CN110272418A - 三氮唑类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种三氮唑类化合物及其制备方法和应用，本发明提供的三氮唑化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(I)所示结构：其中，R1、R2、R3各自独立地选自‑SO2R4、‑SO2R5、COR6、H和卤素；R4、R5、R6各自独立地选自芳基、杂芳基、直链或支链的烷基、烯基和环烷基；其中，所述芳基、杂芳基、直链或支链的烷基、烯基和环烷基是未被取代的或被R7取代的；R7选自卤素、C1‑5直链或支链的烷基、卤代烷基、C1‑5直链或支链的烷氧基和硝基。该类化合物对BRD4具有较好抑制活性、具有HIV潜伏病毒感染激活活性，并且毒性低，具有较好的成药性和更潜在的临床应用价值。

Description

三氮唑类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及三氮唑类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，即艾滋病病毒，是一种能够引起人类免疫系统功能缺陷的逆转录病毒。进入人体后主要攻击T淋巴细胞，阻断细胞免疫和体液免疫，造成免疫系统崩溃，引起各种疾病的扩散，最终导致艾滋病(AIDS)，这给人类健康和社会稳定造成了极大的威胁。由于缺乏预防HIV感染的有效疫苗，高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前临床上最行之有效的HIV/AIDS治疗手段，通过三个或更多的抗HIV药物联用，可最大限度地抑制HIV复制，但不能彻底根除病毒，在停止HAART治疗后病毒会迅速反弹，主要是由于一部分HIV病毒能够潜伏在静息记忆CD4+细胞中形成潜伏病毒库。
HIV潜伏病毒库的存在是阻碍艾滋病治愈的根本原因。减小和消除HIV潜伏病毒库的关键在于从源头上阻断新的HIV潜伏病毒库形成，以及使用现在国际上公认的“激活再杀灭(shockand kill)”策略。即先通过使用潜伏病毒激活剂来刺激并激活已经存在的HIV潜伏病毒使其复活，再配以抗艾滋病病毒药物治疗，达到治愈艾滋病的目的。近年来，在体外已经构建起U1、Ach2、J-Lat T等多种HIV潜伏病毒细胞系(这些细胞含HIV整合病毒DNA，但不释放游离病毒)，也从经HAART治疗后的病人中分离出原代静息性CD4+T细胞。研究者们通过这些细胞层面的筛选已经发现了大量HIV潜伏病毒激活剂，其中BRD4抑制剂类潜伏病毒激活剂是研究的热点。
BRD4即溴结构域蛋白4，属于BET溴结构域家族成员。BET家族包含四种蛋白，即BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。每个成员均含有两个高度保守的溴结构域，例如BRD4(BD1),BRD4(BD2)。BRD4作用于细胞周期蛋白激酶9和细胞周期蛋白T1所组成的正性转录延伸因子核心部分，参与HIV、EBV、HPV等病毒的转录调控。研究证实，BRD4能够抑制P-TEFb的两个蛋白复合体CDK9和CycT1与Tat蛋白共同作用，激活HIV的转录过程，从而激活了潜伏病毒的复制。近年来，以BRD4为靶标设计的抑制剂在抗肿瘤、抗感染、抗病毒等方面的潜在应用价值已获得了广泛关注，成为表观遗传领域内的重要靶标之一。
这其中，JQ1是最早发现的具有HIV潜伏病毒激活活性的BRD4抑制剂，其结构为JQ1通过抑制T细胞的复制、下调T细胞激活的基因、上调染色质的修饰基因及赖氨酸脱甲基酶来增加TAT蛋白的活性，从而诱导HIV病毒的转录。但是发明人发现，由于JQ1的化学结构与苯二氮卓类镇静催眠药相似，具有神经毒性较大，水溶性差、高细胞毒性等副作用，限制了其成药的可能性。因此，亟待开发活性高、毒副作用低的新结构类型BRD4抑制剂。
发明内容
发明人调研发现由JQ1与BRD4的共结晶复合物可知(图1)，其活性结合区域由三部分(KAC、ZAchannel、WPF)组成，JQ1能很好地伸入三个区域产生疏水性相互作用。基于此，本发明基于靶标结构特点设计了一类三氮唑类化合物，并提供了其制备方法和应用。本发明的化合物具有显著的BRD4蛋白抑制活性，能够作为HIV潜伏病毒激活剂、且毒性低，具有较好的成药性和更潜在的临床应用价值。
具体地，本发明具有如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了三氮唑化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(I)所示结构：
其中，R1、R2、R3各自独立地选自-SO2R4、-SO2R5、COR6、H和卤素；
R4、R5、R6各自独立地选自芳基、杂芳基、直链或支链的烷基、烯基和环烷基；其中，所述芳基、杂芳基、直链或支链的烷基、烯基和环烷基是未被取代的或被R7取代的；
R7选自卤素、C1-5直链或支链的烷基、卤代烷基、C1-5直链或支链的烷氧基和硝基。
在本发明的实施方式中，R1选自-SO2R4、-SO2R5和-COR6。R4和R5不相同。
在本发明的实施方式中，R2、R3各自独立地选自卤素，所述卤素为F或Cl。
在本发明的实施方式中，R4、R5、R6各自独立地选自被R7取代的芳基、杂芳基、C1-5直链或支链的烷基、C3-6的环烷基和C2-6的烯基；其中，所述芳基为C6-8的芳基；杂芳基为C5-8的单环杂芳基或C7-20的多环杂芳基，杂原子选自N、O和S。
在本发明的实施方式中，R4、R5或R6中，所述芳基为苯基；所述杂芳基选自噻吩基、吡咯基、呋喃基、吡啶基、吡嗪、噻唑基、喹啉基、异喹啉、嘧啶基、四氮唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、吲哚基、哌嗪基和四氢哌嗪基。
在本发明的实施方式中，R4、R5、R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、环丙基和乙烯基。
在本发明的实施方式中，R7选自F、Cl、Br、甲基、三氟甲基、甲氧基和硝基。
在本发明的实施方式中，当R4、R5或R6为时，R7取代基的连接位置可以为：
在本发明的实施方式中，所述化合物具有以下结构：
其中，R2、R3、R4、R5、R6的定义如上文中所述。
在本发明的实施方式中，所述化合物具有以下结构：
其中，R4、R5、R6的定义如上文中所述。
在本发明的实施方式中，R4选自其中，R7选自F、Cl、Br、甲基、三氟甲基、甲氧基和硝基。
在本发明的实施方式中，R5、R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、环丙基和乙烯基。
在本发明的实施方式中，所述化合物具有以下结构：
R2、R3、R7的定义如上文中所述。
在本发明的实施方式中，所述化合物选自以下结构：
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A1)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-氟苯磺酰胺(化合物YHP-A2)；
4-氯-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A3)；
4-溴-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A4)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲苯磺酰胺(化合物YHP-A5)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺酰胺(化合物YHP-A6)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-硝基苯磺酰胺(化合物YHP-A7)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺(化合物YHP-A8)；
3-溴-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A9)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)噻吩-2-磺酰胺(化合物YHP-A10)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)丙烷-1-磺酰胺(化合物YHP-A11)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)环丙烷磺酰胺(化合物YHP-A12)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)丙酰胺(化合物YHP-A13)；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)环丙烷甲酰胺(化合物YHP-A14)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙磺酰胺(化合物YHP-A15)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙烯磺酰胺(化合物YHP-A16)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺酰胺(化合物YHP-A17)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲基苯磺酰胺(化合物YHP-A18)；
4-溴-N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A19)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-硝基苯磺酰胺(化合物YHP-A20)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-氟苯磺酰胺(化合物YHP-A21)；
4-氯-N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A22)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)噻吩-2-磺酰胺(化合物YHP-A23)；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)新戊酰胺(化合物YHP-A24)；
N-(4-(2,4-二氯苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙磺酰胺(化合物YHP-A25)；
4-氯-N-(4-(2,4-二氯苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A26)。
以及，本发明上述的化合物的可药用盐(药学上可接受的盐)、其光学异构体、非对映异构体、消旋混合物、溶剂合物或者前药也是本发明要保护的内容。
本发明所述的三氮唑类化合物可以游离形式或以盐的形式存在，目的是为了提高水溶性，增加生物利用度。“药学上可接受的盐”是指常规的无毒性的盐，主要包括本申请含氮杂环衍生物碱与无机或有机酸形成的季铵盐。无机酸包括(但不限于)盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、二磷酸、氢溴酸、氢碘酸、六氟磷酸等；有机酸包括(但不限于)乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸等。此外，本领域熟练技术人员可以根据溶解度、稳定性、容易制剂等取某种盐而舍去另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的化合物的方法，其包括以2-肼基-5-溴吡啶为起始原料，经环合、铃木反应、取代反应、硝基还原、以及磺胺化或酰胺化得到式(I)化合物。
在本发明的实施方式中，所述方法包括进行以下反应：
其中，R1、R2、R3的定义如上文中所述。
在本发明的一些实施方式中，所述方法按如下所示路线进行：
上述制备流程中所用的试剂分别为：(a)原乙酸三乙酯，130℃；(b)碳酸钠；四(三苯基膦)钯；2-氟-5-硝基苯硼酸，1,4-二氧六环和水；95℃；(c)碳酸铯，含R2、R3取代基的苯酚，DMSO，100℃；(d)10％钯碳/H2；甲醇，室温；(e)吡啶，含R1取代基的磺酰氯或酰氯，二氯甲烷，0℃至室温。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)2-肼基-5-溴吡啶以原乙酸三乙酯为溶剂在130℃条件下经环合生成中间体2；
(2)将2-氟-5-硝基苯硼酸与中间体2以1,4-二氧六环和水为溶剂，加入催化剂四(三苯基膦)钯和碳酸钠，在氮气保护，95℃条件下反应10-16小时，制得中间体3；
(3)将含R2、R3取代基的苯酚，碳酸铯及中间体3置于圆底烧瓶中，再加入DMSO，在100℃的环境下反应比如2小时，分别制得中间体4a、4b、4c；
(4)将中间体4a、4b或4c置于圆底烧瓶中，以甲醇为溶剂，加入催化剂钯碳,在氢气环境下室温反应比如12小时，分别制得中间体5a、5b、5c；
(5)将中间体5a、5b或5c置于圆底烧瓶中，以二氯甲烷为溶剂，加入吡啶，含R1取代基的磺酰氯或酰氯，在氮气环境下室温反应比如24小时，制得本发明式(I)所示的三氮唑类化合物。
在本发明的一些实施方式中，上述步骤(1)中所述的溶剂为原乙酸三乙酯；所述的溶剂的用量为每毫摩尔的2-肼基-5-溴吡啶用5mL溶剂。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中所述的中间体2、2-氟-5-硝基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钠的摩尔比为1:1.5:0.1:3，所述的溶剂量为每1mmol中间体2、1,4-二氧六环为10毫升，水为2毫升。
在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中所述中间体3，含R2、R3取代基的苯酚，碳酸铯的摩尔比为1:1.1:1.1，所述的DMSO溶剂量为每1mmol中间体3，溶剂量为5毫升。
在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中所述钯碳质量为中间体4的十分之一，所述甲醇溶剂量每1mmol中间体4a～c，溶剂量为10毫升。
在本发明的一些实施方式中，步骤(5)中所述间体5a～c、含R1取代基的磺酰氯或酰氯，吡啶的摩尔比为1：1.1：3，所述二氯甲烷溶剂量为每1mmol中间体5a～c，溶剂量为10毫升。
以及，本发明的制备方法中也包括对各中间体及产物的分离与纯化的操作，比如经或不经洗涤、干燥、浓缩等常规处理操作后进行选自萃取、层析(比如柱层析、薄层板层析)、HPLC、重结晶等等中的一种或多种操作。
本发明所述制备方法具有原材料来源广泛、成本低、方法操作简单、条件温和等优点。本领域技术人员可根据本发明的公开进一步对本发明的反应条件进行优化和筛选，然而，需要注意的是，本发明公开了核心的构思与设计，在不背离本发明的构思或设计、或者在本发明的构思或设计的基础上的常规的替换或删减均应视为包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明上述第一方面中所述的化合物。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物制剂，其包含上述第一方面中所述的化合物或包含这些化合物中任一种或多种的组合物，与至少一种药学上可接受的载体或辅料。
本发明所述的组合物指包括治疗有效量的规定成分的药物产品，以及直接或间接地由规定量的规定成分的组合产生的任何产品。本发明所述的组合物尤其指药物组合物，其通常是安全、无毒且为生物学上所需要的。
本发明中所述药学上可接受的载体或辅料是无毒且安全的，而且其与本发明所述化合物的组合或者与本发明所述组合物的组合也是无毒且安全的。本发明所述的药学上可接受的载体和辅料通常为本领域人员所熟知的，或者可由本领域技术人员根据实际情况能够确定的。合适的载体和辅料的实例包括葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇、玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、海藻酸、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠、交联羧甲基纤维素钠和淀粉羟乙酸钠等等聚山梨酯80、聚乙二醇300、聚乙二醇400、环糊精或其衍生物，比如((2-羟基丙基)-环糊精)和(2-羟基乙基)-环糊精，其又称为HPCD、聚乙二醇化蓖麻油、泊洛沙姆(比如泊洛沙姆407或188)；亲水载体、疏水载体，或其组合等。疏水载体包括，例如脂肪乳剂、脂质、聚乙二醇化磷脂、生物相容的聚合物、脂质球、脂质体、小囊泡、聚合物基质、颗粒等等。
载体在药物组合物中的含量可以是1wt％-98wt％，通常大约占到80wt％。为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲剂等可直接溶于载体中。
本发明所述的组合物，可以以选自以下任意方式施与：口服、肠胃外给药、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。
本发明化合物或含有它的组合物或药物制剂可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。
在本发明的第五方面，本发明还提供了上述第一方面中所述的化合物或上述第三方面中所述的组合物或上述第四方面中所述的药物制剂在制备HIV潜伏病毒感染激活剂药物中的应用。
在本发明的实施方式中，本发明的三氮唑类化合物(如上述第一方面中所述)表现了较强的HIV潜伏感染病毒激活效果，多数都优于阳性对照物JQ1，EC50在3.13～9.02μM之间，部分化合物的活性与JQ1相当。
以及，在ACH2潜伏病毒感染细胞系中的激活倍数(RMA)的测定实验中，本发明的化合物与JQ1相比，绝大多数化合物优于JQ1的激活活性，本发明化合物在10μM浓度下的激活倍数RMA在1.68～10.5之间。
在本发明的第六方面，本发明还提供了上述第一方面中所述的化合物或上述第三方面中所述的组合物或上述第四方面中所述的药物制剂在制备BRD4抑制剂药物中的应用。
在本发明的实施方式中，本发明化合物对BRD4具有较好抑制活性，在1μM的浓度下对BRD4的抑制作用均高于阳性对照JQ1，其对BRD4/BD1抑制率在96％以上，最高可达100％，对BRD4/BD2抑制率在96％以上，最高可达100％。
以及，本发明化合物对人正常细胞的半数毒性浓度CC50均大于其激活效果EC50，与JQ1相比，毒性更低，表明本发明的三氮唑类化合物在激活浓度下毒性较低，具有更强的成药性和更潜在的临床应用价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为BRD4的三个活性口袋及其与JQ1的作用模式图。
图2为实施例6中化合物YHP-A16与BRD4的三个活性口袋及关键氨基酸作用模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 化合物的制备
本发明的化合物的合成路线如下所示：
上述制备流程中所用的试剂分别为：(a)原乙酸三乙酯，130℃；(b)碳酸钠；四(三苯基膦)钯；2-氟-5-硝基苯硼酸，1,4-二氧六环和水；95℃；(c)碳酸铯，含R2，R3取代基的苯酚，DMSO，100℃；(d)10％钯碳/H2；甲醇，室温；(e)吡啶，含R1取代基的磺酰氯或酰氯，二氯甲烷，0℃至室温。
(1)中间体2：6-溴-3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶的制备
将1.87g(10mmol)2-肼基-5-溴吡啶溶于50mL原乙酸三乙酯，升温至130℃反应1小时，将混合物倒入100mL冰水中，用乙酸乙酯萃取(60mL×3)萃取，合并有机相，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩蒸干后，用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20:1,v:v)得1.1g白色固体，收率52％。熔点：147～149℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.74(s,1H),7.70(d,J＝9.7Hz,1H),7.42(d,J＝9.6Hz,1H),2.70(s,3H)；ESI-MS(m/z):212.1[M+H]+；理论计算值：C7H6BrN3 211.97[M+H]+。
(2)中间体3：6-(2-氟-5-硝基苯基)-3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶的制备
将中间体2(424mg，2mmol)，2-氟-5-硝基苯硼酸(552mg，3mmol)、四(三苯基膦)钯(232mg，0.2mmol)、碳酸钠(636mg，6mmol)溶于20mL 1,4-二氧六环和4mL水的混合溶液中，于95℃，氮气保护下反应10小时。旋干混合物，得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,v:v)，得白色固体386mg，收率71％。熔点：240～242℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.73(d,J＝11.6Hz,1H),8.64–8.55(m,1H),8.40(dd,J＝9.0,4.2Hz,1H),7.84(d,J＝9.5Hz,1H),7.77–7.66(m,1H),7.63–7.57(m,1H),2.76(d,J＝1.5Hz,2H),2.68(d,J＝1.5Hz,1H)；ESI-MS(m/z):273.10[M+H]+；理论计算值：C13H9F1N4O2 273.07[M+H]+。
(3)中间体4a：6-(2-(2,4-二氟苯氧基)-5-硝基苯基)-3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶的制备
将中间体3(272mg，1mmol)和碳酸铯(358mg，1.1mmol)溶于5mL DMSO中，缓慢地加入1,4-二氟苯酚(143mg，1.1mmol)，在100℃下加热2小时。乙酸乙酯萃取后，将有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩滤液，用硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,v:v)分离纯化得油状液体336mg，收率88％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.69(d,J＝2.6Hz,1H),8.24(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),7.62(d,J＝7.0Hz,1H),7.49(ddd,J＝13.4,7.2,3.6Hz,2H),7.32–7.19(m,2H),7.10(td,J＝8.6,1.9Hz,1H),7.03(d,J＝9.1Hz,1H),2.72(s,3H)；ESI-MS(m/z):383.10[M+H]+；理论计算值:C19H12F2N4O3 383.09[M+H]+。
(4)中间体4b：6-(2-(2,4-二氟苯氧基)-5-硝基苯基)-1-甲基二氢吲哚-2,3-二酮的制备
将中间体3(272mg，1mmol)和碳酸铯(358mg，1.1mmol)溶于5mL DMSO中，缓慢地加入1,4-二氯苯酚(178.2mg，1.1mmol)，在100℃下加热2小时。乙酸乙酯萃取后，将有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩滤液，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,v:v)分离纯化得油状液体377mg，收率91％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.76(d,J＝2.6Hz,1H),8.23(dd,J＝9.3,2.3Hz,1H),7.56(d,J＝8.2Hz,1H),7.49(ddd,J＝14.2,7.1,3.5Hz,2H),7.31–7.29(m,2H),7.15(td,J＝8.5,1.8Hz,1H),7.04(d,J＝9.2Hz,1H),2.75(s,3H).ESI-MS(m/z):415.10[M+H]+；理论计算值:C19H12Cl2N4O3 415.03[M+H]+。
(5)中间体4c：6-(2-(4-氯-2-氟苯氧基)-5-硝基苯基)-3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶的制备
将中间体3(272mg，1mmol)和碳酸铯(358mg，1.1mmol)溶于5mL DMSO中，缓慢地加入4-氯-2-氟苯酚(161mg，1.1mmol)，在100℃下加热2小时。乙酸乙酯萃取后，将有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩滤液，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1,v:v)分离纯化得油状液体366mg，收率92％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.66(d,J＝2.5Hz,1H),8.33(dd,J＝9.2,2.2Hz,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,1H),7.39(ddd,J＝14.1,7.2,3.5Hz,2H),7.21–7.19(m,2H),7.10(td,J＝8.6,1.7Hz,1H),7.05(d,J＝9.1Hz,1H),2.72(s,3H).ESI-MS(m/z):399.10[M+H]+；理论计算值:C19H12ClFN4O3 399.06[M+H]+。
(6)中间体5a：4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯胺的制备
将中间体4a(191mg，0.5mmol)，10％钯碳19.1mg溶解于5mL甲醇中，通入氢气，室温反应过夜，过滤并浓缩。用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)，得白色固体164mg，收率93％。熔点214～216℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.40(s,1H),7.68(d,J＝9.5Hz,1H),7.41(d,J＝9.6Hz,1H),7.30(s,1H),7.00–6.75(m,4H),6.73–6.60(m,1H),5.23(s,2H),2.68(s,3H).ESI-MS(m/z):353.10[M+H]+；理论计算值：C19H14F2N4O 353.11[M+H]+。
(7)中间体5b：4-(2,4-二氯苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯胺的制备
将中间体4b(208mg，0.5mmol)，10％钯碳20.8mg溶解于5mL甲醇中，通入氢气，室温反应过夜，过滤并浓缩。用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)，得白色固体183mg，收率95％。熔点208～210℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.37(s,1H),7.66(d,J＝9.5Hz,1H),7.54(t,J＝2.0Hz,1H),7.36(dd,J＝9.5,1.8Hz,1H),7.22(dt,J＝8.9,2.0Hz,1H),6.93(dd,J＝8.7,1.4Hz,1H),6.80(t,J＝2.1Hz,1H),6.69(ddd,J＝8.7,7.1,1.8Hz,2H),5.31(s,2H),2.67(d,J＝1.4Hz,3H)；ESI-MS(m/z):385.10[M+H]+；理论计算值：C19H14Cl2N4O 385.05[M+H]+。
(8)中间体5c：4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯胺的制备
将中间体4c(199mg，0.5mmol)，10％钯碳19.9mg溶解于5mL甲醇中，通入氢气，室温反应过夜，过滤并浓缩。用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)，得白色固体167mg，收率91％。熔点217～219℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.42(s,1H),7.62(d,J＝9.4Hz,1H),7.42(d,J＝9.5Hz,1H),7.31(s,1H),7.05–6.74(m,4H),6.72–6.61(m,1H),5.22(s,2H),2.67(s,3H).ESI-MS(m/z):369.10[M+H]+；理论计算值：C19H14ClFN4O 369.08[M+ H]+。
(9)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A1)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和苯磺酰氯(83mg，0.46mmol)，在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得180mg白色固体，收率87％。熔点：204～206℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.38(s,1H),8.33(s,1H),7.86–7.52(m,6H),7.47–7.35(m,2H),7.27(d,J＝2.7Hz,1H),7.17(td,J＝9.2,5.4Hz,1H),7.13–7.02(m,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H).ESI-MS(m/z):493.12[M+H]+；理论计算值：C25H18F2N4O3S 493.11[M+H]+。
(10)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-氟苯磺酰胺(化合物YHP-A2)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和4-氟苯磺酰氯(89.24mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得184mg白色固体，收率86％。熔点：241～243℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.39(s,1H),8.34(s,1H),7.86(dt,J＝9.2,3.4Hz,2H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.48–7.38(m,4H),7.30(t,J＝2.0Hz,1H),7.19(td,J＝9.2,5.6Hz,1H),7.14–7.03(m,2H),6.85(d,J＝8.8Hz,1H),2.71(d,J＝1.5Hz,3H).ESI-MS(m/z):511.12[M+H]+；理论计算值：C25H17F3N4O3S 511.10[M+H]+。
(11)4-氯-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A3)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和4-氯苯磺酰氯(97mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得179mg白色固体，收率81％。熔点：225～227℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.40(s,1H),8.35(s,1H),7.87(dt,J＝9.3,3.5Hz,2H),7.75(d,J＝9.6Hz,1H),7.49–7.39(m,4H),7.31(t,J＝2.1Hz,1H),7.18(td,J＝9.3,5.7Hz,1H),7.15–7.04(m,2H),6.86(d,J＝8.9Hz,1H),2.72(d,J＝1.6Hz,3H).ESI-MS(m/z):527.12[M+H]+；理论计算值：C25H17ClF2N4O3S 527.07[M+H]+。
(12)4-溴-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A4)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和4-溴苯磺酰氯(117mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得189mg白色固体，收率79％。熔点：221～223℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.46(s,1H),8.36(s,1H),7.88–7.66(m,5H),7.42(ddd,J＝14.7,8.7,2.4Hz,2H),7.30(d,J＝2.8Hz,1H),7.20(td,J＝9.2,5.5Hz,1H),7.08(dd,J＝9.1,2.8Hz,2H),6.85(d,J＝8.9Hz,1H),2.71(s,3H).ESI-MS(m/z):571.10[M+H]+；理论计算值：C25H17BrF2N4O3S 571.02[M+H]+。
(13)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲苯磺酰胺(化合物YHP-A5)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和4-甲基苯磺酰氯(87mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得174mg白色固体，收率82％。熔点：136～138℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.31(s,1H),8.34(s,1H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.68(d,J＝7.9Hz,2H),7.39(t,J＝10.2Hz,4H),7.28(d,J＝2.5Hz,1H),7.17(td,J＝9.1,5.5Hz,1H),7.12–7.02(m,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H),2.36(s,3H).ESI-MS(m/z):507.10[M+H]+；理论计算值：C26H20F2N4O3S 507.12[M+H]+。
(14)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺酰胺(化合物YHP-A6)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和4-三氟甲基苯磺酰氯(112mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得183mg白色固体，收率78％。熔点：227～229℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.61(s,1H),8.37(s,1H),8.00(s,4H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.49–7.36(m,2H),7.32(d,J＝2.6Hz,1H),7.21(td,J＝9.2,5.6Hz,1H),7.07(td,J＝9.1,4.7Hz,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H).ESI-MS(m/z):561.10[M+H]+；理论计算值：C26H17F5N4O3S 561.09[M+H]+。
(15)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-硝基苯磺酰胺(化合物YHP-A7)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和4-硝基苯磺酰氯(101mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得171mg白色固体，收率76％。熔点：256～258℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.70(s,1H),8.49–8.28(m,3H),8.12–7.96(m,2H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.53–7.38(m,2H),7.37–7.30(m,1H),7.23(td,J＝9.2,5.5Hz,1H),7.14–7.03(m,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),2.71(s,3H).ESI-MS(m/z):538.10[M+H]+；理论计算值：C26H17F2N5O5S 538.09[M+H]+。
(16)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺(化合物YHP-A8)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和4-甲氧基苯磺酰氯(95mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得147mg白色固体，收率67％。熔点：155～157℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.24(s,1H),8.34(s,1H),7.77–7.69(m,3H),7.40(t,J＝9.5Hz,2H),7.28(t,J＝2.0Hz,1H),7.21–7.01(m,5H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),3.81(d,J＝1.4Hz,3H),2.71(s,3H).ESI-MS(m/z):523.10[M+H]+；理论计算值：C26H20F2N4O4S523.12[M+H]+。
(17)3-溴-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A9)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和3-溴苯磺酰氯(117mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得191mg白色固体，收率80％。熔点：176～278℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.61(s,1H),8.37(s,1H),8.00(s,4H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.49–7.36(m,2H),7.32(d,J＝2.6Hz,1H),7.21(td,J＝9.2,5.6Hz,1H),7.07(td,J＝9.1,4.7Hz,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H).ESI-MS(m/z):571.10[M+H]+；理论计算值：C25H17BrF2N4O3S 571.02[M+H]+。
(18)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)噻吩-2-磺酰胺(化合物YHP-A10)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和2-噻吩磺酰氯(84mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得123mg白色固体，收率89％。熔点：235～237℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.49(s,1H),8.36(s,1H),7.95(d,J＝5.0Hz,1H),7.75(d,J＝9.5Hz,1H),7.59(d,J＝3.7Hz,1H),7.42(t,J＝11.5Hz,2H),7.31(d,J＝2.6Hz,1H),7.25–7.12(m,3H),7.07(t,J＝8.4Hz,1H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H).ESI-MS(m/z):499.10[M+H]+；理论计算值：C23H16F2N4O3S2 499.06[M+H]+。
(19)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)丙烷-1-磺酰胺(化合物YHP-A11)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和丙烷磺酰氯(65mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得164mg白色固体，收率85％。熔点：181～183℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.85(s,1H),8.47(s,1H),7.76(d,J＝9.5Hz,1H),7.54–7.37(m,3H),7.23(ddt,J＝14.7,9.2,4.0Hz,2H),7.08(t,J＝8.2Hz,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,1H),3.18–3.05(m,2H),2.70(s,3H),1.73(h,J＝7.5Hz,2H),0.97(t,J＝7.4Hz,3H).ESI-MS(m/z):459.10[M+H]+；理论计算值：C22H20F2N4O3S 459.12[M+H]+。
(20)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)环丙烷磺酰胺(化合物YHP-A12)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和环丙烷磺酰氯(64mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得159mg白色固体，收率83％。熔点：121～123℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.82(s,1H),8.56(s,1H),7.82(d,J＝9.5Hz,1H),7.61(d,J＝9.5Hz,1H),7.50–7.39(m,2H),7.35–7.21(m,2H),7.09(t,J＝8.6Hz,1H),6.95(d,J＝8.8Hz,1H),2.73(s,3H),1.23(s,1H),0.96(t,J＝7.4Hz,4H).ESI-MS(m/z):457.10[M+H]+；理论计算值：C22H18F2N4O3S 457.11[M+H]+。
(21)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)丙酰胺(化合物YHP-A13)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和丙酰氯(43mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得151mg白色固体，收率88％。熔点：211～213℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.04(s,1H),8.47(s,1H),7.87–7.79(m,1H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.66–7.57(m,1H),7.49(d,J＝9.5Hz,1H),7.45–7.36(m,1H),7.17(td,J＝9.3,5.5Hz,1H),7.05(t,J＝8.7Hz,1H),6.93(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H),2.33(q,J＝7.5Hz,2H),1.15–1.02(m,3H).ESI-MS(m/z):409.15[M+H]+；理论计算值：C22H18F2N4O2409.14[M+H]+。
(22)N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)环丙烷甲酰胺(化合物YHP-A14)的制备
将中间体5a(150mg，0.42mmol)溶于4.2mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(103mg，1.3mmol)和环丙甲酰氯(48mg，0.46mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得137mg白色固体，收率78％。熔点：251～253℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.37(s,1H),8.48(s,1H),7.83(d,J＝2.5Hz,1H),7.74(d,J＝9.6Hz,1H),7.65–7.57(m,1H),7.49(d,J＝9.6Hz,1H),7.46–7.36(m,1H),7.18(td,J＝9.2,5.5Hz,1H),7.06(t,J＝8.8Hz,1H),6.93(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H),1.85–1.74(m,1H),0.80(d,J＝6.2Hz,4H).ESI-MS(m/z):421.12[M+H]+；理论计算值：C23H18F2N4O2421.14[M+H]+。
(23)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙磺酰胺(化合物YHP-A15)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和乙烷磺酰氯(55mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得131mg白色固体，收率73％。熔点：119～121℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.92(s,1H),8.47(s,1H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.56(dt,J＝10.8,1.9Hz,1H),7.49–7.38(m,2H),7.26(ddt,J＝23.8,9.0,2.1Hz,2H),7.15–7.02(m,2H),3.16(q,J＝7.3Hz,2H),2.69(d,J＝1.5Hz,3H),1.28–1.21(m,3H).ESI-MS(m/z):461.10[M+H]+；理论计算值：C21H18ClFN4O3S 461.08[M+H]+。
(24)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙烯磺酰胺(化合物YHP-A16)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和乙烯磺酰氯(54mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得112mg白色固体，收率63％。熔点：151～153℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.95(s,1H),8.48(s,1H),7.75(d,J＝9.6Hz,1H),7.57(dt,J＝10.8,1.9Hz,1H),7.48–7.37(m,2H),7.25(ddt,J＝23.7,9.1,2.1Hz,2H),7.14–7.12(m,2H),6.58–6.41(m,H)6.16(q,J＝7.2Hz,2H),2.68(d,J＝1.4Hz,3H).ESI-MS(m/z):459.10[M+H]+；理论计算值：C21H16ClFN4O3S 459.06[M+H]+。
(25)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺酰胺(化合物YHP-A17)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和4-三氟甲基苯磺酰氯(105mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得164mg白色固体，收率73％。熔点：224～226℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.62(s,1H),8.38(s,1H),8.01(s,4H),7.75(d,J＝9.6Hz,1H),7.48–7.35(m,2H),7.31(d,J＝2.5Hz,1H),7.20(td,J＝9.1,5.5Hz,1H),7.08(td,J＝9.2,4.8Hz,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,1H),2.71(s,3H).ESI-MS(m/z):577.10[M+H]+；理论计算值：C26H17ClFN4O3S 577.06[M+H]+。
(26)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲基苯磺酰胺(化合物YHP-A18)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和4-甲基苯磺酰氯(82mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得157mg白色固体，收率77％。熔点：131～133℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.31(s,1H),8.34(s,1H),7.74(d,J＝9.5Hz,1H),7.68(d,J＝7.9Hz,2H),7.39(t,J＝10.2Hz,4H),7.28(d,J＝2.5Hz,1H),7.17(td,J＝9.1,5.5Hz,1H),7.12–7.02(m,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(s,3H),2.36(s,3H).ESI-MS(m/z):523.10[M+H]+；理论计算值：C26H17ClFN4O3S 523.09[M+H]+。
(27)4-溴-N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A19)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和4-溴苯磺酰氯(109mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得171mg白色固体，收率75％。熔点：235～237℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.45(s,1H),8.35(s,1H),7.87–7.65(m,5H),7.41(ddd,J＝14.8,8.8,2.5Hz,2H),7.31(d,J＝2.7Hz,1H),7.21(td,J＝9.1,5.4Hz,1H),7.08(dd,J＝9.2,2.7Hz,2H),6.85(d,J＝8.8Hz,1H),2.72(s,3H).ESI-MS(m/z):587.05[M+H]+；理论计算值：C26H17BrClFN4O3S 586.99[M+H]+。
(28)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-硝基苯磺酰胺(化合物YHP-A20)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和4-硝基苯磺酰氯(95mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得153mg白色固体，收率71％。熔点：261～263℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.71(s,1H),8.48–8.27(m,3H),8.11–7.95(m,2H),7.75(d,J＝9.4Hz,1H),7.52–7.37(m,2H),7.35–7.30(m,1H),7.22(td,J＝9.1,5.5Hz,1H),7.13–7.03(m,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,1H),2.72(s,3H).ESI-MS(m/z):554.10[M+H]+；理论计算值：C25H17ClFN5O5S 554.06[M+H]+。
(29)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-氟苯磺酰胺(化合物YHP-A21)的制备
将中间体5b(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和4-氟苯磺酰氯(83mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得125mg白色固体，收率61％。熔点：232～234℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.37(s,1H),8.33(s,1H),7.89(dt,J＝9.1,3.4Hz,2H),7.64(d,J＝9.5Hz,1H),7.47–7.35(m,4H),7.31(t,J＝2.0Hz,1H),7.19(td,J＝9.1,5.6Hz,1H),7.15–7.03(m,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),2.71(d,J＝1.4Hz,3H).ESI-MS(m/z):527.10[M+H]+；理论计算值：C25H17ClF2N4O3S 527.07[M+H]+。
(30)4-氯-N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A22)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和4-氯苯磺酰氯(90mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得137mg白色固体，收率65％。熔点：236～238℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.36(s,1H),8.32(s,1H),7.88(dt,J＝9.0,3.2Hz,2H),7.62(d,J＝9.5Hz,1H),7.45–7.32(m,4H),7.28(t,J＝2.0Hz,1H),7.18(td,J＝9.1,5.6Hz,1H),7.14–7.03(m,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,1H),2.70(d,J＝1.3Hz,3H).ESI-MS(m/z):543.10[M+H]+；理论计算值：C25H17Cl2F1N4O3S 543.04[M+H]+。
(31)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)噻吩-2-磺酰胺(化合物YHP-A23)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和2-噻吩磺酰氯(78mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得136mg白色固体，收率68％。熔点：227～229℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.48(s,1H),8.35(s,1H),7.94(d,J＝5.1Hz,1H),7.74(d,J＝9.4Hz,1H),7.56(d,J＝3.6Hz,1H),7.41(t,J＝11.4Hz,2H),7.32(d,J＝2.5Hz,1H),7.24–7.12(m,3H),7.06(t,J＝8.3Hz,1H),6.87(d,J＝8.7Hz,1H),2.72(s,3H)；ESI-MS(m/z):515.10[M+H]+；理论计算值：C23H16ClFN4O3S2 515.03[M+H]+。
(32)N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)新戊酰胺(化合物YHP-A24)的制备
将中间体5c(150mg，0.40mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和特戊酰氯(52mg，0.44mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得116mg白色固体，收率66％。熔点：116～118℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.05(s,1H),8.48(s,1H),7.88–7.78(m,1H),7.75(d,J＝9.4Hz,1H),7.65–7.56(m,1H),7.48(d,J＝9.4Hz,1H),7.44–7.35(m,1H),7.16(td,J＝9.2,5.4Hz,1H),7.04(t,J＝8.6Hz,1H),6.92(d,J＝8.7Hz,1H),2.71(s,3H),1.15–1.02(s,9H).ESI-MS(m/z):453.15[M+H]+；理论计算值：C24H22ClFN4O2S 453.14[M+H]+。
(33)N-(4-(2,4-二氯苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙磺酰胺(化合物YHP-A25)的制备
将中间体5b(150mg，0.39mmol)溶于3.9mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和乙烷磺酰氯(54mg，0.43mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得144mg白色固体，收率76％。熔点：134～136℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.95(s,1H),8.47(t,J＝1.3Hz,1H),7.73(dd,J＝9.5,1.0Hz,1H),7.66(d,J＝2.5Hz,1H),7.44(dd,J＝8.9,2.0Hz,2H),7.32(td,J＝9.4,2.6Hz,2H),7.08(d,J＝8.8Hz,1H),6.97(d,J＝8.8Hz,1H),3.17(q,J＝7.3Hz,2H),2.69(s,3H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H).ESI-MS(m/z):477.05[M+H]+；理论计算值：C21H18Cl2N4O3S 477.05[M+H]+。
(34)4-氯-N-(4-(2,4-二氯苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺(化合物YHP-A26)的制备
将中间体5b(150mg，0.39mmol)溶于3.9mL二氯甲烷中，冰浴条件下依次加入吡啶(92mg，1.2mmol)和4-氯苯磺酰氯(92mg，0.43mmol)在氮气保护下室温反应24小时，混合物用1mol/L HCl(1mL)调节pH后用DCM萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100:5,v:v)得160mg白色固体，收率72％。熔点：246～243℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.52(s,1H),8.36(s,1H),7.84–7.76(m,2H),7.75–7.63(m,4H),7.45–7.29(m,3H),7.12(dd,J＝8.8,2.7Hz,1H),6.94(dd,J＝13.9,8.8Hz,2H),2.69(s,3H).ESI-MS(m/z):559.05[M+H]+；理论计算值：C25H17Cl3N4O3S 559.01[M+H]+。
实施例2：化合物对BRD4蛋白的抑制活性检测
通过均相时间分辨荧光技术(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF)检测化合物对BRD4的抑制活性。具体原理和实验方法如下：
实验原理：HTRF结合了荧光共振能量转移FRET和时间分辨荧光TRF两种技术的优势，将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特点融合在一起，具有操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠的特点。
实验步骤：使用DMSO对化合物进行稀释。使用试剂盒中的Diluent Buffer稀释BRD4(BD2、BD2)和Biotin标记的组蛋白H4肽段，并配置反应液。使用试剂盒中的DtectionBuffer稀释Anti-GST-TB2+Cryptate和SA-XL-665，并配置检测液。取384孔板，按照排板布置，板上分别为对照孔min(高浓度阳性药)，待测化合物孔，对照孔max(DMSO)，阳性药对照孔。向孔板中加入对应浓度的化合物或DMSO溶液。向孔板中加入反应液，随后加入检测液，振摇30秒。室温下孵育2小时，用Envision检测仪读取荧光数值和HTRF信号值。待测化合物按实施例1方法制备。
数值处理：抑制率＝(Max-Signal)/(Max-Min)*100。Max为Biotin标记的组蛋白H4肽段与BRD4(BD1、BD2)完全结合时的HTRF信号值。Signal为相应浓度下的化合物的HTRF信号值。Min为高浓度阳性药下Biotin标记的组蛋白H4肽段与BRD4(BD1、BD2)完全不结合时的HTRF信号值。
实验结果：本发明化合物在1μM的浓度下对BRD4的抑制作用均高于阳性对照JQ1，结果见表1。
表1 对BRD4的抑制率结果
实施例3：化合物在J-Lat HIV-1潜伏病毒感染细胞系中的EC50
实验原理：EC50为半数最大效应浓度，指化合物达到激活HIV潜伏病毒活性50％效应时所对应的化合物浓度，单位为μM。
实验步骤：取生长良好的假病毒感染的J-Lat细胞铺于96孔透明板中，细胞用量为每孔2×105个，分别加入不同浓度的待测化合物(按实施例1方法制备)，终浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、0μM，JQ1为阳性对照组，未处理组为阴性对照，每个浓度至少3个复孔，每个实验重复3次。于5％CO2孵箱中培养24h后离心收取细胞，弃上清,使用PBS清洗一次，弃上清，然后用PBS重悬。使用流式细胞仪检测相应细胞的GFP表达水平并分析结果。
实验结果：见表2。
表2
由表2结果可知，本发明化合物表现了较强的HIV潜伏病毒感染的激活效果，多数都优于阳性对照物JQ1，部分化合物的活性与JQ1相当。
实施例4：化合物对正常细胞的毒性CC50
实验原理：CC50为衡量化合物毒性的指标，指引起半数正常细胞变异的化合物浓度，单位为μM。
实验步骤：按每孔2×104个正常人外周血单核细胞(PBMC)种植于96孔板，每孔加入100ul含10％FBS(购自Gibco)的DMEM培养基(购自Gibco)，24小时后，分别加入不同浓度的待测化合物(按实施例1方法制备)，使终浓度分别为0、50、100、200、400、800μM，JQ1为阳性对照，每个浓度至少3个复孔，每个实验重复3次，药物处理细胞72小时后，在每孔中加入0.5mg/mL MTT试剂(购自Sigma)，充分振荡1h，于酶标仪上570nm处测OD值。
实验结果：见表3。
表3
由表3结果可知，本发明化合物对人正常细胞的半数毒性浓度CC50均大于其激活效果EC50，与JQ1相比，毒性更低，结果表明本发明的三氮唑类化合物在激活浓度下毒性较低，具有更强的成药性和更潜在的临床应用价值。
实施例5：化合物在ACH2潜伏病毒感染细胞系中的激活倍数(RMA)测定
实验原理：Relative maximum activation(RMA)为衡量化合物最大激活活性的指标，是化合物最大激活活性与对照化合物SAHA最大激活活性的比值。EC50和RMA是衡量化合物激活潜伏病毒HIV活性的重要指标。
实验步骤:取生长良好的ACH2细胞铺于96-孔透明板中，细胞用量为每孔2×106个，分别加入10μM待测化合物(按实施例1方法制备)及SAHA，JQ1为阳性对照，未处理组为阴性对照，48小时后收集细胞上清，加入等体积的5％TritionX-100，4℃过夜，ELISA法测定HIV-1p24抗原含量的具体步骤如下：
1)包被：用包被缓冲液(pH 9.6，0.85M的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液)将p24单克隆抗体(183-12H-5C)稀释至浓度为5μg/ml，加入到96孔孔板中，每孔50μl，4℃放置过夜。2)洗涤：每孔加入200μl PBS-T洗液洗涤1次。3)封闭：每孔加入150μl的2％脱脂奶粉，37℃孵育1h，洗板1次。4)样品和标准品的孵育：标准品HIV-1p24蛋白按照最大浓度为200ng/ml进行倍比稀释7个浓度，以PBS为空白对照组。样品则用PBS按一定比例稀释将浓度控制在标准曲线范围以内，每孔加入50μl，37℃孵育1h，洗板3次。5)一抗孵育：每孔加入50μl用PBS稀释至1μg/ml的HIV-1IgG，37℃孵育1h，洗板3次。6)二抗孵育：用2％脱脂牛奶按1：10000比例稀释生物素标记的羊抗人IgG。每孔加入50μl，37℃孵育1h，洗板3次。7)标记物孵育：用10％山羊血清按1:10000比例稀释链霉素标记的辣根过氧化物酶SA-HRP。每孔加入50μl，37℃孵育1h，洗板6次。8)显色：每孔加入50μl的TMB，室温孵育，显色2-5min，等待空白PBS孔即将出现浅蓝色时，每孔加入25μl 1M的硫酸，终止显色。9)检测：在酶标仪中检测450nm波长下的吸光度值。以吸光度为横坐标，标准品HIV-1p24浓度为纵坐标绘制标准曲线。再根据样品吸光度值计算出对应的HIV p24浓度。10)计算激活倍数RMA：与JQ1的相比，RMA的数值越高活性越好。
实验结果：见表4。
表4
化合物 激活倍数RMA(10μM) 化合物 激活倍数RMA(10μM)
YHP-A1 ND YHP-A2 6.65
YHP-A3 5.49 YHP-A4 ND
YHP-A5 3.01 YHP-A6 ND
YHP-A7 ND YHP-A8 5.99
YHP-A9 7.20 YHP-A10 7.43
YHP-A11 8.30 YHP-A12 8.71
YHP-A13 6.75 YHP-A14 ND
YHP-A15 7.85 YHP-A16 10.16
YHP-A17 ND YHP-A18 ND
YHP-A19 ND YHP-A20 ND
YHP-A21 5.35 YHP-A22 5.24
YHP-A23 5.89 YHP-A24 ND
YHP-A25 9.07 YHP-A26 1.68
JQ1 2.06
注：ND＝Not detectable；Relative maximum activation(RMA)＝peakp24produced in the presence of a compound/peak p24induced by SAHA.RMAis usedhere as an indicator for relative robustness of latent viral reactivation ofan LRA when compared to SAHA.
实施例6：化合物与BRD4的对接研究
实验原理：SYBYL是美国Tripos公司开发的计算机分子模拟软件，其中Surflex-D℃k分子对接模块采用独特的经验打分函数和拥有专利的搜索引擎(基于分子相似性的搜索引擎)将配体分子对接到蛋白的结合位点，属于柔性对接技术，同时支持考虑生物大分子蛋白残基柔性的对接，是化合物虚拟活性筛选的主要考量因素，可为发现新型BRD4靶点先导化合物及其结构改造和修饰提供理论支撑和技术指导。
实验步骤：1)从蛋白质数据库中下载BRD4复合物晶体结构5UVV；2)配体优化：在对接软件中画出配体分子，进一步优化处理在SYBYL配体准备模块(ligand structurepreparation)进行。首先，对配体分子进行加氢处理；然后，进行能量优化，参数设置如下：力场设定为Tripos力场，能量优化计算方法为Powell，梯度为最大迭代次数为10,000次。3)受体优化：在SYBYL Surflex-D℃k蛋白准备模块(prepare proteinstructure)对5UVV进行优化处理。首先将复合物晶体结构中的配体抽提出来，对蛋白进行加氢处理。然后，以复合物晶体结构中配体分子的坐标为中心生成原型分子即对接口袋，保存当前生成的文件用于下一步分子对接操作。4)配体分子与BRD4蛋白分子对接：为了检验分子对接软件的对接效果，并进一步确定BRD4抑制剂与蛋白对接的合适参数，在SYBYLSurflex-D℃k模块，将配体分子对接回蛋白活性口袋。选择Surflex-D℃k对接模式，导入处理后的受体分子和配体分子，对接参数设置如下：每个片段的最大生成构象(Maxconformations per Fragment)为20，每个配体分子最大输出构象(MaximumNumber ofPoses per Ligand)为20，最终保留对接构象间的RMSD值(Minimum RMSD BetweenFinalPoses)为为了比较对接构象与结晶构象之间的差异，设定5UVV中。
结果分析：挑选HIV潜伏病毒激活活性良好的代表化合物YHP-A16与BRD4的晶体结构进行了对接实验，结果显示YHP-A16能通过柔性取代基的伸展而伸入三个关键结合腔KAC、ZA和WPF区域产生疏水性结合作用(图2A)。同时,YHP-A16能与ZA区的关键氨基酸Asp381产生氢键作用以及通过水分子桥与KAC识别口袋中的Tyr390、ASN433形成网状氢键结构(图2B)。基于此方法，本发明的化合物YHP-A1～YHP-A26能够产生类似的结果。因此，这与实施例2-5实验测得的活性结果一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.三氮唑化合物，其具有式(I)所示结构：
其中，R1、R2、R3各自独立地选自-SO2R4、-SO2R5、COR6、H和卤素；
R4、R5、R6各自独立地选自芳基、杂芳基、直链或支链的烷基、烯基和环烷基；其中，所述芳基、杂芳基、直链或支链的烷基、烯基和环烷基是未被取代的或被R7取代的；
R7选自卤素、C1-5直链或支链的烷基、卤代烷基、C1-5直链或支链的烷氧基和硝基；
或式(I)化合物药学上可接受的盐、其光学异构体、非对映异构体、消旋混合物、溶剂合物或者前药。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1选自-SO2R4、-SO2R5和-COR6；
优选地，R2、R3各自独立地选自卤素，所述卤素为F或Cl。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R4、R5、R6各自独立地选自被R7取代的芳基、杂芳基、C1-5直链或支链的烷基、C3-6的环烷基和C2-6的烯基；其中，所述芳基为C6-8的芳基；杂芳基为C5-8的单环杂芳基或C7-20的多环杂芳基，杂原子选自N、O和S；
优选地，R4、R5或R6中，所述芳基为苯基；所述杂芳基选自噻吩基、吡咯基、呋喃基、吡啶基、吡嗪、噻唑基、喹啉基、异喹啉、嘧啶基、四氮唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、吲哚基、哌嗪基和四氢哌嗪基；
优选地，R4、R5、R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、环丙基和乙烯基；
优选地，R7选自F、Cl、Br、甲基、三氟甲基、甲氧基和硝基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有以下结构：
其中，R2、R3、R4、R5、R6的定义如权利要求1-3中所述；
优选地，所述化合物具有以下结构：
其中，R4、R5、R6的定义如权利要求1-3中所述；
优选地，R4选自其中，R7选自F、Cl、Br、甲基、三氟甲基、甲氧基和硝基；
优选地，R5、R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、环丙基和乙烯基；
优选地，所述化合物具有以下结构：
R2、R3、R7的定义如权利要求1-3中所述。
5.根据权利要求1至4中任一项中所述化合物，其特征在于，所述化合物选自以下：
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-氟苯磺酰胺；
4-氯-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺；
4-溴-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲苯磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-硝基苯磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲氧基苯磺酰胺；
3-溴-N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)噻吩-2-磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)丙烷-1-磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)环丙烷磺酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)丙酰胺；
N-(4-(2,4-二氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)环丙烷甲酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙磺酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙烯磺酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-甲基苯磺酰胺；
4-溴-N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-硝基苯磺酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)-4-氟苯磺酰胺；
4-氯-N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)噻吩-2-磺酰胺；
N-(4-(4-氯-2-氟苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)新戊酰胺；
N-(4-(2,4-二氯苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)乙磺酰胺；
4-氯-N-(4-(2,4-二氯苯氧基)-3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)苯基)苯磺酰胺。
6.制备权利要求1至5中任一项所述的化合物的方法，其以2-肼基-5-溴吡啶为起始原料，经环合、铃木反应、取代反应、硝基还原、以及磺胺化或酰胺化得到式(I)化合物；
优选地，所述方法包括进行以下反应：
其中，R1、R2、R3的定义如权利要求1至5中任一项所述。
7.组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的化合物。
8.药物制剂，其包含权利要求1至5中任一项所述的化合物或权利要求7中所述的组合物，与至少一种药学上可接受的载体或辅料。
9.权利要求1至5中任一项所述的化合物或权利要求7中所述的组合物或权利要求8中所述的药物制剂在制备HIV潜伏病毒感染激活剂药物中的应用。
10.权利要求1至5中任一项所述的化合物或权利要求7中所述的组合物或权利要求8中所述的药物制剂在制备BRD4抑制剂药物中的应用。
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