CN105331536A - 一种用于显微观察的细胞培养装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于显微观察的细胞培养装置，包括培养箱，所述培养箱顶部设有盖体，所述盖体以及所述培养箱的底板均由透明材料制成，所述盖体和底板的内侧面分别设有第一导电层和第二导电层，所述第一导电层和第二导电层连接电源的电极，通电后第一导电层与第二导电层之间的空间形成电场；所述培养箱的箱体上还设有培养液进、出口。本发明通过平行设置一对导电层产生静电场，利用倒置显微镜实时原位观察暴露于强静电场中细胞的生物学过程，最大限度降低干扰因素，有利于在细胞水平上客观评价静电场生物效应。

Description

一种用于显微观察的细胞培养装置

技术领域

本发明涉及电场生物效应研究领域，具体涉及一种用于显微观察的细胞培养装置。

背景技术

随着特高压直流输电工程的建设和居民对自身所处环境要求的不断提高，特高压直流输电线产生的电磁场及其健康效应备受公众关注，关于特高压直流输电技术的相关标准制定也日益迫切。与交流输电线传输交变电流产生时变电磁场不同，直流输电线传输稳恒电流产生的是0Hz非时变电场(静电场)。

目前针对交流输变电设施产生的时变电磁场和直流输变电设施产生的静磁场生物效应，国内外已有大量研究，并在此基础上制定了相应的暴露限值。在直流输电电场方面，国内外对其生物效应均没有较为系统的研究，国际上尚未给出频率为0Hz非时变电场(静电场)暴露限值，国内也仅有一行业标准《±800kV特高压直流线路电磁环境参数限值》(DL/T1088-2008)作为我国直流输电工程电磁环境评价暂行标准。对电磁场生物效应进行客观准确的评价是制定环境电磁暴露标准的前提，因此对于电磁场生物效应的阐明显得尤为重要。

电磁场生物效应研究主要有流行病学调查、人体、动物、细胞、生物物理等层次的研究。电磁场生物效应最早是从流行病调查中发现。理论上流行病学调查研究揭示环境电磁场暴露健康危害性的最直接证据，但由于受到诸多因素的限制，其结果多有争议。动物水平研究是证实电磁场暴露与疾病发生关系最强有力的实验证据，但动物本身存在个体差异，对电磁场的反应敏感性不同，研究结果的重复性相对较差。体外研究(细胞或分子等)的实验条件可以严格控制，保证了实验的重复性，便于从多角度探索电磁场的生物效应，虽然不能作为独立在体证据，但还可以回到动物或人群实验中进行验证，并对已有的流行病学调查结果做出解释。此外由于细胞是生物体结构和功能的基本单元，电磁场的生物效应将首先作用于细胞，改变细胞的生物学过程和行为，因此利用体外实验研究电磁场生物效应及其作用机制显得尤为必要。

目前，电场效应的细胞实验方法主要是基于电场暴露后的观察结果的组间对照，但该方法仍很难确认电场所引起的细胞效应，尤其是很难排除电场以外的其他外源性干扰因素，如细胞样品从培养箱移出瞬间遭受室温与培养箱之间温差所致的应激反应。文献检索表明，到目前为止，未见有原位在线观测强静电场暴露下细胞反应的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于显微观察的细胞培养装置，实现在强静电场暴露期间实时原位观察细胞，最大限度地降低干扰因素，对认识无扰或低扰状态下的静电场生物效应特性具有重要意义。

一种用于显微观察的细胞培养装置，包括培养箱，所述培养箱顶部设有盖体，所述盖体以及所述培养箱的底板均由透明材料制成，所述盖体和底板的内侧面分别设有第一导电层和第二导电层，所述第一导电层和第二导电层连接电源的电极，通电后第一导电层与第二导电层之间的空间形成电场；所述培养箱的箱体上还设有培养液进、出口。

本装置通过设置第一导电层和第二导电层形成一个类似平行板电容器的结构，利用特高压直流电源施加在两导电层上的高电压，使导电层之间形成一个强静电场。实时观察处于强静电场中细胞的生物学过程和行为，以此研究电场生物效应及其作用机制。

所述特高压直流电源由电源控制器控制，控制直流电源输出电压大小和转换正负输出极性，从而改变电场强度和方向，此外还可以控制电场暴露的时间，满足不同实验所需。

将培养箱放置于倒置显微镜的载物台上，照明系统的光线应该能够穿过培养箱的顶面和底面，才可观察到培养箱内的活细胞，因此培养箱的盖体和底板均为透明的材料制成。

作为优选，所述培养箱的盖体和底板为生物相容性良好的透明绝缘基层，避免因导电层的通电引起对人体的伤害。更为优选的，透明材料为玻璃、石英或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

作为优选，所述的第一导电层和第二导电层为生物相容性好的透明导电材料，如石墨烯、ITO透明导电玻璃。由于ITO透明导电玻璃制备费用高且导电透光性能不如石墨烯，石墨烯的导电性绝佳，可以作为平行板电容器的导电极板；透光率高，有利于显微镜通过石墨烯导电极板观察细胞；导热性能优良，有利于维持细胞培养的温度；生物相容性好，且有抑菌效应，有利于细胞生长。石墨烯作为导电层厚度适宜，不影响细胞观察，因此，更为优选的，采用石墨烯。

第一导电层和第二导电层之间形成空腔，空腔内设有细胞培养区，利用箱体上的培养液进口泵进新鲜的培养液，出口排出培养液，实现培养液的更新，使培养箱内的细胞处于稳定的静电场环境中，最大限度减少了干扰因素。

细胞体外培养一般需要37℃±0.5℃的恒温条件，作为优选，所述培养箱下方具有用于承载加热的透明的加热板。另一种优选的方案，所述培养箱的外部底面设有透明的加热膜。更为优选，为了便于显微镜通过载物台透光孔观察细胞，所述加热板或加热膜设置在培养箱底面的两端，避免遮挡住载物台透光孔。

作为优选，所述培养箱内设有温度传感器，培养箱外具有温度控制器，温度控制器接收温度传感器的信号，进而控制加热板或加热膜工作。

细胞培养需要适宜的pH环境，控制培养箱内二氧化碳浓度达到适宜的pH值，为了维持稳定的pH值，培养箱内的二氧化碳浓度维持了2～10％之间。作为优选，所述培养箱的箱体上设有二氧化碳进、出口，二氧化碳进口连接气源。

二氧化碳进口与二氧化碳气体罐相连，进气量由二氧化碳浓度控制器控制。作为优选，所述培养箱内设有pH监测机构，培养箱外具有二氧化碳浓度控制器，二氧化碳浓度控制器接收pH监测机构的监测信号，进而控制气源供气。

作为优选，培养液进口、培养液出口设于培养箱相对的两侧。培养液从进口泵入培养箱，经过整个底面再由出口排出，保证培养液的充分利用。

本装置利用恒流泵控制培养液的进液和出液，因为恒流泵输送液体流量稳定，保证灌注的稳定性，减少培养液流动带来的扰动，控制恒流泵运转速率达到进出液平衡，使培养箱内各处培养液的高度稳定。严格控制培养液液面高度防止培养液充满两导电层之间的空腔，否则将导致两导电层间短路，进一步导致通电电流流过细胞，达不到本发明对活细胞进行强静电场暴露的目的。

为了使第一导电层和第二导电层之间形成强静电场，两导电层之间间距在不接触培养液的前提下应该尽可能的小。处于两导电层之间的培养液的高度应控制在1.5～2倍细胞直径与培养箱底板内壁的粗糙度之和，一般要求粗糙度为＜0.1mm。

作为优选，所述底板的内面上设有隔板，隔板将底板上方的空间分为进料缓冲区、培养区和出料缓冲区三部分，培养区位于中间位置，进料缓冲区和出料缓冲区分别靠近培养液进口和培养液出口。

所述隔板的高度略大于培养液高度，隔板可以防止培养区内的细胞游离到培养箱的两端，保证细胞位于中间位置利于显微观察。

更为优选，所述进料缓冲区和出料缓冲区均设有两块隔板，隔板上具有供培养液通过的缺口，相邻隔板之间的缺口相错开。隔板分布数量与间距适宜，隔板上缺口的尺寸与数量适宜，缺口相互错位的设置引导培养液缓慢流过细胞培养区，减少培养液流动带来的扰动影响。

作为优选，所述盖体与培养箱的开口之间设有密封圈。盖体通过密封圈与培养箱箱体扣合形成密封腔室，使培养箱内细胞处于相对封闭稳定的静电场环境中，有利于客观评价静电场生物效应。

作为优选，所述培养箱底板内侧面的第二导电层通过与接地导线相连接地。防止意外情况下培养箱通电时强电流通过人体，以保证人体安全。

作为优选，所述培养箱体相对的两侧面外壁设置导电层，通过在两导电层上施加直流高压电，在水平方向产生一个强静电场。

本装置还可以在倒置显微镜上配置相差显微镜头等附件进行应用扩展，也可以通过配置二向色镜、荧光光源等相应的元件实现荧光观察，显微摄像头与显微镜目镜连接以记录活细胞生物学过程与行为。

本发明具备的有益效果：(1)本发明通过平行设置一对导电层产生静电场，利用倒置显微镜实时原位观察暴露于强静电场中细胞的生物学过程，最大限度降低干扰因素，有利于在细胞水平上客观评价静电场生物效应；(2)由于石墨烯导电性绝佳、透光率高、导电性能优良、生物相容性好、具有抑菌效果，而且作为导电层厚度适宜，因此利用石墨烯作为导电层。

附图说明

图1为本发明整体示意图。

图2为本发明中静电场发生模块局部剖视图。

图3为本发明中细胞培养箱箱体示意图。

图4为本发明中细胞培养箱底板示意图。

图5为本发明中细胞培养箱整体示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。

如图1、图2所示，本发明的一种用于显微观察的细胞培养装置，包括培养箱4，培养箱4为长方体结构，包括四个侧面和底板42组成的盒体和盖体41，培养箱4的盒体和盖体41通过密封圈7形成密封腔室。培养箱的底板42和盖体41为透明的PDMS。在盖体41和底板42的内侧面均设有第一导电层31和第二导电层32，第一导电层31和第二导电层32为石墨烯材料，分别连接特高压直流电源2。静电场发生的工作原理为：第一导电层31和第二导电层32形成一个类似平行板电容器的结构，当直流电源提供给第一导电层31电压U时，两导电层之间形成电场强度为E的静电场(E＝U/d，d为两导电层之间的间距)，参见图2。特高压直流电源2由电压控制器1控制，电压控制器1控制直流电源输出电压大小和转换正负输出极性，从而改变电场强度和方向，此外还控制电场暴露的时间。

第一导电层31和第二导电层32形成空腔，该空腔内设有细胞培养区域5，通过静电场发生对该区域内细胞进行强静电场暴露。空腔的高度在不接触培养液的情况下应尽可能的小。第二导电层32与接地导线相连接地(图中未标示)。

培养箱4置于倒置相差显微镜的载物台11上，光源14的光线通过聚光镜15的聚集，穿透培养箱透明区域，物镜12成像经反射镜13反射到显微镜目镜。CCD相机16通过C接口与显微镜目镜连接，CCD相机16与计算机17相连，操作人员可直接从计算机中观察到活细胞生物学行为。

底板42的内面上设有隔板6，如图3所示，隔板6将底板上方的空间分为进料缓冲区51、培养区52和出料缓冲区53三部分，培养区位于中间位置。进料缓冲区51和出料缓冲52区分别靠近培养液进口81和培养液出口82。如图4所示，进料缓冲区51和出料缓冲区53均设有两块隔板6，内侧隔板含有2个缺口61，外侧隔板具有4个缺口，相邻隔板之间的缺口相错开，确保培养液能够缓慢流过细胞培养区52，减少培养液流动带来的扰动影响。

如图5所示，培养液进口81和培养液出口82通过导管分别与储液罐83和废液罐86相通，培养液的进液和出液分别由进液恒流泵84和出液恒流泵85控制。控制进液恒流泵84和出液恒流泵85的运转速率达到进出液平衡，保证灌注的稳定性，减少培养液流动带来的扰动，同时控制培养液高度稳定在1.5倍细胞尺寸与底板42内壁粗糙度之和。

培养液进口81和培养液出口82的上方分别设有CO₂进气口91和CO₂出气口92，CO₂进气口91与CO₂气体罐95相连，由CO₂浓度控制器96控制，同时CO₂浓度控制器96与pH传感器94相连。pH传感器94监测培养液的酸碱度，信息反馈到CO₂浓度控制器96，根据参数设定CO₂浓度控制器96调节CO₂进气。在培养箱盖体41的一角设有pH监控孔93，pH传感器94设置于pH监控孔93处。

培养箱4的下方设有透明加热板101，置于显微镜载物台11上。如图5所示，加热板101由温控器102控制，温控器102与温度传感器103相连。温度传感器103监测培养箱内的温度，温度信息反馈到温控器102，根据参数设定温控器102控制加热板101加热。在培养箱盖体41的一角设有温度监控孔104，温度传感器103设置于温度监控孔104处。

本发明装置的操作流程为：细胞接种于培养箱4的培养区52内，盖好盖体41。将培养箱4载于倒置相差显微镜载物台11上，打开培养液进液恒流泵84、出液恒流泵85，加热板101加热。培养系统达到稳定，打开电压控制器1对第一导电层31和第二导电层32施加高电压，最后打开倒置相差显微镜对活细胞进行长时间实时观察记录。

本发明并不限于以上实施方式，凡在本发明精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于显微观察的细胞培养装置，包括培养箱，其特征在于，所述培养箱顶部设有盖体，所述盖体以及所述培养箱的底板均由透明材料制成，所述盖体和底板的内侧面分别设有第一导电层和第二导电层，所述第一导电层和第二导电层连接电源的电极，通电后第一导电层与第二导电层之间的空间形成电场；所述培养箱的箱体上还设有培养液进、出口。

2.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述培养箱下方具有用于承载加热的透明的加热板。

3.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述培养箱的外部底面设有透明的加热膜。

4.如权利要求2或3所述的细胞培养装置，其特征在于，所述培养箱内设有温度传感器，培养箱外具有温度控制器，温度控制器接收温度传感器的信号，进而控制加热板或加热膜工作。

5.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述培养箱的箱体上设有二氧化碳进、出口，二氧化碳进口连接气源。

6.如权利要求5所述的细胞培养装置，其特征在于，所述培养箱内设有pH监测机构，培养箱外具有二氧化碳浓度控制器，二氧化碳浓度控制器接收pH监测机构的监测信号，进而控制气源供气。

7.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，培养液进口、培养液出口设于培养箱相对的两侧。

8.如权利要求7所述的细胞培养装置，其特征在于，所述底板的内面上设有隔板，隔板将底板上方的空间分为进料缓冲区、培养区和出料缓冲区三部分，培养区位于中间位置，进料缓冲区和出料缓冲区分别靠近培养液进口和培养液出口。

9.如权利要求8所述的细胞培养装置，其特征在于，所述进料缓冲区和出料缓冲区均设有两块隔板，隔板上具有供培养液通过的缺口，相邻隔板之间的缺口相错开。

10.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述盖体与培养箱的开口之间设有密封圈。