。
在本优选实施方案中，所述步骤c)中通过将混合溶液超速离心然后分离在碘克沙醇中浮力密度为1.00～1.20g/mL的部分来获得步骤c)中的胞外囊泡部分。
在本优选实施方案中，所述步骤d)中的超速离心为在1℃、140000g条件下超速冷离心4h。
实施例8：
本优选实施方案提供一种鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法，所述方法包括下述步骤：
a)鼠伤寒沙门氏菌菌种复苏并扩大培养；
b)培养物经高速冷冻离心后取上清液，依次以0.45μm滤膜过滤、100Ku超滤膜超滤并浓缩，浓缩液超速冷冻离心取沉淀层；
c)步骤b)的沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液，依次加入40wt％碘克沙醇、25wt％碘克沙醇和150mMNaCl/20mMHEPES溶液，超速离心后获取顶部的胞外囊泡部分；
d)步骤c)之胞外囊泡部分以0.1mol/L的PBS溶液重悬沉淀物，超速离心后取沉淀即得；
所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的粒径介于50～300nm之间，当所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡粒浓度为1×1010Particles/mL时的蛋白质浓度为8.1μg/mL。
在本优选实施方案中，所述步骤a)中扩大培养为将复苏后的鼠伤寒沙门氏菌菌种在新鲜LB液体培养基中于200r/min37℃的水平摇床上扩大培养。
在本优选实施方案中，所述步骤b)中的高速冷冻离心为在2℃、8500g条件下高速冷冻离心30min。
在本优选实施方案中，所述步骤b)中的超速冷冻离心为在2℃、110000g条件下超速冷冻柜离心3h。
在本优选实施方案中，所述骤c)中的碘克沙醇梯度溶液和HEPES溶液的添加量可分别为所述由沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液的0.8倍体积。
在本优选实施方案中，所述步骤c)中通过将混合溶液超速离心然后分离在碘克沙醇中浮力密度为1.00～1.20g/mL的部分来获得步骤c)中的胞外囊泡部分。
在本优选实施方案中，所述步骤d)中的超速离心为在2℃、135000g条件下超速冷离心2h。
对比实施例V9：
本优选实施方案提供一种鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法，所述方法包括下述步骤：
将保存的鼠伤寒沙门氏菌菌种复苏，在新鲜LB液体培养基中于200r/min37℃的水平摇床上扩大培养；然后将培养物于4℃12000g进行高速冷冻离心15min；取上清用直径为0.45μm的滤膜过滤；过滤后的滤液经过100Ku滤膜进行超滤得到超滤浓缩液；浓缩液于4℃150000g进行超速离心3h，去上清得到沉淀，用0.1mol/L的PBS溶液重悬沉淀物。随后对重悬液采用从10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％到50％不同体积分数的OptiPrepTM Density Gradient Medium溶液进行梯度密度离心，取20～40％体积分数间的组分后超速离心2h，富集得到的沉淀即为纯化鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡。
实验例2：
分别对实施例1、实施例7～8和对比实施例V9中的鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡进行动物实验，详述如下：
A、实验动物及饲养管理：
取7d龄健康雏鸡，经沙门氏菌感染为阴性、健康及体重一致的肉仔鸡，取100只分为10组，每组10只重复，实验设计分别为对照组(PBS组)、后期攻毒实验用纯感染组(S组)和八组不同剂量胞外囊泡的样品治疗组(P1、P7、P8、PV9均设10、20μg/(d·只))。饲养首周采用24h光照，室温35℃，从8日龄开始每天降低1℃直到25℃。8日龄起采用23L:1D光照制度，每日19:00～20:00停止光照1h。试验鸡饲喂商品饲料，0～21日龄饲喂前期料，22～26日龄饲喂中期料，营养成分满足或超过NRC(1994)的标准，每日于8:00、14:00和20:00共投料3次，自由饮水。
B、鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡免疫程序：
分别对八组样品治疗组施以鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡，从8日龄开始每隔一周进行腹腔注射200μL含有鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的PBS溶液，八组样品治疗组分别对应如下：P1-10为注射含有10μg/(d·只)实施例1所述胞外囊泡的PBS，P1-20为注射含有20μg/(d·只)实施例1所述胞外囊泡的PBS，P7-10为注射含有10μg/(d·只)实施例7所述胞外囊泡的PBS，P7-20为注射含有20μg/(d·只)实施例7所述胞外囊泡的PBS，P8-10为注射含有10μg/(d·只)实施例8所述胞外囊泡的PBS，P8-20为注射含有20μg/(d·只)实施例8所述胞外囊泡的PBS，PV9-10为注射含有10μg/(d·只)对比实施例V9所述胞外囊泡的PBS，PV9-20为注射含有20μg/(d·只)对比实施例V9所述胞外囊泡的PBS。每次连续3d，共注射3次，即在8、9、10日龄第1次注射；在15、16、17日龄第2次注射；在22、23、24日龄第3次注射。PBS组和S组按相同方法注射等量PBS溶液；每次注射前实验肉仔鸡禁水禁食2h，注射后1h恢复水食。
C、样品采集与预处理：
实验第29d，随机选定各实验组的5只试验鸡翅静脉采血2mL，以重复作为分析血样；血液37℃静置1h后，4℃放置过夜，低温冷冻离心机1500g离心20mmin，吸取上层血清，-20℃保存，用于血清免疫相关生理指标的测定。
D、血清免疫相关生理指标测定：
测定第3次免疫1周后即试验第29d天采集血清中免疫相关生理指标，本试验样品检测工作由北京华英生物技术研究所完成。溶菌酶活力采用血清溶菌酶活性测定试剂盒测定，白蛋白质量浓度采用试剂盒溴甲酚绿比色法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用超氧化物歧化酶测定试剂盒进行测定。测定结果如表2所示。
表2、鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡对肉仔鸡血清免疫相关生理指标的影响
由表2可以看出，本发明所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡对肉仔鸡血清免疫相关指标具有积极作用，可显著提高免疫期间肉仔鸡血清中的溶菌酶活性、白蛋白含量和超氧化物歧化酶活性，可在一定程度上促进免疫器官生长发育，改善机体免疫功能。
实施例10～18：
实施例10～18分别提供一种组合物，所述组合物的各组分及所述各组分占据所述组合物重量百分比如表3所示，所述各组分均为实施例1中的各组分。
表3、实施例1、10～18所述组合物组成
实验例3：
分别测定实施例1、实施例10～18中的各组合物对于Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制作用，具体如下。
A、Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的制备及定量：
取雄性SD大鼠40只，禁食不禁水过夜后处死，迅速分别取肝脏及附睾(剥离脂肪组织)，称重，生理盐水漂洗，剪碎，加入5倍量预冷的匀浆液(1mmol/LPMSF、1mmol/LDTT、10％甘油、1mol/LTris-HCl缓冲液；肝脏中富含Ⅰ型5α-还原酶液，Tris-HCl缓冲液pH＝7.5；附睾中富含Ⅱ型5α-还原酶液，Tris-HCl缓冲液pH＝5.5)，在玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于4℃及3000g离心10min，取上清液，再以4℃及10000g离心60min，取上清液即为粗酶，分装，保存于-80℃超低温冰箱中，临用前取出。
采用Lowry法蛋白含量检测试剂盒测定蛋白含量，以粗酶中的总蛋白含量表示5α-还原酶的浓度，操作按照试剂盒说明书进行。
B、组合物对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性实验：
反应体系含有50μL组合物溶液(以各实施例组合物配备0.2mg/mL水溶液)、300μL1mol/LTris-HCl缓冲液、50μL1mmol/L的睾酮、50μL2.5g/L的非那雄胺、500μL酶溶液，加入1mmol/LNADPH100μL后反应开始。混合溶液37℃温育60min，加入1mL预冷甲醇终止反应，混匀，10000r/min离心5min，取上清液并用0.22μm滤膜过滤，供检测睾酮剩余浓度，反应体系见表4。
表4、5α-还原酶的抑制活性反应体系
注：“-”表示不加入该溶液。
用超高效液相色谱系统分析检测睾酮的含量，仪器条件如下：YMC-Triart C18(100mm×2.0mm，1.9μm)；柱温为30℃；流动相：乙腈-水(70/30，体积比)；流速0.2mL/min；检测器为紫外检测器，242nm。配制不同浓度的的睾酮溶液进行液相色谱分析，作标准曲线。以牛血清白蛋白(BSA)的浓度(X)为横坐标，吸光度值(Y)为纵坐标得出BSA标准曲线，BSA标准曲线为Y＝0.787X+0.065，R2＝0.998。经计算肝脏中粗酶浓度为22.42g/L(Ⅰ型5α-还原酶)，附睾中粗酶浓度为1.78g/L(Ⅱ型5α-还原酶)。
C、本发明所述组合物对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制作用：
配制0.29、0.58、1.44、2.88、5.77、14.42、28.84mg/L的睾酮溶液进行液相色谱分析，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，制作睾酮标准曲线。睾酮的标准曲线为Y＝9175441.97X+4165.42，R2＝0.999，表明睾酮在0.29mg/L～28.84mg/L与峰面积具有良好的线性关系，可以用于含量测定，睾酮标准溶液的液相色谱图见图2。
通过色谱测定反应液中睾酮的含量，抑制活性的强弱用抑制率表征，如下式所示：抑制率＝(空白管睾酮浓度的变化值－样品管睾酮浓度的变化值)/空白管睾酮浓度的变化值×100％。
经测定，本发明实施例1、实施例10～18所述组合物样品对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性见图3和图4。由图3和图4可知，本发明的优选实施例中的含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶均具有不同的抑制作用，特别是对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用更强；同时还应看到，联合使用所述组合物中的虎耳草肾萼金腰提取物、鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡和2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮时组合物对5α-还原酶的抑制作用较单独某一种或某两种的组合更加显著，说明书本发明所述组合物各组分间相互配伍可对5α-还原酶具有不同程度的活性抑制作用，本发明所述组合物可以用作5α-还原酶抑制剂，还可以应用于预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适。
实验例4：
分别测定实施例1、实施例10～18中的各组合物的小鼠生发试验：
选110只体重为23～27克健康雄性小白鼠，将所有小白鼠的背部2cm×2cm面积的毛用推子推掉，再用脱毛剂除毛，将小白鼠随机分为11组：一组为空白对照组(25℃蒸馏水)，其余10组分别涂抹实施例1、实施例10～18中的各组合物；其中实施例1、实施例10～18的施用情形为将各组合物配制成0.02mg/mL的25℃水溶液，每天涂抹1次，每次0.5mL，其余饲养条件如进水、进食、活动量等均一致。测试7d和30d后长出毛的长度并求出各组的平均值，测试结果如表5所示。由表5可知，本发明的优选实施例1对小鼠的生发效果最为明显，并显著优于单独某一种组分或某两种组分的组合施用，表明本发明所述组合物可有效促进毛发生长。
表5、小鼠生发实验
注：“-”表示没有毛发再生，“+”表示很少绒毛生长，“++”表示较明显毛发生长，“+++”表示毛发基本状态良好，“++++”表示毛发正常变化无异。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.含有虎耳草肾萼金腰提取物的组合物，其特征在于所述组合物包括：
-虎耳草肾萼金腰提取物；
-鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡；以及
-2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述虎耳草肾萼金腰提取物的制备方法包括下述步骤的至少一种：
a)肾萼金腰干燥全草粉碎后依次以75％乙醇溶液、正丁醇、乙酸乙酯回流提取，滤液均以针孔滤膜滤过，合并滤液并浓缩至无醇味、无酯味；
b)浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、氯仿萃取得五种组分并浓缩；
c)步骤b)的浓缩液完全溶解于甲醇，进YMC C18柱，以乙腈-1.1％乙酸水溶液作为流动相，收集10～45min的组分混合并浓缩；
d)以中压色谱塔对步骤c)的混合组分进行色谱分离，收集第五馏分浓缩至恒重即得。
3.根据权利要求1所述的范文，其特征在于：所述步骤d)中中压色谱塔色谱分离的工作参数是指装填MCI微孔树脂固定相；中压色谱塔内径为36.0～100.0mm；制备流动相A是水，B是乙醇；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254nm；流速为20～45.0mL/min。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的制备方法包括下述步骤的至少一种：
a)鼠伤寒沙门氏菌菌种复苏并扩大培养；
b)培养物经高速冷冻离心后取上清液，依次以0.45μm滤膜过滤、100Ku超滤膜超滤并浓缩，浓缩液超速冷冻离心取沉淀层；
c)步骤b)的沉淀层配制成50wt％碘克沙醇溶液，依次加入40wt％碘克沙醇、25wt％碘克沙醇和150mMNaCl/20mMHEPES溶液，超速离心后获取顶部的胞外囊泡部分；
d)步骤c)之胞外囊泡部分以0.1mol/L的PBS溶液重悬沉淀物，超速离心后取沉淀即得。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述步骤c)中通过将混合溶液超速离心然后分离在碘克沙醇中浮力密度为1.00～1.20g/mL的部分来获得步骤c)中的胞外囊泡部分。
6.根据权利要求1～5任一项所述的组合物，其特征在于：所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡的粒径介于50～300nm之间，当所述鼠伤寒沙门氏菌胞外囊泡粒浓度为1×1010Particles/mL时的蛋白质浓度为不低于8.0μg/mL。
7.权利要求1～6任一项所述组合物的应用，所述应用包括但不限于：
-所述组合物在预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适中的应用；和/或
-所述组合物用于制备5α-还原酶抑制剂的应用；和/或
-所述组合物用于制备预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适的组合物的应用；和/或
-所述组合物用于制备预防和/或治疗由5α-还原酶所导致的机体不适的药物制剂的应用；
其中，所述5α-还原酶包括Ⅰ型5α-还原酶、Ⅱ型5α-还原酶以及两者的结合。
8.一种5α-还原酶抑制剂，其特征在于
所述抑制剂中含有药物有效量的权利要求1～6任一项所述组合物，
所述5α-还原酶抑制剂可选包括Ⅰ型5α-还原酶抑制剂、Ⅱ型5α-还原酶抑制剂或者两者的结合。
9.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物中含有药物有效量的权利要求1～6任一项所述组合物。
10.权利要求9所述药物组合物的应用，其特征在于所述应用包括将所述药物组合物适用于具有下述不适症状的个体以预防和/或治疗所述不适：由5α-还原酶异常引起的毛发脱落、毛发稀疏、毛发干燥、毛发易脆易断、毛发油腻、毛发自觉瘙痒、瘢痕性脱发、斑秃、痤疮、女性多毛、发色变灰、发色变淡、发色变杂、以及它们的组合，或者高水平的二氢睾酮容易引起的雄激素依赖型疾病如雄激素性脱发、良性前列腺增生和前列腺癌，还包括由5α-还原酶引起的其他机体不适，所述5α-还原酶包括Ⅰ型5α-还原酶和Ⅱ型5α-还原酶。
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