CN110271771A - 一种优化细胞保存的细胞存储器、细胞存储装置和细胞存储方法 - Google Patents
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Abstract
一种优化细胞保存的细胞存储器、包含该细胞存储器的细胞存储装置、及其细胞存储方法，该细胞存储器包括细胞存储单元(7)、外壳(9)和电场输出单元(6)；所述细胞存储单元(7)和所述电场输出单元(6)设置在所述外壳(9)内；所述电场输出单元(6)包括电极片(8)，该电极片(8)设置在细胞存储单元(7)外侧；在所述细胞存储单元(7)和所述电场输出单元(6)之间设置有绝缘的介质(11)进行防护；在细胞存储期间，所述电场输出单元(6)对所述细胞存储单元(7)中的保存对象施加静电场干扰，场强范围在5‑40kV/m。从而，在细胞制品保存的过程中，降低溶剂的冰点，降低细胞的冷藏温度，减缓代谢；抑制冰晶的形成，减少冻存时的机械损伤，起到提高细胞活力的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞低温保存领域，具体地涉及一种优化细胞保存的细胞存储器、细胞存储装置和细胞存储方法，主要用于强化细胞活性的保持，提升冰冻保存后细胞存活率，延长冷藏下细胞的保存时间。
背景技术
冷藏和冷冻是生物细胞最常见的长期保存方法，被广泛应用于科学研究与医疗。细胞制品冷藏和冷冻过程中，通过降温减缓细胞代谢或衰老，但细胞膜内外的渗透压不平衡或形成不规则的冰晶挤压细胞致其被破坏甚至死亡。因此如何降低细胞制品冷藏温度，减缓细胞代谢；如何延长结冰时间，维持细胞膜内外渗透压平衡，抑制细胞内外的冰晶形成，减少冰晶对细胞的损伤，是细胞低温保存的重要研究课题。
目前常用低温保存方法主要有两种，一种是通过添加低温保护剂抑制细胞内冰晶的形成，即慢速冷冻法；另一种是通过极高的冷冻速率对细胞或组织进行快速冷冻，成玻璃态，使细胞内外无法形成冰晶，即玻璃化冷冻法。上述两种方法均存在一定缺陷，慢速冷冻法加入冷冻保护剂，会造成污染，对细胞有害；玻璃化冷冻法对技术设备要求高，能耗高，对于大量的细胞制品玻璃化冷冻暂无法实现。其他低温保存方法，如交流电磁场低温保存方法，其频率达到1-1000KHz，面临同玻璃化冷冻法相似的困境。
发明内容
为了增强细胞制品冷藏、冰冻的保存效果，本发明目的在于提供一种优化细胞保存的细胞存储器、细胞存储装置和细胞存储方法。从热力学第二定律出发，过冷是水结冰的必要条件。静电场使水的过冷度增大，水分子形成冰核的温度降低。通过静电场辅助细胞制品保存过程中，在0度至过冷点水不结冰，抑制冰晶形成，减少细胞损伤；降低冷藏温度，减缓细胞代谢或衰老，起到较好的冷藏作用。根据电介质物理理论，静电场可使水分子极化，冰核均匀生长，减少了不规则的冰晶对细胞的挤压或穿刺，从而减少细胞的机械性损伤。在特定的场强范围内，静电场对细胞的冷藏和冷冻特殊保护作用会达到最佳效果。因此本发明在细胞制品保存的过程中，对保存对象施加合适强度的静电场，从而降低细胞的冷藏温度，减缓细胞代谢或衰老；减少冻存时的机械损伤，起到提高细胞活力的效果。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种细胞存储器，其特征在于，包括细胞存储单元、外壳和电场输出单元；所述细胞存储单元和所述电场输出单元设置在所述外壳内；所述电场输出单元包括电极片，该电极片覆盖在细胞存储单元周围；在所述细胞存储单元和所述电场输出单元之间设置有充分绝缘的介质进行防护；在降温或恒温过程中，所述电场输出单元对所述细胞存储单元中的保存对象施加静电场干扰，场强范围在5-40kV/m。
进一步地，所述介质是在所述电极片上涂布的高介电常数的介质涂层，或在所述电极片周围填充的高介电常数的介质。
进一步地，包括多个所述细胞存储单元，每个细胞存储单元之间由所述电极片间隔。
本发明还提供一种细胞存储装置，包括电场发生器、细胞存储器(上述细胞存储器)和显示控制器，所述电场发生器包括中央控制单元、电源管理单元、信号发生单元和信号处理与放大单元，所述细胞存储器包括电场输出单元和细胞存储单元，所述显示控制器由人机交互单元控制；所述人机交互单元收集用户需求并显示来自所述装置的反馈，并将用户需求传递到中央控制单元进行处理，中央控制单元控制信号发生单元和信号处理与放大单元产生激励电场发生高压直流信号，通过电场输出单元将高压直流信号施加到细胞存储单元；在降温或恒温过程中，所述电场输出单元对所述细胞存储单元中的保存对象施加静电场干扰，场强范围在5-40kV/m。
进一步地，所述电场发生器还包括外壳以及外接电路或电池；所述电场发生器一端接入100-240V、50-60Hz的外接电路或接入电池，另一端则将发生的高压直流电输出至所述细胞存储器以产生静电场。
进一步地，所述人机交互单元由电源管理单元进行供电，并且可以包括触摸式显示屏、显示屏配合控制按键。
本发明还提供一种细胞存储方法，其特征在于，在降温或恒温过程中对保存的细胞施加静电场干扰，场强范围在5-40kV/m。
进一步地，所述场强范围在12-18kV/m。
进一步地，场强在15kV/m。
进一步地，静电场干扰时的温度范围在10到-80℃。
与现有技术相比较，本发明具备如下优点：
1.在静电场干扰，特别是15kV/m的场强下，静电场使水(溶剂)在较低温度下不结冰，降低生物细胞冷藏保存的温度，减缓细胞代谢或衰老，延长细胞制品的保存时间，保持细胞活性，减少活性损失，对细胞制品冷藏等领域具有深远的社会经济意义和广阔的应用前景。
2.在静电场干扰，特别是15kV/m的场强下，细胞制品冻存过程中，静电场可延长结冰时间，抑制冰晶形成，减少细胞破损，保持细胞活性的特点，对生物细胞制品现有主流保存方法与途径进行了有力补充。
附图说明
图1为本装置整体框架示意图；
图2为本装置电场发生器示意图；
图3为本装置细胞存储器示意图；
图4为本装置外观结构示意图，(a)为便携式、小容量的生物细胞存储装置，(b)为可拆卸的细胞存储器，其外接电场发生装置，(c)为仓储式电场发生装置；
图5(a)为未经过任何处理的冷冻复苏后人黑色素细胞HEM染色显微照片；
图5(b)为10kV/m静电场干扰冷冻复苏后人黑色素细胞HEM染色显微照片；
图5(c)为15kV/m静电场干扰冷冻复苏后人黑色素细胞HEM染色显微照片；
图5(d)为20kV/m静电场干扰冷冻复苏后人黑色素细胞HEM染色显微照片；
图6为不同场强处理下B16黑色素瘤细胞复苏后的细胞活力；
图7为不同场强处理下B16黑色素瘤细胞传代培养的细胞活力。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1
电场发生装置的优化设计
图1是本发明优化细胞保存效果的细胞存储装置的整体架构示意图。该细胞存储装置包括：中央控制单元1，电源管理单元2，信号发生单元3，人机交互单元4，信号处理与放大单元5，电场输出单元6，细胞存储单元7。使用者通过阅读人机交互单元4上反馈的来自中央控制单元1的状态信息，进行选择和操作，其操作结果反馈至中央控制单元1进行处理。中央控制单元1接收到指令开始动作，控制电源管理单元2为信号发生单元3提供合适的直流电信号，由其整流滤波处理，交由信号处理与放大单元5进行进一步处理，输出至电场输出单元6，经由其中电介质等的调整，在其内的细胞存储单元7内产生符合要求的高压静电场。其中，所述人机交互单元4由电源管理单元2进行供电，接收来自使用者的需求，通常为施加电场的强度、范围和时间长度等，并将中央控制器1返回的反馈信息呈现给使用者，可为触摸式显示屏、显示屏配合控制按键、智能手机应用等形式。
如图2所示，电压由外接电源或电池流入，经由电源管理单元2提供稳恒低压电源，为中央控制单元1、人机交互单元4、各单元中的反馈电路提供低压恒定电源，同时为信号发生单元3、信号处理与放大单元5提供所需的高压直流信号。该高压直流信号经过信号发生单元3的脉宽调制，成为可调节电压的稳压直流电信号，并经由中央控制单元1的控制指令进行调节，经过逆变电路、中高频变压、倍压整流、高压限流的处理，变为交流电信号、高压交流电信号、高压直流电信号、低电流高压直流电信号，传入电场输出单元6。
其中，所述电源管理单元2从外接电源或电池接入电路，通过整流滤波电路得到高压直流电，通常为300V左右；再经脉宽调制电路得到稳压可变直流电，经由中央控制单元1发送的信号控制，通常约为0-150V范围；再通过逆变电路，将信号变为交流电以便进一步提升电压；然后通过中高频变压器提升电压，再经由倍压整流电路得到高压直流电，通常为0-200kV左右；最后通过高压限流电路输出至电场输出单元6。
所述中央控制单元1以微控制单元为核心，可以为STM32等各类微控制单元，通过符合国际标准的通讯协议，可以是串口、蓝牙、无线局域网等各种通讯方式，收集各单元发回的反馈，并将符合预设程序的指令发送给各单元。
所述电源管理单元2以各类电源管理芯片、模块、电路等为核心，通过处理外接的100-240V、50-60Hz市电电源，或拥有足够供电能力和蓄电储量的电池，所提供的电能，为显示控制器、电场发生器中的各单元提供稳定而充足的工作电压与工作电流。若由电池供电，则本电源管理单元2还包含充电管理模块。
所述信号发生单元3以信号发生芯片、模块、电路为核心，接收来自中央控制单元1的控制指令，产生预设的、符合要求的电信号，并收集来自本信号发生单元3和信号处理与放大单元5的反馈信号，发送给中央控制单元1。
所述信号处理与放大单元5接收信号发生单元4发生的符合要求的电信号，对其进行处理与放大，包括但不限于整流、滤波等处理流程，再将处理完成的电压传输给电场输出单元6；同时，接收来自本信号处理与放大单元5和电场输出单元7的反馈信号，并通过信号发生单元3反馈给中央控制单元1。
所述人机交互单元4以各类人机交互界面为核心，可以为触摸式显示屏、显示屏配合控制按键、智能手机应用等多种形式，收集来自使用者的指令和需求，发送给中央控制单元1，并从中央控制单元1接收信息，显示在显示屏或智能手机应用界面上，为使用者提供反馈。
所述电场输出单元6以输出电场的电极片为核心，包含对电场进行进一步调节的各类介质，可以为高电阻率、高导热性、高介电系数的材料制成的薄膜涂层或绝缘层，例如二氧化钛、由铌酸铅镁和钽酸铅组合构成的陶瓷等。
所述细胞存储单元7为电场输出单元6内的一个隔绝开来的存储空间，可以小于电场输出单元6内的容量，以保证所有存放其内的细胞制品均受到满足保存需求的电场的作用，应有良好的绝缘性能和表面性能，以保证细胞制品不受电流、电弧等的破坏。
如图3所示，所述的电场输出单元6包裹在保护外壳9内，其中放置着细胞存储单元7。电场输出单元6以形状合适的电极片8为核心，通常为覆盖超过整个细胞存储单元7范围的大面积电极薄片，其上设置有高介电常数的介质涂层10，或其周围应有高介电常数的介质10填充，以降低空气中的电场损耗。其中合适位置、合适范围放置细胞存储单元7，以保证所有细胞制品都置于指定场强的空间电场内，其与电场输出单元6之间形成有充分绝缘的介质11进行防护，细胞存储单元7与电场输出单元6间应有良好的绝缘性能，细胞存储单元7的表面也应达到足够的加工精度，以防止出现漏电、电弧等现象对保存其中的细胞制品造成损伤。
其中，通过对储存细胞制品的区域施加一定范围内的高压静电场，通常在5-40kV/m范围，优选地，12-18kV/m可带来更佳的效果，使得保存在常温、冷藏、冷冻条件下的生物细胞制品的保存期限延长，生物活性和制剂效果的保留更加充分。
如图4(a)所示为便携式存储箱的一种可能的形式。由于电场在空气中迅速损耗，可通过减少电极片间距离增强空间内电场强度和均匀性，减少所需空间和能耗。其中，存储箱相对的两壁相连，例如可将前后壁相连作为正极，左右壁相连作为负极，其外包裹金属网11以防止外界对箱体内的电场产生影响。内壁上与每层隔板，即电极片8所在位置的对应位置处，为裸露的电极，为每层隔板中的电极片提供电位。隔板交错与正负极相连，使得隔板交错成为空间电场的正负极，例如单数隔板为正极，双数隔板为负极。为方便进行图示，将正负极绘制与相对的两壁上，实际情况下可按前述方式安排以增强电场的均匀性。
如图4(b)所示为可拆卸的存储箱，可将电场发生器、显示控制器作为一体式外接系统12，连接到需要进行电场保存的存储箱外部。如图4(c)所示为仓储式存储箱，在仓库外通过显示控制器13对库内电场发生器、细胞存储器相结合的一体式储存柜14的不同分区进行分别控制，实现整个仓库范围内的，经由一定参数的高压静电场的保存效果优化。
所述显示控制器、电场发生器、细胞存储器，经由结构外观设计，可以多种形式存在；显示控制器、电场发生器、细胞存储器可以使用同一外壳，成为便携式、小容量的生物细胞存储装置；显示控制器、电场发生器与细胞存储器分离，以统一接口连接，则使得该装置成为生物细胞制品保存盒的外界装置；显示控制器与电场发生器、细胞存储器分离，则使得本装置成为大型细胞制品存储仓库的内部装置之一，使用时在仓库外进行统一调控，仓库内所有存储箱按区域划分进行统一管理。
另外，细胞存储器也可和电场发生器、显示控制器可以共用同一外壳，但盛放细胞制品的细胞存储单元7的内壁需为单独壳体。
实施例2
生理盐水的低温保存
精密称量9.00g氯化钠，溶于1000mL超纯水中，配置成生理盐水溶液，分装在50mL锥形瓶中。调节高压直流电源的输出电压，使场强依次为0、10、15、20、25、30、40、60kV/m，分别在-8、-10、-12度条件下冷冻。每组实验重复6次，同一冷却速率下冷冻。
将光纤伸入锥形瓶中，固定在生理盐水溶液的中心，使用光纤测温仪实时记录样品中心的温度，传输至计算机。当样品(生理盐水溶液)的中心温度由过冷状态温度升至生理盐水的凝固点温度时，冻结完成，两者的温度差为生理盐水溶液的过冷度。
计算溶液从4℃始至冻结完成所花费的时间t，即溶液的冻结时间。使用SPSS软件对数据进行统计学处理，数据以表示，进行正态检验后进行齐次性检验，选择单因素方差分析比较各实验组与对照组是否存在显著性差异，P＜0.05认为具有显著性差异。
实验结果
表1电场干扰组与对照组相比，施加静电场后三组生理盐水的过冷度均显著提高了，其P＜0.05，具有显著性差异。在15kV/m场强下生理盐水的过冷度变化最明显，增加了0.6℃，与其他组对比具有差异。结果表明静电场可增大溶液的过冷度，降低溶液冻结的冰点。
表1静电场作用下中生理盐水溶液的过冷度
注：＊表示在0.05水平有显著性差异，均为与对照组进行比较
表2在-8℃的条件下，施加15kV/m电场可以使溶液不发生冻结。在-10℃和-12℃的条件下，电场干预组与对照组相比，冻结时间显著延长；15kV/m场强组与其他场强组对比，延长溶液冻结的时间差异更显著。结果表明静电场可延长了溶液冻结的时间，抑制冰晶的形成。表2静电场作用下-8℃、-10℃、-12℃冷却温度中生理盐水溶液的冻结时间
注：＊表示在0.05水平有显著性差异，均为与对照组进行比较
实施例3
低压静电场对人黑色素细胞HEM的冷冻保存
从细胞培养箱中取出生长较好的人黑色素细胞HEM，待细胞生长至融合状态时，进行细胞冻存。按照细胞培养流程操作，冻存前，使用MTT法在490nm下测定各组细胞液OD前值。
分别取1.5mL置于冻存管中，密封，标记。对照组细胞先在4℃中冷却30min后，转移至-20℃冰箱中冷冻1h，然后置于-80℃冰箱中保存过夜，置于液氮中。实验组细胞使用电场冷冻辅助细胞冻存，场强分别为10、15、20kV/m，于4℃中冷却30min后，转移置于-10℃电冷冻设备中冷却30min；转移置于-20℃电冷冻设备中冷冻1h，然后置于-80℃冰箱中保存过夜后，置于液氮中。三天后，取出各组细胞进行复苏，用4％多聚甲醛固定10min，姬姆萨染色镜检观察其细胞形态差异。
实验组和对照组细胞复苏后按照细胞培养流程操作，培养4、24、48、72h，使用MTT法在490nm下测定各组细胞液冻存前后的OD值。计算各组复苏后的细胞活力，细胞活力＝OD冻存前/OD冻存后×100％；根据OD值，对电场干扰后的细胞生长情况进行考察。
实验结果
图5(a)显示未施加静电场干扰，细胞形态细长，分支多，贴壁效果差，存在空泡。图5(b)显示10kV/m场强干扰的细胞，细胞形态及贴壁效果有所改善，仍存在分支和部分空泡；图5(c)显示15kV/m场强干扰的细胞，生长状态良好，轮廓清晰，形态良好，贴壁效果明显，无空泡；图5(d)显示20kV/m场强干扰的细胞与15kV/m组效果一致，细胞形态、轮廓、贴壁效果相似，但细胞数量减少。实验结果表明冻存过程中，冰晶会使细胞损伤或死亡，出现分叉或空泡现场，而静电场辅助冷冻可减少冰晶对细胞的损伤，其中15kV/m静电场冻存效果最佳。
图6显示静电场辅助冻存的细胞，复苏后培养4h的细胞活力。未施加静电场干扰的对照组，细胞活力为89.3％；静电场干扰的实验组细胞活力分别为91.2％、93.4％、92.6％，细胞活力较对照组明显提高。图7显示静电场辅助冻存的细胞进行培养传代的细胞活力。不同强度静电场干扰的实验组细胞活力与未施加静电场干扰的对照组相比，培养24、48、72h后的细胞活力较对照组有明显提高。实验结果表明冻存过程中，冰晶会使细胞损伤或死亡，使细胞活力降低。静电场辅助冷冻可减少冰晶对细胞的损伤，提高细胞活力，15kV/m静电场冻存的细胞活力最高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种细胞存储器，其特征在于，包括细胞存储单元(7)、外壳(9)和电场输出单元(6)；所述细胞存储单元(7)和所述电场输出单元(6)设置在所述外壳(9)内；所述电场输出单元(6)包括电极片(8)，该电极片(8)设置在细胞存储单元(7)外侧；在所述细胞存储单元(7)和所述电场输出单元(6)之间设置有绝缘的介质(11)进行防护；在细胞存储期间，所述电场输出单元(6)对所述细胞存储单元(7)中的保存对象施加静电场干扰，场强范围在5-40kV/m。
2.根据权利1要求所述的细胞存储器，其特征在于，所述介质(11)是在所述电极片(8)上涂布的高介电常数的介质涂层(10)，或在所述电极片(8)周围填充的高介电常数的介质(11)。
3.根据权利2要求所述的细胞存储器，其特征在于，包括多个所述细胞存储单元(7)，每个细胞存储单元(7)之间由所述电极片(8)间隔。
4.一种细胞存储装置，包括电场发生器、细胞存储器和显示控制器，其特征在于，所述电场发生器包括中央控制单元(1)、电源管理单元(2)、信号发生单元(3)和信号处理与放大单元(5)，所述细胞存储器包括电场输出单元(6)和细胞存储单元(7)，所述显示控制器由人机交互单元(4)控制；所述人机交互单元(4)接收用户指令并显示来自所述装置的反馈，并将接收用户指令传递到中央控制单元(1)进行处理，中央控制单元(1)控制信号发生单元(3)和信号处理与放大单元(5)产生激励电场发生高压直流信号，通过电场输出单元(6)将高压直流信号施加到细胞存储单元(7)；在细胞存储期间，所述电场输出单元(6)对所述细胞存储单元(7)中的保存对象施加静电场干扰，场强范围在5-40kV/m。
5.根据权利要求4所述的细胞存储装置，其特征在于，所述电场发生器还包括外壳(9)以及外接电路或电池；所述电场发生器一端接入100-240V、50-60Hz的外接电路或接入电池，另一端则将发生的高压直流电输出至所述细胞存储器以产生静电场。
6.根据权利要求4所述的细胞存储装置，其特征在于，所述人机交互单元(4)由电源管理单元(2)进行供电，并且所述人机交互单元(4)包括触摸式显示屏、显示屏配合控制按键、或手机应用。
7.一种采用权利要求1-3中任何一项所述的细胞存储器或权利要求4-6中任何一项所述的细胞存储装置保存细胞的细胞存储方法，其特征在于，在细胞存储期间，在降温或恒温过程中对保存的细胞施加静电场干扰，场强范围在5-40kV/m。
8.根据权利要求7所述的细胞存储方法，其特征在于，所述场强范围在12-18kV/m。
9.根据权利要求8所述的细胞存储方法，其特征在于，所述场强在15kV/m。
10.根据权利要求7-9中任何一项所述的细胞存储方法，其特征在于，静电场干扰时的温度范围在10-80℃。
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