CN110269885A - 金果榄提取物在制备抗耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了金果榄提取物在制备抗耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用。本发明利用感染了耐药鲍曼不动杆菌的线虫模型进行治疗研究，结果显示金果榄提取物对耐药鲍曼不动杆菌具有很好的体内杀菌作用，这为研发新型抗耐药鲍曼不动杆菌药物提供了良好的前期研究基础，为解决临床上耐药鲍曼不动杆菌感染无药可用的困境带来了曙光。利用金果榄的提取物对耐药鲍曼不动杆菌的进行防治，方法快速，价格便宜，操作便捷。

Description

金果榄提取物在制备抗耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及金果榄提取物在制备抗耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌是不动杆菌属中最常见的一种非发酵革兰氏阴性菌，属于条件致病菌，被世界卫生组织列为需要最优先解决的超级细菌。该菌在医院环境中可以长期存活，临床科室分布主要以ICU最多，其次为呼吸内科。老年患者、机体抵抗力弱及危重疾病的患者，以及使用各种侵入性操作和长期使用广谱抗生素治疗的患者是易感对象。鲍曼不动杆菌具有快速获得和传播耐药性的能力，耐药鲍曼不动杆菌呈现出世界性流行趋势，已成为我国院内感染最重要的病原菌之一。根据2018年的CHINET细菌耐药性监测网数据显示，我国35家教学医院鲍曼不动杆菌约占临床分离革兰阴性菌的14.7％，仅次于大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌。而在对临床常用抗生素耐药方面，鲍曼不动杆菌对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、β内酰胺类抗生素/β内酰胺酶抑制剂的复合制剂、氟喹诺酮类、氨基糖苷类的耐药率达到45.7-80.4％，只对替加环素和多粘菌素具有较低的耐药率。但多粘菌素具有较大的肾毒性而制约了其临床应用，而替加环素价格昂贵，且其分布代谢存在一些缺陷，亟待发展新型抗耐药鲍曼不动杆菌药物。

清热解毒中药在感染性疾病的治疗方面积累了丰富的经验。早在汉代《伤寒论》中就总结了许多行之有效的方剂，如泻心汤、葛根芩连汤、白头翁汤等。现在有不少学者认为《伤寒论》作为经典著作实际就是一部感染性疾病的专著，清代《瘟疫论》、《温病条辨》等著作的出现，使得感染性疾病的治疗经验得到了更进一步的丰富，为深入研究中医药抗感染治疗提供了宝贵资源。目前国内外学者对中草药抗菌作用研究已做了大量工作，实验和临床研究都取得一定成绩。然而，这些研究多为体外抗菌活性研究，对高毒性、药代动力学性质差和体内外相关性差的化合物缺乏有效剔除方法，因此一直未能获得可靠的研究结果。

另外，金果榄，中药名。防己科植物青牛胆或金果榄的干燥块根。秋、冬二季采挖，除去须根，洗净，晒干。性味苦寒，有清热解毒，利咽，止痛之功效。用于咽喉肿痛，痈疽疔毒，泄泻，痢疾，脘腹疼痛。金果榄对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和变形杆菌有很强的抑制作用(金果榄在兽医临床上的应用研究，2009，李福杏)。而其对耐药菌的作用，尤其是耐药鲍曼不动杆菌，尚未有相关的报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术中尚未发现针对耐药菌的有效的中药提取物的不足，研究发现一种新的抗耐药鲍曼不动杆菌药物，即金果榄提取物。

本发明的第一个目的是提供金果榄在制备抗耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供金果榄提取物在制备抗耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

发明人建立了耐药鲍曼不动杆菌-秀丽隐杆线虫感染模型，利用其进行体内活性检测，研究金果榄提取物的抗耐药鲍曼不动杆菌的体内活性。结果显示金果榄提取物能显著提高秀丽隐杆线虫的成活率，说明其对抗耐药鲍曼不动杆菌具有很好的生物防治效果，利于金果榄解决超级细菌积累了良好的理论基础及实践经验。

因此，本发明要求保护金果榄在抗鲍曼不动杆菌或制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用。

本发明还要求保护金果榄提取物在抗鲍曼不动杆菌或制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用。

其中，所述鲍曼不动杆菌为耐药鲍曼不动杆菌。

所述抗鲍曼不动杆菌药物为体内抗鲍曼不动杆菌的药物。

所述耐药是指对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、β内酰胺类抗生素/β内酰胺酶抑制剂的复合制剂、氟喹诺酮类和/或氨基糖苷类药物具有耐药性。

另外，优选地，所述金果榄提取物为金果榄的水提取物。

更优选地，所述金果榄的水提取物的制备方法包括以下步骤：

S1.按照质量比1：5～20将金果榄与水混合，90～100℃加热回流提取1～2h，固液分离；

S2.按照质量比1：5～20将步骤S1得到的固体与水混合，90～100℃加热回流提取1～2h，固液分离；

S3.合并步骤S1得到的液体和步骤S2得到的液体，去除溶剂得到药物浸膏。

更优选地，步骤S1中，金果榄与水的质量比为1：12。

更优选地，步骤S1和S2中提取条件均为100℃提取1.5h。

更优选地，步骤S2中，固体与水的质量比为1：8。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了金果榄提取物在制备抗耐药鲍曼不动杆菌药物中的应用。本发明利用金果榄的提取物对感染了耐药鲍曼不动杆菌的线虫进行治疗，显示金果榄的提取物对耐药鲍曼不动杆菌具有很好的杀菌作用，这为研发新型抗耐药鲍曼不动杆菌药物提供了良好的前期研究基础，为解决临床上耐药鲍曼不动杆菌感染无药可用的困境带来了曙光。利用金果榄的提取物对耐药鲍曼不动杆菌的进行防治，方法快速，价格便宜，操作便捷。

具体实施方式

下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1金果榄提取物的制备及其抑菌活性的检测

一、实验方法

1、金果榄提取物的制备

称取三份金果榄，每份2g，分别置于3个100mL圆底烧瓶中，按1:12的物料比，分别加入水、50％乙醇、95％乙醇三种不同的溶剂24mL；三个不同提取液的烧瓶分别设置不同的提取温度为100℃、90℃、85℃，加热回流提取1.5h后将药液过滤；再次按1:8的物料比分别加入相应提取液，分别100℃、90℃、85℃提取1.5h，过滤并合并全部药液，减压蒸发掉全部溶剂得到药物浸膏，称重并置于1.5mL离心管中，-20℃冰箱中放置待用。制备得到三种金果榄的提取物(金果榄的水提取物、金果榄的50％乙醇提取物、金果榄的95％乙醇提取物)。

2、耐药鲍曼不动杆菌-秀丽隐杆线虫感染模型

使用含10μmol铁离子的20％脑心浸液(BHI)液体培养基将同步化的线虫从线虫生长培养基上冲洗至15mL离心管中，800rpm转速离心1min，弃去上清液，加培养基至2mL左右，置于温度为25℃，湿度为85％的恒温箱中备用；将20％BHI倒入3mL比浊管内，从Luria-Bertan(LB)琼脂平板上用无菌棉棒挑取耐药鲍曼不动杆菌单个菌落，在比浊管内充分混匀，使用比浊仪调整菌浓度至0.5麦氏单位(约为1×10⁸CFU/mL)，再用移液枪吸出250μL至新的5mL离心管中，加入20％BHI液体培养基2250μL，将菌液稀释10倍至1×10⁷CFU/mL；用1000μL的移液枪吸取2mL稀释后的菌液加入到线虫管中，使耐药鲍曼不动杆菌的终浓度为5×10⁶CFU/mL，之后放入温度为25℃，湿度为85％的恒温恒湿培养箱中培养；共孵育感染6h后，用M9液体培养基清洗至少3次，吸取溶液180μL分配到96孔板中，每孔15～20条为宜。制备得到耐药鲍曼不动杆菌-秀丽隐杆线虫感染模型。

3、金果榄提取物体内抗菌活性检测

利用上一步制备得到的耐药鲍曼不动杆菌-秀丽隐杆线虫感染模型进行金果榄提取物体内抗菌活性检测。

以20μg/mL的多粘菌素B作为阳性对照组，以10％的DMSO作为阴性对照组，以不同浓度(10000μg/mL、1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL)的金果榄(水、50％乙醇、95％乙醇)提取物作为实验组，每组设3组平行对照。

不同浓度的金果榄提取物配制方法：称取10mg的提取物到1.5mL离心管中，加入100μL的DMSO，再加入900μL的BHI培养基充分混合溶解提取物，然后依次吸出100μL并加入900μL BHI培养基系列稀释5次，得到分别为10000μg/mL、1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL的提取液。

将20μL金果榄提取物分别加入对应孔中，使金果榄提取物以1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL梯度的终浓度提取物进行干预；25℃的恒温箱中孵育36h后，通过线虫的存活率判断不同浓度的中药提取物对感染线虫的治疗效果。以阴性对照和阳性对照作为对照。

二、实验结果见表1。

表1：

结果显示，金果榄提取物，包括水提物和醇提物，均有较明显的抗耐药鲍曼不动杆菌作用，其中，金果榄的水提取物相对于乙醇提取物具有更好的生物防治线虫的效果，感染线虫的生存率可达到10％以上。

对照例1连翘提取物的制备及其抑菌活性的检测

一、实验方法

以本领域已经验证过的体外抗耐药鲍曼不动杆菌活性较好的连翘提取物为对照，按照实施例的1的方法进行连翘提取物的制备及其体内抑菌活性的检测。

二、实验结果见表2。

表2：

结果显示，连翘提取物对感染线虫的生存率影响很小，无体内抗耐药鲍曼不动杆菌作用。

Claims (10)

1.金果榄在抗鲍曼不动杆菌或制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用。

2.金果榄提取物在抗鲍曼不动杆菌或制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述抗鲍曼不动杆菌药物为体内抗鲍曼不动杆菌的药物。

4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌为耐药鲍曼不动杆菌。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述耐药是指对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、β内酰胺类抗生素/β内酰胺酶抑制剂的复合制剂、氟喹诺酮类和/或氨基糖苷类药物具有耐药性。

6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述金果榄提取物为金果榄的水提取物。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述金果榄提取物的制备方法包括以下步骤：

S1.按照质量比1：5～20将金果榄与水混合，90～100℃加热回流提取1～2h，固液分离；

S2.按照质量比1：5～20将步骤S1得到的固体与水混合，90～100℃加热回流提取1～2h，固液分离；

S3.合并步骤S1得到的液体和步骤S2得到的液体，去除溶剂得到药物浸膏。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，步骤S1中，金果榄与水的质量比为1：12。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，步骤S1和S2中提取条件均为100℃提取1.5h。

10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，步骤S2中，固体与水的质量比为1：8。