CN113842425A - 一种具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷及其制备方法和应用。主要包括提取、分离、纯化和抗菌活性研究。本发明中的重楼总皂苷提取物采用醇提法提取、浓缩和离心对重楼总皂苷进行粗提，进一步通过大孔树脂对重楼总皂苷进行富集纯化，制备工艺简单，重楼总皂苷含量高，生产成本低，适合大规模制备。本发明还提供了重楼总皂苷的在抗大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌和多重耐药铜绿假单胞中的应用。

Description

一种具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷提取物及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷提取物及其制备方法和应用。
背景技术
重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，又名蚤休、草河车、白甘遂和金线重楼，主产于陕西、云南、广西、四川、贵州、湖北及甘肃等地。性微寒，有小毒，味苦，归肝经。重楼具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊的功效，主治疔疮痈肿、咽、喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛和惊风抽搐，是云南白药和宫血宁片等中成药的主要原料之一，具有较高的经济价值。
重楼的主要有效成分重楼皂苷为甾体皂苷，重楼皂苷类成分具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌消炎、止血、调节血管和抗氧化等作用。作为具有很高药用价值和经济价值的重楼，对其有效成分的提取变得尤为重要。
目前，重楼中重楼总皂苷的提取方法较多，但大多都采用乙醇溶液回流提取，分离纯化方法复杂，且收率较低。严重阻碍了重楼药材的利用率和重楼皂苷的规模化生产。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供本发明提供了一种具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷及其制备方法和应用，该方法制备工艺简单，重楼总皂苷含量高，生产成本低，适合大规模制备。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开的一种具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷的制备方法，包括以下步骤：
1)取重楼药材或饮片，粉碎后过筛，浸入乙醇溶液中过夜，回流提取2～3次，每次1～3小时，过滤，合并提取液；
2)将提取液浓缩至1/4体积，离心，得到上清液A和沉淀A，将沉淀A加入乙醇溶液中，搅拌混匀后离心，得到上清液B和沉淀B，将沉淀B洗涤、干燥；
3)将上清液A和上清液B合并，将合并后的上清液与干树脂按照1:5-1:10的质量比混合后装层析柱，采用5～10倍体积的水进行洗脱，弃去洗脱液，再用4～8倍量的80％～90％乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，对乙醇洗脱液浓缩，然后与步骤2)处理后的沉淀B合并、干燥，制得重楼总皂苷。
优选地，步骤1)中，所用乙醇溶液的浓度为60％～90％，所用乙醇溶液的用量为重楼药材或饮片质量的8～24倍。
优选地，步骤2)中，所用乙醇溶液的浓度为60％～80％，所用乙醇溶液的用量为沉淀A质量的4～10倍。
优选地，步骤3)中，所用干树脂选择AB-8、LX-T5、D101或LX-100B。
优选地，以质量百分比计，重楼总皂苷中含有0.12％-0.14％的重楼皂苷Ⅱ、0.06％-0.11％的重楼皂苷Ⅵ以及0.11％-0.15％重楼皂苷Ⅶ。
优选地，步骤3)中，上柱流速为1-3BV/h；大孔树脂水洗脱液的用量为大孔树脂装柱体积的5-10倍量。
本发明还公开了采用上述的制备方法制得的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷。
本发明还公开了上述的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷在制备抗菌药物中的应用。
优选地，所述抗菌药物包括抗大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞174的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的重楼总皂苷的制备方法，在采用乙醇提取基础上，采用新型树脂对重楼总皂苷进行分离纯化，重楼总皂苷的提取率高，且方法简单，适合大规模生产。
本发明对重楼皂苷抑制大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌和多重耐药铜绿假单胞菌的活性进行研究，为重楼的药用价值提供理论依据具有重要的意义。通过本发明方法提取的重楼总皂苷，对大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞菌174均具有抑制活性，尤其是对多重耐药金黄色葡萄球菌222和大肠杆菌，其最小抑菌浓度为128μg/mL。同时，重楼总皂苷与头孢曲松钠、盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液和硫酸庆大霉素的联合用药。实验结果显示，重楼总皂苷与头孢曲松钠联合用药，对抑制大肠杆菌具有协同作用；与盐酸左氧氟沙星联合用药，对抑制沙门氏菌具有相加作用，与庆大霉素联合用药，对抑制多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞菌174无协同效应。
附图说明
图1为本实施例5-8提取重楼总皂苷中重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的含量；其中，(a)为实施例5；(b)为实施例6；(c)为实施例7；(d)为实施例8；
图2为重楼总皂苷抗菌活性测试结果；其中，(a)为重楼总皂苷对大肠杆菌的抑制作用；(b)为重楼总皂苷对沙门氏菌的抑制作用；(c)为重楼总皂苷对多重耐药金黄色葡萄球菌222的抑制作用；(d)为重楼总皂苷对多重耐药铜绿假单胞菌174的抑制作用；
图3为重楼皂苷II抗菌活性测试结果；其中，(a)为重楼皂苷II对大肠杆菌的抑制作用；(b)为重楼皂苷II对沙门氏菌的抑制作用；(c)为重楼皂苷II对多重耐药金黄色葡萄球菌222的抑制作用；
图4为重楼皂苷VI抗菌活性测试结果；其中，(a)为重楼皂苷VI对大肠杆菌的抑制作用；(b)为重楼皂苷VI对沙门氏菌的抑制作用；
图5为重楼皂苷VII抗菌活性测试结果；其中，(a)为重楼皂苷VII对大肠杆菌的抑制作用；(b)重楼皂苷VII对沙门氏菌的抑制作用；(c)为重楼皂苷VII对多重耐药金黄色葡萄球菌222的抑制作用；(d)为重楼皂苷VII对多重耐药铜绿假单胞菌174的抑制作用；
图6为头孢曲松钠对大肠杆菌的抑制作用；
图7为盐酸左氧氟沙星对沙门氏菌的抑制作用；
图8为硫酸庆大霉素对多重耐药金黄色葡萄球菌222的抑制作用；
图9为硫酸庆大霉素对多重耐药铜绿假单胞菌174的抑制作用；
图10为重楼总皂苷与头孢曲松钠联合用药多大肠杆菌的抑制作用；
图11为重楼总皂苷与盐酸左氧氟沙星联合用药对沙门氏菌的抑制作用；
图12为重楼总皂苷与硫酸庆大霉素联合用药对多重耐药金黄色葡萄球菌222的抑制作用；
图13为重楼总皂苷与硫酸庆大霉素联合用药对多重耐药铜绿假单胞菌174的抑制作用。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
一、实施例
实施例1
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入8倍量的60％的乙醇，浸泡过夜，回流提取2次，每次提取2小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入4倍量的60％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(AB-8)的质量比1:10混合后装层析柱，上柱流速1BV/h，用5倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用4倍量的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷17.53g。
实施例2
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入16倍量的80％的乙醇，浸泡过夜，回流提取2次，首次提取3小时，二次提取2小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入7倍量的70％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(AB-8)的质量比1:7混合后装层析柱，上柱流速2BV/h，用7倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用6倍量的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷18.04g。
实施例3
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入24倍量的60％-95％的乙醇，浸泡过夜，回流提取2，次，每次提取2小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入10倍量的80％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(AB-8)的质量比1:10混合后装层析柱，上柱流速3BV/h，用10倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用8倍量的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷18.65g。
实施例4
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入8倍量的95％的乙醇，浸泡过夜，回流提取3，每次提取1小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入7倍量的80％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(AB-8)的质量比1:7混合后装层析柱，上柱流速1BV/h，用5倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用8倍量的95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷18.92g。
实施例5
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入8倍量的95％的乙醇，浸泡过夜，回流提取2次，首次提取3小时，二次提取2小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入7倍量的80％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(AB-8)的质量比1:5混合后装层析柱，上柱流速2BV/h，用5倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用8倍量的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷19.83g。
实施例6
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入16倍量的95％的乙醇，浸泡过夜，回流提取2次，首次提取3小时，二次提取2小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入7倍量的80％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(LX-T5)的质量比1:5混合后装层析柱，上柱流速2BV/h，用5倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用8倍量的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷18.21g。
实施例7
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入8倍量的95％的乙醇，浸泡过夜，回流提取2次，首次提取3小时，二次提取2小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入7倍量的80％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(D101)的质量比1:5混合后装层析柱，上柱流速2BV/h，用5倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用8倍量的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷17.37g。
实施例8
取一定量的重楼药材或饮片1kg，加入24倍量的95％的乙醇，浸泡过夜，回流提取2次，首次提取3小时，二次提取2小时，过滤，合并提取液，并浓缩至1/4体积，离心，得上清液1和沉淀1，沉淀1加入7倍量的80％乙醇溶液，搅拌，离心，得清液2和沉淀2，沉淀2用依次用100mL水和石油醚洗涤，干燥，合并上清液1和上清液2。合并后的上清液与干树脂(LX-100B)的质量比1:5混合后装层析柱，上柱流速2BV/h，用5倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，用8倍量的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，与沉淀2合并，干燥，得重楼总皂苷18.51g。
二、含量测定
取实施例5-8提取得到的重楼总皂苷作为供试品，高效液相法检测提取总皂苷中重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的含量。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm。进样量10μL，柱温30℃。
表1重楼总皂苷含量测定梯度洗脱程序表
Figure BDA0003317650790000081
实施例5-8提取重楼总皂苷中重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的含量参见表2和图1所示。
表2重楼总皂苷中重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的含量
Figure BDA0003317650790000082
取实施例1提取得到的重楼总皂苷1g作为供试品，经制备液相(汉邦科技实验室级制备液相色谱系统NS4210)分离重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ。液相条件：色谱柱为Hedera ODS-2(250mm*20mm，10μm)，流动相为甲醇-水(1-30min，甲醇40％-70％，30-50min，70％-40％)，流速为6mL/min，制备得到重楼皂苷Ⅱ(275.32μg)、重楼皂苷Ⅵ(61.17μg)和重楼皂苷Ⅶ(148.85μg)。
三、重楼皂苷抗多药耐药菌活性评价
1、最小抑菌浓度法测定重楼总皂苷的抗菌活性
1.1实验方法
用液体微量二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度(MIC)。
(1)实验器材的消毒
实验前将试验过程中所用的所有相关器材(培养皿、试管、移液管、新制备的培养液等)在121℃灭菌锅内高压灭菌15min。在实验开始前对微生物实验台及96孔板进行紫外线照射消毒，并用75％酒精对净化工作台进行搽拭。
(2)配置肉汤培养基
称取18g肉汤干粉置于锥形瓶中，加入1000ml纯净水，放于恒温水浴锅加热溶解，121℃下高压灭菌20min。
(3)菌悬液的制备
实验前24h，取出低温保存的受试菌株，并放置至室温。用移液枪从中分别吸取少量菌液，接种于灭菌冷却后的肉汤培养基中，置于35℃恒温箱中培养24h。用移液枪吸取少量活化细菌菌落转移至已灭菌的干燥试管中，用培养基稀释，稀释至和0.5麦氏比浊管(1.5×108CFU/mL)浊度相近，再用培养基稀释100倍，使得细菌菌悬液浓度至1.0×106CFU/mL(加到孔里会被二倍稀释，最终体系中菌液浓度为5×105CFU/mL)，供测MIC。
(4)微量二倍稀释法测最小抑菌浓度MIC
取无菌96孔平底微量培养板，于每排1号孔加配好的128Aμg/mL的阳性对照药液100μL作阳性对照；3～12号孔各加100μL的DMSO(浓度不超过1％)水溶液；2号孔和3号孔加配好的128Aμg/mL的待测药液浓度100μL。用移液枪混匀3号孔的DMSO和待测药液后，吸取100μL至第4个孔，以此类推倍比稀释到11号孔，混匀后弃掉100μL，使稀释后各孔中的受试药液浓度倍比减少。然后于1-12号孔加100μL配置好的浓度为1.0×106CFU/mL的新鲜菌悬液。最终1号孔为100μL阳性对照药，2-11号孔为100μL的浓度分别为128Aμg/mL、64Aμg/mL、32Aμg/mL、16Aμg/mL、8Aμg/mL、4Aμg/mL、2Aμg/mL、1Aμg/mL、0.5Aμg/mL和0.25Aμg/mL，第12号孔为100μL的溶剂对照。
培养观察：在30℃恒温箱中，培养24h，观察实验结果，并确定其最低抑菌浓度(MIC)值。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度256μg/ml时，计为“>256μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.5μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
1.2重楼总皂苷抗多药耐药菌活性结果
在本次试验中，受试药物用所提取并经纯化后的重楼总皂苷。受试菌株为大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞菌174。以对应菌株的阳性药头孢曲松钠、盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液、头孢唑林钠和硫酸庆大霉素，进行了体外抗菌活性实验，得到了重楼总皂苷对各菌的MIC值。根据96孔板内有无长菌确定其最小抑菌浓度。
受试菌株对应阳性药及浓度如表3所示，重楼总皂苷体外抗菌活性结果如表4所示，重楼总皂苷抗菌活性测试结果如图2所示，重楼总皂苷MIC如图5所示。
表3受试菌株对应阳性药及浓度
Figure BDA0003317650790000101
Figure BDA0003317650790000111
表4重楼总皂苷体外抗菌活性结果
Figure BDA0003317650790000112
注：(“+”代表有细菌生长，“-”代表无细菌生长)
表5重楼总皂苷MIC
Figure BDA0003317650790000113
实验结果显示，所提取的重楼总皂苷能抑制各菌株的活性。目前研究表明，重楼总皂苷中含有44个皂苷单体，因此重楼很多重药理活性。为了进一步研究重楼的抗菌活性，选择实施例10分离的重楼皂苷II，重楼皂苷VI和重楼皂苷VII，探究其抗菌活性。
2、最小抑菌浓度法测定重楼皂苷单体的抗菌活性
在重楼总皂苷抑菌活性实验中，重楼总皂苷对各个菌株均具有一定的抑制作用。在重楼众多单体皂苷成分中，选取实施例10分离的重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ为受试药物，以大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞菌174为受试菌株，考察这三个单体皂苷的抗菌活性。受试菌株对应阳性药及浓度见表3。
(1)重楼皂苷II的体外抗菌活性试验结果
重楼皂苷II对多重耐药金黄色葡萄球菌222的抑制作用如图3所示，重楼皂苷II体外抗菌活性结果如表6所示：
表6重楼皂苷II体外抗菌活性结果
Figure BDA0003317650790000121
注：(“+”代表有细菌生长，“-”代表无细菌生长)
(2)重楼皂苷VI的体外抗菌活性试验结果
重楼皂苷VI抗菌活性测试结果如图4所示，重楼皂苷VI体外抗菌活性结果如表7所示：
表7重楼皂苷VI体外抗菌活性结果
Figure BDA0003317650790000131
注：(“+”代表有细菌生长，“-”代表无细菌生长)
(3)重楼皂苷VII的体外抗菌活性试验
重楼皂苷VII抗菌活性测试结果如图5所示，重楼皂苷VII体外抗菌活性结果如表8所示：
表8重楼皂苷VII体外抗菌活性结果
Figure BDA0003317650790000132
注：(“+”代表有细菌生长，“-”代表无细菌生长)
上述实验结果显示，重楼皂苷II、重楼皂苷VI和重楼皂苷VII对实验菌株的MIC值均大于128μg/mL，未发挥较好的抑菌作用。对重楼总皂苷及其主要单体皂苷物质体外抗菌活性研究结果表明，以重楼总皂苷对大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞菌174均具有抑制活性，尤其是对多重耐药及金黄色葡萄球菌222和不耐药大肠杆菌，其最小抑菌浓度为128μg/mL，较小的MIC值彰显较优的成药性，所以重楼总皂苷的抑菌活性具有进一步深入研究的意义与价值。重楼单体皂苷(重楼皂苷II、重楼皂苷VI和重楼皂苷VII)均未显示较好的抑菌活性，分析其原因，可能与重楼总皂苷中多种皂苷成分协同发挥抑菌活性有关。
3、最小抑菌浓度法测定联合用药抗菌活性结果
重楼总皂苷和单体皂苷的抑菌实验结果显示，重楼总皂苷和单体皂苷均未见较优的耐药活性。因此，通过联合其他抑菌药物来检测重楼总皂苷的抑菌活性。本实验探究联合效果，通过实验所算的FIC去判断联合作用方式，FIC＝MICA/A+MICB/B。当FIC≤0.5时，两药的作用方式为协同，当1≥FIC＞0.5时，两药的作用方式为相加；当2≥FICI＞1时，两药的作用方式为无关；当FICI＞2时，两药的作用方式为拮抗，根FIC判断联合作用方式，为临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染带来新的用药选择。在之前数据的基础上，再做一个阳性药物的最低抑菌浓度研究，为联合抑菌指数做好基础。
(1)阳性药物最小抑菌浓度测定
用平板微量二倍稀释法测定阳性药的MIC，1-12孔分别设定浓度为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL和只加菌悬液的阴性对照。结果如图6(头孢曲松钠-大肠杆菌)、图7(盐酸左氧氟沙星-沙门氏菌)、图8(硫酸庆大霉素-多重耐药金黄色葡萄球菌222)和图9(硫酸庆大霉素-多重耐药铜绿假单胞菌174)所示。上述实验结果显示，头孢曲松钠对大肠杆菌的MIC为2μg/mL；盐酸左氧氟沙星沙门氏菌的MIC为4μg/mL；硫酸庆大霉素对多重耐药金葡222的MIC为128μg/mL；硫酸庆大霉素对多重耐药铜绿174的MIC为0.125μg/mL。
(2)联合实验操作方法
取无菌96孔平底微量培养板，用移液枪于A-H行的2-8列的每个孔加入50μL的DMSO(浓度不超过1％)水溶液，重楼总皂苷药液加入1-2列，进行横向的二倍稀释。另取一个无菌96孔板，在B-H行的1-8列的每个孔加入50μL的DMSO(浓度不超过1％)，阳性药加入A-B行，进行纵向的二倍稀释后，转移到第一个96孔板中。最后于A-H行的1-8列的孔中加入100μL菌悬液。
结果如图10、图11、图12和图13所示，结合之前重楼总皂苷体外抗菌活性数据和阳性药的数据，计算联合抑菌指数FIC，整理最后得结果：
表9重楼总皂苷与阳性药物联合结果
Figure BDA0003317650790000151
综上所述，通过本发明方法提取的重楼总皂苷，对大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞菌174均具有抑制活性，尤其是对多重耐药金黄色葡萄球菌222和大肠杆菌，其最小抑菌浓度为128μg/mL。为进一步明确其主要抑菌活性成分，还对重楼皂苷II、重楼皂苷VI和重楼皂苷VII对实验菌株的MIC值进行测定，均大于128μg/mL，未发挥较好的抑菌作用。分析其原因，可能与重楼总皂苷中多种皂苷成分协同发挥抑菌活性有关。重楼总皂苷与头孢曲松钠、盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液和硫酸庆大霉素的联合用药。实验结果显示，重楼总皂苷与头孢曲松钠联合用药，对抑制大肠杆菌具有协同作用；与盐酸左氧氟沙星联合用药，对抑制沙门氏菌具有相加作用，与庆大霉素联合用药，对抑制多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞菌174无协同效应。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取重楼药材或饮片，粉碎后过筛，浸入乙醇溶液中过夜，回流提取2～3次，每次1～3小时，过滤，合并提取液；
2)将提取液浓缩至1/4体积，离心，得到上清液A和沉淀A，将沉淀A加入乙醇溶液中，搅拌混匀后离心，得到上清液B和沉淀B，将沉淀B洗涤、干燥；
3)将上清液A和上清液B合并，将合并后的上清液与干树脂按照1:5-1:10的质量比混合后装层析柱，采用5～10倍体积的水进行洗脱，弃去洗脱液，再用4～8倍量的80％～90％乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，对乙醇洗脱液浓缩，然后与步骤2)处理后的沉淀B合并、干燥，制得重楼总皂苷。
2.根据权利要求1所述的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所用乙醇溶液的浓度为60％～90％，所用乙醇溶液的用量为重楼药材或饮片质量的8～24倍。
3.根据权利要求1所述的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所用乙醇溶液的浓度为60％～80％，所用乙醇溶液的用量为沉淀A质量的4～10倍。
4.根据权利要求1所述的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所用干树脂选择AB-8、LX-T5、D101或LX-100B。
5.根据权利要求1所述的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷的制备方法，其特征在于，以质量百分比计，重楼总皂苷中含有0.12％-0.14％的重楼皂苷Ⅱ、0.06％-0.11％的重楼皂苷Ⅵ以及0.11％-0.15％重楼皂苷Ⅶ。
6.根据权利要求1所述的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷的制备方法，其特征在于，步骤3)中，上柱流速为1-3BV/h；大孔树脂水洗脱液的用量为大孔树脂装柱体积的5-10倍量。
7.采用权利要求1～6中任意一项所述的制备方法制得的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷。
8.权利要求7所述的具有抗多药耐药菌活性的重楼总皂苷在制备抗菌药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物包括抗大肠杆菌、沙门氏菌、多重耐药金黄色葡萄球菌222和多重耐药铜绿假单胞174的药物。
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