CN101093119A - 一种电磁控制低温保存技术 - Google Patents

Abstract

一种低温保存技术，包括冷冻保存技术，其特征在于在冷冻过程中对冷冻或保存对象施加交变电场或磁场的干扰，该交变电场或磁场可以在较慢冷冻速度下防止纯水冰晶形成和盐偏析，减小细胞组织在降温和复温过程中的破坏，提高各类生物材料低温保存时的细胞存活率。该低温(冷冻)保存技术可广泛应用于医学中的生物细胞和生物组织的低温或冷冻保存，也可以应用于肉类、蔬菜水果等的食品保鲜。

Description

一种电磁控制低温保存技术

技术领域

本发明涉及一种低温保存技术，特指一种电磁控制低温保存技术，适用于各类生物材料，包括生物体、生物组织，生物细胞，以及所有的动植物和食品类的低温保存，特别是冷冻保存中。

背景技术

低温保存是生物材料最常见的长期保存方法，广泛地应用于医疗和食品行业，但在降温和复温的过程中细胞却很容易产生低温损伤甚至死亡。低温损伤主要同细胞内纯水冰晶的形成造成的细胞膜的损伤和细胞脱水，局部盐浓度过高造成的化学损伤有关，因此，如何防止纯水冰晶形成和盐质的偏析，一直是生物材料包括食品低温保存技术的重要研究课题之一。

目前，世界上通用的低温保存的方法有两种：一是通过添加各种低温保护剂来抑制细胞内冰晶的形成；还有一种低温保存的方法是通过极高的冷却速率(一般在10²K/s～10³K/s)，对细胞或组织进行快速冷冻，使细胞内不能形成冰晶，而成为一种玻璃态。实践证明了上述两种方法的可行性，但同时存在一定的缺点。前者引入了杂质，经常会带来化学污染和中毒等问题。而后者由于需要很高的冷却速度，不仅在技术上要求高，而且对于较大型生物材料，例如食品、生物组织等，由于导热问题，内部降温速度远远低于外部，仅能在材料表层得到较好的效果，因此限制了它们的应用范围以及冷冻物的大小。

发明内容

本发明的目的是克服现有低温保存方法的缺点，提供一种电磁控制低温保存技术，实现生物体的低温无损保存。本发明从介电理论出发，根据电磁场对溶液中极性水分子以及盐离子的介电微扰作用，在较慢速冷冻过程中对冷冻对象施加电场或磁场干扰，抑制了生物材料中纯水冰晶的形成和盐质的偏析，促进了非晶冰和含盐冰的生成。从电介质物理理论中我们知道，介质，尤其实极性介质在电场的作用下有极化和损耗现象发生。细胞内形成纯水冰晶并导致细胞死亡的生物溶液就是一种介质，因此电场或磁场会对作用于生物溶液中的水分子和各类离子，使其产生转动或移动等微小动作，从而影响溶液中冰核的形成以及冰晶的成长，这种效果在某种特定的电/磁场频率范围以及强度、波形等电磁参数的条件下，会达到最高值。因此，本发明可在慢速冷冻过程中对冷冻对象施加电场或磁场干扰，从而得到和快速冷冻以及添加抗凝剂时同样的效果。

本发明的特征是：电场和磁场干扰主要在降温和复温过程中施加，特别是在低温损伤较易发生的近冰点附近。一般来说，低温损伤主要发生在0℃到-60℃这段温度范围内，被称为危险温度区，因此电场和磁场干扰一般至少从零上数度开始施加，直到达到所需的温度，即降温过程完成为止。反之，在复温过程中也可同样施加电场或磁场干扰。

本发明的特征还在于：发明中的电场和磁场是交变场，发明中的电磁场可由交变电场或交变磁场或直接的电磁辐射产生。电场可由直接接触保存对象的电极产生，也可以采用非接触式的空间电场形式来施加。交变电场和磁场都可以在保存对象内部形成空间电磁场从而呈现防止纯水冰晶生成的效果。交变电场和磁场的频率及强度根据保存或冷冻对象的不同而分别设定。频率从数千赫兹到数兆赫兹范围均可，数万到数十万赫兹较为常用。本发明中的电磁场电压较低，频率远低于微波段，对生物体无危害。

本发明的效果已经过实验初步证实。通过低温显微观察、相变过程温度跟踪、低温介电频谱测量等三种检测方式，分别从直观图像，热力学分析以及介电特性等三方面对有无电磁场作用下的生物溶液中冰晶形成状态进行了检测，得到了可相互验证的一致结论，结果表明交变电场和磁场都对含盐溶液的冷冻相变过程具有干扰作用，导致了冰晶晶粒尺寸的减小，抑制纯水冰晶形成，减少了盐质的偏析。这种电磁场效果同电场或磁场频率密切相关。理论分析表明，这种电磁效果和交变电场或感应电场作用下生物溶液中离子迁移产生的离子扰动，以及水分子在交变电场或感应电场作用下的极化有紧密联系。

本发明的优点在于：

(1)从生物材料内部产生效果的冷冻方式，因此冷冻对象的体积不受限制，而且在冷冻过程中的降温速度不要求太高。具体参数根据冷冻对象的不同而设定。例如对食品保鲜来说，普通的冰柜就能满足降温速度的要求。

(2)本发明既不需要添加低温保护剂，也不要求过高的降温速度，能够弥补目前主要低温保存方法的不足之处，配合一定的降温速度，可以同超快速冷冻以及添加低温保护剂有同样的效果，大幅度提高人体组织器官等的保存时间，在器官移植，细胞存贮，生物活体样品保存等医学、生物学领域，以及食品保鲜领域等方面具有深远的社会经济意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1实验用鸡血红细胞溶液容器及电极系统。

图2a冷冻前正常鸡血红细胞显微照片，显微镜放大倍数(10×100)

图2b 50kHz电场干扰冷冻复温后的细胞图片(10×100)

图2c加入低温保护剂冷冻复温后的显微图片(10×100)

图2d没有进过任何处理的鸡血红细胞冷冻复温后显微图片(10×100)

1、2：载玻片；3：铜片电极；4：冷冻用鸡血红细胞溶液。

具体实施方式

(1)实施例1

鸡血红细胞的冷冻低温保存

实验材料：新鲜鸡血

鸡血红细胞提取：新鲜鸡血中加入适量抗凝素(EDTA二钠)，离心机离心处理15min(3000转/min)，提取红细胞。将红细胞用0.9％NaCl溶液稀释，二次放入离心机离心处理20min(4000转/min)，提取红细胞，待用。

实验方法：

将鸡血红细胞用0.9％NaCl溶液稀释，放入可导入交变电场的容器中(如图1所示)，施加交变电场干扰的同时放入-30℃冰柜中冷冻20分钟，冷冻期间电场干扰一直施加。然后取出冷冻细胞，在室温下自然解冻。解冻后制片观察。冷冻速度为0.26℃/min。施加电场为正旋交变电场，电场干扰由型号为TFG2001B型数字合成信号发生器提供，电压峰峰值Vpp＝1.0V，频率设定为50kHz。

图1所示，实验用电极系统为平行式电极，由两层载玻片和一层铜板电极组成，铜板电极放置在两层载玻片之间，两电极之间相距10mm，鸡血红细胞溶液放置在双层载玻片之间，两层载玻片之间由于铜板电极的存在而具有一定的间距，鸡血红细胞溶液在其间形成一层大约1mm厚的溶液膜，电极同溶液直接接触。由信号发生器产生的正弦波信号通过铜板电极作用在鸡血红细胞溶液上。

实验结果：

图2a显示了了冷冻前正常鸡血红细胞显微照片，显微镜放大倍数(10×100)。图2b显示了经过50kHz电场干扰冷冻后的鸡血红细胞显微照片；图2c显示了在同样的冷冻条件下不施加交变电场干扰，而在鸡血红细胞用0.9％NaCl溶液稀释中加入适量低温保护剂(甘油，质量分数40％)，冷冻复温后的鸡血红细胞显微照片；图2d显示了没有使用低温保护剂也没有施加电场干扰的鸡血红细胞在同样冷冻复温条件下复温后显微图片。显微镜放大倍数都是10×100倍。

从图2a可以清楚的看到活的鸡血细胞呈椭球形，可以清楚的分辨出细胞膜及细胞质包裹的细胞核。而死亡的鸡血细胞细胞膜破裂，失去了椭球形态，只能够观察到细胞核。

实验结果显示，通常情况下没有使用低温保护剂也没有施加电场干扰的鸡血红细胞经过冷冻后，细胞膜全部溶解，显微观察只能看到残留在溶液中的细胞核，细胞全部死亡(图2d)。加入低温保护剂冷冻后，大部分细胞膜溶解，有一部分细胞膜没有破裂，细胞还能保持原有的细胞形态，细胞部分存活(图2c)。冷冻过程中经过交变电场干扰处理，在干扰电场频率为50kHz，细胞膜同加入低温保护剂时的情况有相似，部分细胞仍然保持原有的细胞形态，部分细胞存活(图2b)。实验结果表明，细胞在冷冻过程中对其施加频率为50kHz的电场干扰处理，有益于细胞的低温保存。

Claims (3)

1.一种生物材料低温保存技术，其特征是在降温和复温过程中对保存对象施加电磁场干扰，电磁场频谱范围从1kHz～1000kHz。

2.根据权利要求1所述的一种生物材料低温保存技术，其特征是电磁场由交变电场或交变磁场或直接的电磁辐射产生。

3.根据权利要求1所述的一种生物材料低温保存技术，其特征是施加电磁场干扰的温度在低温损伤较易发生的近冰点，即0℃到-60℃。

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